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INTRODUCCIÓN
Diversas enfermedades, como el síndrome metabólico, las complicaciones micro y macrovasculares (1) y la hiperglucemia, son tan solo algunos de los padecimientos más frecuentes del siglo XXI y que más afectan a millones de individuos en todo el mundo (2). En este sentido, una de las alteraciones de la salud con mayor incidencia y prevalencia en la población mundial es la diabetes, enfermedad caracterizada por una hiperglucemia crónica debida a que el páncreas no produce la suficiente insulina, o a que la hormona producida no se metaboliza acorde a las necesidades del individuo (3). Desafortunadamente, este padecimiento puede llegar, en ocasiones, a generar necrosis en ciertas partes corporales, amputaciones e incluso la muerte. Entre los distintos tipos de las clasificaciones de la enfermedad está la diabetes mellitus de tipo 2 (DM2), que podría controlarse adecuadamente si se detecta en la fase temprana. En este sentido, una buena alimentación, el ejercicio físico moderado y los agentes hipoglucemiantes pueden ayudar al paciente a tener una mejor calidad de vida (4). Adicionalmente, cuando esto no es suficiente, se recurre a fármacos orales como la acarbosa, que podría mejorar los niveles de hemoglobina glicosilada en los pacientes con DM2. Este fármaco inhibe la actividad de la α-glucosidasa en las células epiteliales del borde superior del intestino delgado, retrasando la absorción de glucosa postprandial (5,6).
Otra de las formas que los pacientes con DM2 han empleado para disminuir su glucemia postprandial son remedios caseros y ancestrales que tienen como base, principalmente, algunos de los alimentos conocidos como funcionales. Entre las fuentes empleadas se encuentran aquellas de origen animal, como el suero de la leche, y aquellos otros de origen vegetal, como son algunas semillas. De estas últimas se han empleado macronutrimentos como son las proteínas o sus fracciones, que pueden actuar como inhibidores de la α-amilasa, la α-glucosidasa y la dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV), procedentes de leguminosas tales como Vigna unguiculata (7); como antioxidantes y antihipertensivos, procedentes de leguminosas como el frijol amargo (8); y como antihipertensivos y antioxidantes, procedentes de semillas como las de chía (9). Estas últimas presentan un buen balance de aminoácidos y una calidad proteínica similar a la de semillas como la lenteja, mayor que el de las leguminosas como el garbanzo y otras semillas oleaginosas (10), indicando que pueden ser una buena fuente para la obtención de péptidos con actividad biológica. Adicionalmente, las semillas, como las de chía, han demostrado que algunas de sus fracciones peptídicas presentan un efecto inhibitorio in vitro sobre el metabolismo de la glucosa al actuar sobre enzimas como la α-amilasa y la α-glucosidasa (11). A pesar de las recientes investigaciones, hasta ahora no han sido completamente estudiados los efectos de la chía para disminuir los niveles de glucosa postprandial a partir de distintas fracciones peptídicas; por lo que este trabajo tuvo como objetivo principal evaluar en ratas macho de la cepa Wistar el efecto hipoglucemiante de una fracción peptídica de chía (Salvia hispanica L.) derivada de la hidrólisis mediante pepsina y pancreatina.
MATERIALES Y MÉTODOS
OBTENCIÓN DE LA HARINA Y LA FRACCIÓN RICA EN PROTEÍNA DE LAS SEMILLAS DE CHÍA (SALVIA HISPANICA L.)
Las semillas de chía (Salvia hispanica, L.) de la marca Ecopan Organicâ se obtuvieron en un supermercado de la ciudad de Mérida, Yucatán, México. La muestra se trituró utilizando un procesador de alimentos marca Moulinex®, modelo AR9868. Las semillas trituradas fueron desgrasadas utilizando hexano como solvente a 55 °C en un sistema Friedrich (Travilab, Yucatán, México). Una vez desgrasada, la muestra se secó a 50 °C durante cinco horas hasta la completa evaporación del solvente. Posteriormente, se procedió a una molienda utilizando el mismo procesador. La harina obtenida se sometió a un fraccionamiento en seco utilizando un tamiz tipo Tyler con una malla 100 en un sistema de agitación y tamizado tipo Ro-Tap® (Laval Lab Inc, Quebec, Canadá) de acuerdo con la metodología reportada por Vázquez-Ovando (12). Se obtuvieron dos fracciones, una rica en fibra (partículas > 140 mm) (FRF) y una rica en proteína (partículas < 140 mm) (FRP), de la cual fue obtenida la fracción peptídica a analizar (11).
HIDÓLISIS ENZIMÁTICA Y ULTRAFILTRACIÓN
La fracción rica en proteína fue hidrolizada mediante un sistema enzimático secuencial según una modificación de la metodología reportada por Sosa-Crespo y cols. (11). El proceso consistió en una primera digestión con la enzima pepsina (pH 2) seguida de una segunda digestión con pancreatina (pH 7.5) durante 45 min a 37 °C para cada enzima; la hidrólisis fue detenida por calentamiento a 80 °C durante 20 min. El hidrolizado se dejó enfriar y posteriormente se centrifugó a 10.947 x g durante 20 min a una temperatura de 5 °C, obteniéndose una porción soluble que fue fraccionada mediante un equipo provisto de una celda de ultrafiltración de alto rendimiento (Modelo 2000, Millipore). Se utilizó una membrana de corte > 10 kDa para hacer pasar la muestra con la ayuda de presión positiva basada en N2 y agitación constante. La fracción retenida se consideró la > 10 kDa y la permeada se consideró de 5-10 kDa. Se utilizó la fracción mayor para realizar el estudio con ratas inducidas con aloxano. La muestra ultrafiltrada se secó en una liofilizadora (LABCONCO®, FreeZone, 4.5, EUA).
ANIMALES EXPERIMENTALES
Para la evaluación del efecto hipoglucemiante se emplearon 25 ratas macho Wistar (200-250 g) de 10 semanas de edad. Todos los experimentos se realizaron siguiendo la NOM-062-ZOO-1999 (13), referente a las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio. De igual manera, el estudio se llevó a cabo con la aprobación del comité de ética de la Comisión para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CCUAL) de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Morelos, México, de cuyo bioterio se obtuvieron las ratas para el ensayo. Los modelos animales se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio en un cuarto con aire acondicionado a 25 ± 3 °C de temperatura y a un 50-65 % de humedad relativa. De igual manera, se consideró un fotoperiodo, es decir, un ciclo de 12 h de día y 12 h de noche. Los animales se alimentaron con el alimento Lab Diet 5001 Roedor® y tuvieron acceso libre al agua.
ADMINISTRACIÓN DE ALOXANO
Las ratas se dejaron ayunar durante 16 horas antes de la administración de 150 mg/kg de alloxano monohidratado disuelto en una solución salina. El fármaco se administró por vía intraperitoneal con una jeringa para insulina. La presencia de niveles elevados de glucosa se confirmó a las 72 horas de la administración. Las ratas que presentaron más de 200 mg/dl de glucosa sanguínea en ayunas fueron las utilizadas en el estudio. Diez días después de la confirmación de la hiperglucemia, a las ratas diabetizadas se les realizó una curva de tolerancia a la sacarosa (CTS).
EVALUACIÓN DE LA TOLERANCIA A LA SACAROSA EN UN MODELO INDUCIDO CON ALOXANO
La noche antes de la realización de la CTS, los animales se pusieron en ayuno de 16 horas. La fracción peptídica (> 10 kDa) de chía se disolvió en agua purificada y se administró por vía intragástrica a razón de 50 mg/kg (grupo 2) y 100 mg/kg (grupo 3), respectivamente. Posteriormente se utilizó acarbosa (10 mg/kg) como fármaco de referencia (grupo 4). El grupo de control de las ratas diabetizadas (sin tratamiento, grupo 1), así como las ratas normoglucémicas (grupo 5), recibieron agua purificada en el mismo volumen (0,5 ml/100 g) mediante la misma vía. Diez minutos después de la administración de las muestras evaluadas se proporcionó oralmente a cada rata una dosis de 0,5 g/ml de sacarosa en solución. Posteriormente se extrajeron muestras sanguíneas de la cola de cada rata a los 0 (antes de la administración oral), 30, 60, 90 y 120 minutos. La concentración de glucosa sanguínea se estimó por un método enzimático de glucosa-oxidasa, utilizando un glucómetro comercial (Accu-Chek Active, Roche®) que se calibró y estandarizó antes y durante las mediciones de glucosa. El porcentaje de variación de la glucemia para cada grupo se calculó en relación al nivel inicial (0 h) usando la siguiente fórmula (14):
% de variación de la glucemia = (Gx-Go) × 10 / Go
Donde: Go = valor de glucemia inicial sin suministro de sacarosa; Gx = valor de glucemia a los 0, 30, 60, 90 y 120 min.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados fueron analizados mediante la estadística descriptiva con medidas de tendencia central y de dispersión. Para evaluar los efectos hipoglucemiantes de la fracción peptídica se utilizaron como variable independiente el tiempo postprandial y como variable de respuesta el contenido de glucosa sanguínea. Se utilizó un análisis de la varianza (ANOVA) de una vía con un nivel de confianza del 95 %. Se empleó una prueba de rangos múltiples de Duncan para identificar las diferencias significativas. Los resultados se calcularon de acuerdo con lo establecido por Montgomery (2004) (15) y se procesaron con el programa estadístico Statgraphics Plus 5.1.
RESULTADOS
Se obtuvieron 9,0 kg de harina desgrasada de chía procesada, presentando un rendimiento de 101,5 g/kg de la FRP, que presentó un 6,69 % de humedad y un 49,51 % b.s. de proteína. El contenido proteínico de la fracción ultrafiltrada (> 10 kDa) a partir del hidrolizado de pepsina-pancreatina fue del 91 % b.s., indicando una elevada presencia de este componente. Se tomó la decisión de estudiar específicamente esta fracción debido a que en estudios previos se reporta una alta capacidad inhibitoria de las enzimas α-amilasa, con un 85,6 %, y α-glucosidasa, con un 78,0 % (11).
EFECTO HIPOGLUCEMIANTE DE UNA FRACCIÓN PEPTÍDICA DE CHÍA EN UN MODELO ANIMAL INDUCIDO CON ALOXANO
La CTS en los modelos animales inducidos con aloxano demostró que a los 30 min del periodo postprandial se observaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) del tratamiento con acarbosa con respecto al blanco (Tabla I). No se encontraron diferencias significativas de contenido glucosídico entre el blanco y las dosis evaluadas de la fracción peptídica de chía (p > 0,05). Sin embargo, a los 120 min, las dos concentraciones estudiadas y el fármaco de referencia presentaron un mayor contenido de glucosa en sangre en comparación con el blanco.
Tabla I. Curva de tolerancia a la sacarosa en ratas diabetizadas administradas con la fracción peptídica > 10 kDa
*Indica una diferencia signifi cativa (p < 0.05) con respecto al blanco.
Adicionalmente, a pesar de que la dosis de 50 mg/kg presentó una tendencia a disminuir la glucosa en la primera hora postprandial, la CTS demostró un comportamiento interesante, debido a que no se encontró ninguna diferencia significativa (p > 0,05) entre el blanco y las dosis de chía analizadas a los 30 min postprandiales.
VARIACIÓN DE LA GLUCOSA EN LAS RATAS INDUCIDAS CON ALOXANO
Los resultados demostraron que, a los 30 min de la ingesta, se encontraron diferencias significativas (p < 0,05) en el porcentaje de variación del blanco (220,55 %) con respecto a las dosis de 50 y 100 mg/kg de la fracción peptídica (Fig. 1); sin embargo, no existió diferencia entre ambas dosis mencionadas. Aunado a lo anterior, la variación de la glucosa fue disminuyendo a medida que fue transcurriendo el tiempo, de manera que a los 120 min postprandiales ya no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de variación entre las dosis, el blanco y la acarbosa, lo que denota que los animales experimentales habían regresado a su estado basal.
ACTIVIDAD GLUCOSÍDICA DE LA FRACCIÓN PEPTÍDICA > 10 kDa DE CHÍA EN LAS RATAS DIABETIZADAS, COMPARADAS CON LAS RATAS NORMOGLUCÉMICAS
Los resultados demostraron que no se produjeron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre las dos concentraciones experimentadas en las ratas diabetizadas con respecto a las ratas normoglucémicas; sin embargo, la menor concentración (50 mg/kg) de la fracción peptídica de > 10 kDa de chía presentó una mayor tendencia hacia el efecto hipoglucemiante en las ratas diabetizadas con aloxano que la concentración de 100 mg/kg (Fig. 2).
Figura 2. Contenido de glucosa en las ratas diabetizadas, en comparación con las ratas normoglucémicas, suministradas con diferentes concentraciones de la fracción peptídica > 10 kDa y comparadas con un blanco y un testigo. *Indica una diferencia significativa (p < 0.05) con respecto al blanco.
La tendencia presentada por la fracción de 50 mg/kg demostró un incremento glucosídico en los primeros 30 min, que fue disminuyendo levemente durante los siguientes 90 min; lo anterior indica un mantenimiento del contenido glucosídico, evitando que se presenten picos de variación del monosacárido en sangre. En contraste, la fracción de 100 mg/kg del péptido demostró un incremento de la glucosa por arriba de los 300 mg/dl a los 60 min del periodo postprandial, obteniéndose prácticamente los mismos valores después de las 2 horas posteriores a la ingesta, valor que debería haber regresado a su estado basal.
Al comparar el comportamiento de la CTS en las ratas tratadas con acarbosa, se pudo observar que, aunque estuvieran diabetizadas, el fármaco desarrolló un efecto de retraso de la absorción del monosacárido. Finalmente, es importante mencionar que se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre los niveles de glucosa de las ratas normoglucémicas y los de las ratas que recibieron las diferentes concentraciones de la fracción peptídica, siendo mayores en toda la curva en aquellas suministradas con las fracciones de chía.
DISCUSIÓN
Los resultados del estudio demostraron que no existe ninguna diferencia significativa (p < 0,05) entre las concentraciones de 50 y 100 mg/kg; sin embargo, por cuestiones prácticas se sugiere utilizar la menor concentración. Adicionalmente, se ha demostrado que el efecto que presentan las fracciones peptídicas se debe a una inhibición enzimática de tipo competitivo, considerando que el sustrato, en este caso las fracciones peptídicas de chía, ocupan el sitio activo de las enzimas. Debido a lo anterior, con una dosis mayor (100 mg/kg), posiblemente se presente una saturación de la enzima por el sustrato, por lo cual no se observaron diferencias estadísticas en el efecto inhibitorio.
Debido a que las fracciones de chía de 50 mg/kg no retrasaron ni disminuyeron la absorción de la glucosa, la actividad de estos péptidos sugiere un efecto positivo en las personas que genéticamente estén predispuestas a padecer diabetes, o en las que estén en una etapa inicial de la enfermedad, probablemente demostrando un efecto antihiperglucemiante (11), pero no en aquellas que ya presenten etapas avanzadas del padecimiento.
En este sentido, las fracciones de chía podrían ayudar en el tratamiento de la DM2, ingiriéndolas como coadyuvante en conjunto con los fármacos orales indicados por un médico.
El comportamiento del péptido de mayor concentración respecto al incremento glucosídico en la primera hora posterior a la ingesta podría indicar una inestabilidad de la glucosa sanguínea, lo que puede provocar un descontrol de la glucemia postprandial. Por otra parte, considerando la ligera tendencia a la disminución del contenido glucosídico en los diferentes tiempos para la menor concentración analizada, se podría sugerir que el monosacárido se mantiene en sangre durante un tiempo mayor. Esto resultó ser opuesto a lo presentado por las ratas que solo recibieron agua purificada (blanco), proceso en el cual, después de dos horas de periodo postprandial, regresaron a su estado basal. El comportamiento se asemeja al presentado por la acarbosa, la cual mantiene el contenido de glucosa en la sangre ligeramente elevado pero constante debido a un retraso en su absorción (16), evitando así variaciones importantes en los picos de glucosa plasmática.
El hecho de no observarse diferencias en el porcentaje de variación de la glucosa probablemente demostró que, independientemente del contenido de la muestra administrada, no existe efecto hipoglucemiante. Debido a que el fármaco acarbosa produjo un mayor retraso en la absorción de la glucosa, el porcentaje de variación fue menor.
Por otra parte, un estudio in vitro en el que se utilizaron diversas fracciones peptídicas a partir de semillas de chía demostró que fracciones como la > 10 kDa y la de 5-10 kDa habían presentado un efecto inhibitorio sobre la enzima α-amilasa y que la fracción de 1-3 kDa había presentado actividad sobre la enzima α-glucosidasa (11). El comportamiento antihiperglucemiante presentado fue similar al de un inhibidor competitivo, por lo que podría esperarse algún efecto in vivo. Sin embargo, en el estudio actual no hubo efecto hipoglucemiante al analizar la fracción peptídica > 10 kDa en ratas diabetizadas. Estos resultados sugieren que los aminoácidos o cadenas aminoacídicas presentes en la fracción peptídica analizada no actúan como secretagogos de insulina como las sulfonilureas o las meglitinidas (17), ni como inhibidores de la enzima DPP-IV (18), como lo hacen la mayoría de los hipoglucemiantes orales utilizados en el tratamiento de la DM2. Lo anterior sugiere que la chía podría tener un efecto preventivo mas no curativo.
Un estudio realizado por Ananthi y cols. (19), en el que se analizaron hojas secas de Eclipta alba en ratas macho Wistar diabetizadas con aloxano, demostró un potente efecto hipoglucemiante. En esta investigación, los animales pertenecientes a los grupos experimentados estuvieron consumiendo dosis de 2 g/kg y 4 g/kg, respectivamente, de la muestra analizada durante 60 días. Opuesto a lo anterior, las dosis experimentadas (50 y 100 mg/kg) en el estudio con chía fueron mucho menores y con una sola ingesta de la fracción peptídica. Esto sugiere que si se incrementaran las dosis hasta igualar las del estudio con Eclipta alba y/o se aumentara la frecuencia de consumo, probablemente se podría encontrar un efecto hipoglucemiante, como ocurrió con diversos estudios en los que el consumo de la semilla fue mayor y durante un tiempo más prolongado (1,20,21). Por lo que, a pesar de no haber presentado efecto hipoglucemiante en las condiciones experimentadas, las fracciones peptídicas de chía, al igual que en otras investigaciones, podrían ser una plataforma versátil y atractiva para desarrollar una nueva clase de inhibidores de enzimas como las α-amilasas y/o α-glucosidasas (22).
La mayor tendencia hipoglucemiante de la fracción de 50 mg/kg del experimento con ratas diabetizadas frente a ratas normoglucémicas podría deberse a que el sustrato (péptido) ha desarrollado su efecto inhibitorio, por lo que, a pesar de que se incremente la concentración de péptidos, las disacaridasas posiblemente se saturan, evitando que más sitios activos sean inhibidos. Cabe destacar que, cuando una enzima está saturada, todas las moléculas del sitio activo disponibles están catalizando un sustrato o, en este caso, un inhibidor. Cualquier molécula adicional de sustrato o inhibidor podrá incorporarse al sitio activo de la enzima hasta que este se haya liberado, por lo que la velocidad de reacción (cantidad de producto generado por unidad de tiempo) está limitada por la concentración de enzima. La saturación también depende de la coenzima, es decir, de una enzima funcional que frecuentemente es una combinación esencial de proteína y coenzima (23).
Debido al comportamiento presentado, los resultados sugieren que, para este estudio agudo de una sola ingesta con las concentraciones de 50 y 100 mg/kg, las fracciones peptídicas de chía no presentaron efecto hipoglucemiante; sin embargo, esta investigación abre una gama de posibilidades para el empleo en otros estudios de fracciones peptídicas de pseudocereales como la chía, probablemente con un incremento de las dosis y/o la frecuencia de consumo de los péptidos. Todo ello con la finalidad de encontrar alimentos funcionales que sean de utilidad para las personas con predisposición a la DM2 o en etapas incipientes de esta enfermedad.
CONCLUSIÓN
La fracción peptídica de las semillas de chía (Salvia hispanica) que presentó la mayor tendencia hacia la disminución de la glucosa fue la de 50 mg/kg; sin embargo, no hubo diferencias significativas con la dosis mayor (100 mg/kg) ni con el blanco. El comportamiento de las ratas normoglucémicas fue opuesto completamente al de las diabetizadas con la fracción peptídica suministrada, demostrando en este último caso niveles elevados de glucosa sanguínea. De igual manera, la CTS de las ratas diabetizadas fue opuesta a la curva presentada por las ratas suministradas con acarbosa, de manera que no existe relación entre el mecanismo de acción del fármaco de referencia y el efecto analizado; en este sentido, a pesar de que estudios anteriores han demostrado un probable efecto inhibitorio de tipo competitivo, así como una tendencia antihiperglucemiante, para esta investigación, las fracciones peptídicas de >10 kDa de chía no presentaron efectos hipoglucemiantes a las concentraciones proporcionadas en una única dosis.
