Expresión del gen esp (enterococcus surface protein) de enterococcus faecalis en un modelo in vitro de dientes extraídos

Gene expression esp (enterococcus surface protein) of enterococcus faecalis in an in vitro model of extracted teeth

 

 

Covo Morales E.*, Díaz Caballero A.** y Simancas Pallares M.***

* Odontólogo. Universidad de Javeriana. Especialista en Endodoncia. Universidad Javeriana. Magíster en Microbiología. Universidad de Cartagena. Profesor titular. Universidad de Cartagena.
** Odontólogo Universidad de Cartagena. Especialista en Periodoncia Universidad Javeriana. Magíster en Educación Universidad del Norte. Doctor en Ciencias Biomédicas Universidad de Cartagena. Profesor titular Universidad de Cartagena. Grupo GITOUC.
*** Odontólogo Universidad de Cartagena. Magíster en Epidemiología Universidad Nacional. Profesor Universidad de Cartagena.

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Objetivo: Determinar la presencia y expresión del gen esp en cepas clínicas de Enterococcus faecalis a partir de un modelo in vitro de dientes extraídos.
Métodos: Se diseñó un sistema in vitro para evaluar la formación del biofilm mediante microscopía de fluorescencia y la expresión del gen esp. El sistema estuvo constituido por un diente humano previamente extraído, cortado y preparado que proporcionó, mediante su conducto radicular, una superficie adecuada para la formación del biofilm por parte de E. faecalis. El sistema dispuso de una cámara anaerobia que permitió el crecimiento de la bacteria en el caldo de cultivo y evitó su contaminación con otros microorganismos. Esta cámara estuvo constituida por un tubo de micro centrifuga estéril, cortado y unido por el extremo inferior al extremo apical del diente seccionado.
Resultados: Los resultados que se obtuvieron tanto por microscopia de fluorescencia como por RT-PCR permitieron cuantificar el nivel de expresión del gen esp en las bacterias durante su crecimiento y formando el biofilm en la superficie de los conductos radiculares. Todas las cepas evaluadas presentan el gen esp. Sin embargo, el biofilm de la cepa CC02 expresó el gen esp cuatro veces más en comparación al gen esp de la cepa de referencia.
Conclusión: La expresión del gen esp podría estar asociada con la formación de biofilm en E. faecalis y la adherencia a superficies abióticas. Podría convertirse en una diana terapéutica prometedora en los programas de control de infecciones persistentes por Enterococcus spp. asociados a la presencia de biofilm.

Palabras clave: Genes, biofilm, Enterococcus faecalis, endodoncia.

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SUMMARY

Objective: To determine the presence and expression of Enterococcus faecalis Esp gene in several strains from an in vitro model on extracted teeth.
Methods: An in vitro system was designed to evaluate the biofilm formation through fluorescence microscopy and gene expression that could be associated to biofilm formation. The system consisted of a previously extracted human tooth that was cut and prepared to provide by means of its root canal, an adequate surface for biofilm formation on behalf of Enterococcus faecalis. The system disposed an anaerobe chamber that allowed the growth of bacteria in broth culture and avoided contamination with other microorganisms. This chamber consisted of a sterile micro centrifuge tube, which was cut and united by its inferior end to the apical end of the sectioned tooth.
Results: The results obtained with fluorescence microscopy and RT-PCR allowed the quantification of the Esp gene levels of expression in bacteria growing and forming biofilm in root canal surfaces.
Conclusion: The expression of Esp gene is associated with biofilm formation in E. faecalis and in the adherence to abiotic surfaces. It could be a promising therapeutic target in control programs for the eradication of persistent infections associated with the presence of E faecalis in biofilm.

Key words: Genes, biofilms, enterococcus faecalis, endodontics.

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Introducción

El biofilm es una estructura compleja de asociación de microorganismos similares y de diferentes especies bacterianas, que se organizan en forma de un supraorganismo con características superiores a las que presentan las bacterias individualmente (1).

El principio de la formación del biofilm se establece como parte de los procesos que se pueden presentar en el quórum sensing (QS). Las bacterias mantienen una comunicación permanente entre ellas, dentro de los diferentes ambientes o microambientes donde permanecen y conviven. Los mecanismos de comunicación, le permiten reconocer cuando se alcanza el umbral o nivel de presencia, para desarrollar nuevas funciones, especialmente un comportamiento social, simbiótico y de permanente reconocimiento, útil para las tareas que adquieren en el mecanismo de QS (2). Este biofilm puede establecerse en cualquier superficie orgánica o inorgánica, que es la superficie del sustrato donde los microorganismos planctónicos prevalecen en una solución a base de agua. En las superficies dentales, la estructura del biofilm se establece durante la fijación de las bacterias a los dientes para formar la placa dental. Aquí, los organismos planctónicos constituyen la fuente principal de la organización de este biofilm específico (3). Los microorganismos en el biofilm asumen un potencial patógeno más fuerte que los de un estado planctónico. A partir de esto, la formación del biofilm tiene gran importancia clínica, no sólo por los mecanismos de defensa del huésped, sino también por los esfuerzos terapéuticos, incluidos los tratamientos químicos, mecánicos y medidas antimicrobianas, que son más difíciles de tratar en forma de biofilm (3).

Las infecciones endodónticas, el concepto de biofilm toma gran importancia en el manejo de infecciones pulpares con compromiso de los tejidos periapicales. Estas agregaciones bacterianas son la causa principal de la resistencia de la periodontitis apical. Aunque no se describe con detalle, se han observado las condensaciones bacterianas en las paredes de los canales infectados, lo que sugiere que los mecanismos de formación de biofilm también pueden existir dentro del espacio del conducto radicular (4). El Enterococcus faecalis es el principal microorganismo que se asocia a los fracasos de tratamientos endodónticos. Es por ello que es de gran importancia el conocimiento de su mecanismo de patogenicidad y las expresiones genéticas de los factores que favorecen la formación del biofilm (5).

 

Materiales y métodos

Tipo de estudio

Se realizó un estudio de tipo observacional de corte transversal en el que se midió la expresión del gen esp por varias cepas clínicas de E. faecalis en un modelo In Vitro de dientes extraídos.

Muestra

La muestra de estudio estuvo conformada por 3 cepas clínicas de Enterococcus faecalis aisladas a partir de pacientes con necrosis pulpar, las cuales fueron aisladas y almacenadas en el banco de muestras del grupo de investigación GITOUC. Además, se utilizó una cepa referencia de E. faecalis (ATCC 29212) adquirida del American type culture.

Recolección de datos

Identificación de cepas clínicas

Las cepas clínicas aisladas de conductos radiculares de pacientes con lesión apical fueron cultivadas en agar nutritivo durante 24 horas a 37^o C en condiciones anaeróbicas. Al terminar el período de incubación, se depositó una muestra de cada cepa sobre una placa portaobjetos y se realizó una tinción de gram. Las placas fueron visualizadas en microscopio óptico con objetivo de 100× y aceite de inmersión, lo que permitió identificar cocos gram positivos agrupados en parejas o en cadenas cortas. A partir del mismo cultivo bacteriano se realizó una prueba de catalasa, la cual arrojó resultado negativo para las muestras de estudio. Para confirmar la identidad de las cepas clínicas se realizó la extracción del ADN de cada cepa y se realizó una PCR con primeros específicos para género Enterococcus y primer específicos para E. faecalis (Tabla 1) utilizando el kit de PCR GoTaq^® Green Master Mix (Promega).

 

 

Cultivos bacterianos

Las bacterias fueron cultivadas en medio TSB (Caldo Triptona de Soja, Oxoid) durante 24 horas y la concentración bacteriana en términos de UFC/ml fue determinada usando un espectrofotómetro (Termo Scientific) ajustando la longitud de onda a 620 nm. La concentración bacteriana fue ajustada a 1,5×10⁸ UFC/mL con solución salina.

Preparación de los dientes

A 11 dientes anteriores unirradiculares humanos recién extraídos y con cemento radicular intacto, se les realizaron radiografías periapicales; posteriormente, la apertura cameral y localización del canal con fresa redonda # 2 microdont con pieza de alta velocidad (NSK - Hoffman Estates, IL - USA) fueron preparados e instrumentados con limas tipo K Flexofile (Dentsply Maillefer, Tulsa - Oklahoma, USA) de 31 mm desde lima 15 hasta lima 50 con irrigación profusa entre lima y lima con hipoclorito de sodio al 5,25% (Eufar Laboratories. Bogotá, Colombia) para extraer el tejido, eliminar detritus y desinfectar el conducto. Para ampliar los conductos en los dos tercios cervicales se utilizaron fresas Gates glidden # 1 y 2 (Kerr Corp., West Collins, Orange - CA, USA), y finalmente, retroceso hasta la lima 80. Una vez preparados, cada diente fue cortado transversalmente en su extremo coronal por medio de un disco diamantado, midiendo 14 mm desde apical a lo largo de la raíz. Se realizaron radiografías utilizando radiografía periapical convencional con películas tipo E (Eastmann Kodak Company, NY, USA) de las cavidades de acceso estándar y un tercio del conducto radicular; se procede a su esterilización en autoclave por 30 minutos. Posteriormente cada diente fue adherido al extremo cortado de un tubo eppendorf estéril de 1,5 mL, sellado con resina epóxica y luego barnizado desde la raíz hasta la parte inferior del tubo con esmalte. El sistema se dejó secar durante 24 horas.

Inoculación del sistema

El proceso de inoculación de los dientes se realizó en una cabina de flujo laminar tipo 2. Con la ayuda de una micropipeta estéril de 20 µL, fueron depositados aproximadamente 20 µL de la suspensión bacteriana en el conducto radicular de cada diente; el tubo fue tapado e incubado a 37^o C durante 15 días reemplazando la suspensión bacteriana cada 48 horas. El esquema de inoculación de los dientes fue el siguiente:

- Tres dientes fueron inoculados con la cepa de referencia E. faecalis (ATCC 29212) de los cuales uno fue utilizado para el ensayo de fluorescencia y dos para la extracción de ADN; 3 dientes fueron inoculados con la cepa clínica CC1, utilizados de igual forma que el anterior.

- Dos dientes fueron inoculados con la cepa clínica CC2, ambos utilizados para el ensayo de expresión génica.

- Dos dientes, con la cepa clínica CC3, utilizados de igual forma, y

- Un diente fue utilizado como control negativo utilizado en el ensayo de fluorescencia.

Análisis por microscopia de fluorescencia

Transcurrido el tiempo de incubación, los dientes destinados para el ensayo de fluorescencia fueron lavados con solución salina dos veces y luego removidos del tubo, cada diente fue cortado longitudinalmente con pieza de baja velocidad (NSK - Hoffman Estates, IL - USA) con la ayuda de un disco diamantado como se indica el corte.

Tinción de biofilm

Para evidenciar la formación de biofilm, las bacterias adheridas a la pared del conducto radicular fueron teñidas con el kit LIVE/DEAD^® BacLight^® Bacterial Viability; para esto se preparó 1 mL del colorante en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mL. Cada diente fue sumergido en la solución de fluorescencia durante 15 minutos. Luego, cada sección fue lavada con solución salina, montada en una placa portaobjetos y visualizada en un microscopio de fluorescencia (Leica Microsystems GmbH - Wetzlar - Germany) con objetivos de 5×, 10× y 20×, utilizando el filtro I3 (450-490 nm) el cual excita el colorante SYTO 9 utilizado en la tinción.

Análisis de expresión génica

El RNA mensajero de las bacterias formando biofilm y creciendo en caldo fue extraído usando el kit QIAzol Lysis Reagent (Qiagen - Venlo, Limburg - Netherlands). Para las bacterias que crecieron sobre las paredes del conducto radicular se utilizaron 75 µL del reactivo, los cuales fueron depositados en el conducto de cada diente y dejados 30 segundos a temperatura ambiente antes de ser retirados por inversión sobre un nuevo tubo vacío. Para las bacterias que crecieron en caldo se utilizaron 150 µL del QIAzol, los cuales se depositaron sobre el botón de bacterias obtenido por centrifugación. La calidad y concentración del RNA mensajero extraído a partir de cada diente fue determinada mediante un espectrofotómetro NanoDrop (ThermoScientific - Waltham, MA, USA) a 260 y 280 nanómetros.

Transcripción Reversa y Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR)

La transcripción reversa y PCR fue llevada a cabo en un solo paso mediante el Kit AccesQuick^TM RT-PCR System (Promega - Madison, WI - USA). Se utilizó 1 µg de RNA para cada reacción y primeros para los genes 16S rRNA (housekeeping) y esp (secuencia reportada por Toledo-Arana) (6). Los tubos fueron incubados a 45^o C durante 45 minutos para llevar a cabo la transcripción reversa e inmediatamente sometidos a 95^o C por 5 minutos y a 40 ciclos de 94^o C por 1 minuto, 50^o C por 1 minuto y 72^o C por 1 minuto, más una etapa final de extensión a 72^o C por 5 minutos, en un termociclador (Perkin Elmer - Waltham, MA - USA). Los productos fueron corridos en un gel de agarosa al 1,5% durante 90 minutos a 100 voltios y 300 miliamperios. El gel fue teñido con Bromuro de etidio (0,5 µg/ml) y visualizado en un transiluminador con luz ultravioleta.

Recolección y procesamiento de la información

Para el análisis de los niveles de expresión, la intensidad de cada banda fue convertida en valores de densidad óptica (O.D) mediante el software Image J. Con los valores de O.D de cada muestra se construyó una gráfica de barras, con el programa Microsoft Office Excel, en la cual se muestra los niveles de expresión de cada muestra.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis univariado, para variables cualitativas y proporciones. Para variables cuantitativas se obtuvieron media y desviación estándar. Por otro lado, en el análisis bivariado se utilizó test exacto de Fisher para poner a prueba la asociación entre la presencia del gen y las cepas. El análisis estadístico se realizó en el paquete IBM SPSS Statistics v.20 para Macintosh (IBM Corp. Released 2011. IBM SPSS Statistics for Macintosh, Version 20.0. Armonk, NY: IBM Corp).

 

Resultados

Identificación molecular de E. faecalis

PCR Enterococcus spp y Enterococcus faecalis

Se realizó una PCR específica del género Enterococcus, la cual dio positiva para todas las cepas analizadas (Fig. 1). Adicionalmente, el 100% de las cepas correspondieron a Enterococcus faecalis.

 

 

PCR para detectar la presencia de genes esp en las cepas de E. faecalis

Los resultados de la presencia del gen de virulencia esp en las diferentes cepas se describen en la Tabla 2. De forma global, esp estuvo presente en el 37,5% de las muestras analizadas. Así mismo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la proporción de aparición del gen esp (Tabla 3).

 

 

 

Análisis por microscopía de fluorescencia

Los dientes fueron teñidos con el kit de fluorescencia LIVE/DEAD^® BacLight^® Bacterial Viability y observados al microscopio de fluorescencia con objetivos 5×, 10×, 20×. En los montajes hechos a partir de los dientes inoculados con la cepa de referencia ATCC 29212, se observó la presencia de una multitud de aglomeraciones de bacterias firmemente adheridas a la pared del conducto radicular. Estas agrupaciones de bacterias constituyen las microcolonias formadas por E. faecalis durante la formación de biofilm y se pueden evidenciar como cúmulos de color verde ampliamente distribuidos sobre la superficie del conducto (Fig. 2). Por otro lado, en los montajes realizados a partir del diente inoculado con la cepa clínica CC01, no se observó la presencia de agregados de color verde (Fig. 3), lo que significa que esta cepa no fue capaz de formar biofilm.

 

 

 

Análisis de expresión del gen esp mediante RT-PCR

La RT-PCR realizada a partir del ARN extraído de los dientes inoculados con las cepas de E. faecalis, permitió cuantificar el nivel de expresión de los genes ARNr 16S y esp en las bacterias durante su crecimiento en caldo y formando biofilm en la superficie de los conductos radiculares. La expresión del gen ARN 16S, usado como gen de referencia en este ensayo, no varió significativamente en las bacterias que crecen en caldo comparadas con las que formaban biofilm. Así mismo, la expresión del gen esp en la cepa de referencia ATCC 29212 que creció en suspensión (E.F-S) fue significativamente baja comparado con la expresión del gen de referencia ARNr 16S (Fig. 4).

 

 

Por otro lado, la expresión del gen esp fue mucho mayor en la cepa CC02 que formaba biofilm (CC02-B) comparado con la misma cepa que creció en suspensión (CC02-S) (Fig. 5). Como se puede observar (Fig. 6 y Tabla 4), el pico de densidad óptica más alto, corresponde a la mayor expresión del gen esp en la cepa CC02 cuando creció formando biofilm, mientras que para el gen ARNr 16S no hubo diferencia en la altura de los picos correspondientes a las cepas y sus respectivos tratamientos.

 

 

 

 

Discusión

El biofilm se define como comunidades bacterianas adheridas a una superficie y encerradas en una matriz extracelular que favorece su resistencia a agentes externos. Recientemente el término de biofilm bacteriano, ha ganado importancia clínica debido a que propicia la resistencia a los agentes antibacterianos más utilizados en odontología (7). El primer paso en la formación de biofilm es la unión de bacterias a una superficie ya sea inerte, como ocurre en los dispositivos médicos implantados dentro del organismo, o en superficies propias del huésped como es el caso de válvulas cardíacas, pulmón e incluso sobre el esmalte dentario. Los pasos subsiguientes para el desarrollo del biofilm incluyen la producción de la matriz extracelular y el crecimiento y maduración de la misma (8).

El género Enterococcus se asocia frecuentemente con la formación de biofilm en diversos dispositivos médicos permanentes tales como: válvulas protésicas del corazón, dispositivos intrauterinos, prótesis de cadera artificiales, catéteres urinarios y venosos centrales (7). Las dos especies más comunes son: Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium. Durante el proceso de formación del biofilm de esta especie bacteriana se han reportado diversas dianas moleculares asociados tales como los genes fsr, bpd, esp y gel e presentes tanto en E. faecalis y E. faecium (9-13).

La formación de biofilm es un proceso de desarrollo complejo de fijación e inmovilización sobre una superficie: interacción célula a célula, formación de microcolonias, formación de biofilm confluente y el desarrollo de una estructura tridimensional del biofilm (14). Sin embargo, la red de regulación, así como el papel preciso que cada uno de los factores identificados, no se ha esclarecido totalmente en el proceso de formación del biofilm y los resultados parecen ser contradictorios. Para tratar de recrear este proceso complejo, en el presente estudio se diseñó un sistema in vitro que permitió evaluar la formación de biofilm de E. faecalis mediante microscopia de fluorescencia y la evaluación de una diana molecular de gran discusión actual, el gen esp, el cual se ha reportado asociado al proceso de formación de biofilm de E. faecalis (15). El modelo in vitro de formación de biofilm de E. faecalis, consistió en dientes humanos extraídos, con instrumentación endodóntica y acondicionado a un sistema de anaerobiosis artificial, todo esto con la finalidad de recrear las condiciones de un conducto radicular posterior al tratamiento endodóntico, con fracaso del mismo. La regulación de la expresión génica bacteriana en respuesta a la densidad de la población de células, quórum sensing, se logra a través de la producción de moléculas de señalización extracelular llamada autoinductores (Miller y Bassler, 2001). La producción de biofilm está regulada por sistemas de detección de quórum sensing en varios patógenos bacterianos. El biofilm es notoriamente difícil de erradicar y es una fuente de muchas infecciones crónicas (16).

Un biofilm maduro puede tolerar antibióticos a concentraciones de 10-1000 veces más que las requeridas para matar a las bacterias planctónicas. Toledo-Arana y cols. informaron que la capacidad para formar biofilm es común entre los aislados clínicos de E. faecalis. La capacidad de formación de biofilm se limita a las cepas que albergan el gen esp, el cual promueve la unión primaria y la formación de biofilm por E faecalis en superficies abióticas (6). Los resultados observados en el presente estudio evidenciaron que las muestras clínicas expresaron esp en un 33,3% de las muestras. Sin embargo, Dworniczek et al y Mohamed et al encontraron que el gen esp no era necesario para la formación del biofilm (17). Otro estudio realizado por Kristich et al demostró la formación in vitro de biofilm por E. faecalis en ausencia del gen esp y la patogenicidad de la secuencia de codificación (12). Los resultados indican que la presencia del gen esp no es necesaria y suficiente para la producción de biofilm en Enterococcus. En una investigación realizada por Ramadhan y Hegedus demostraron que la presencia del gen esp no es necesaria ni suficiente para la producción de biofilm en los Enterococcus y que el suero humano puede ser un medio más sensible que caldo BHI para demostrar la formación de biofilm en los Enterococcus (18).

En el presente estudio, se demostró que tanto cepas wild type como de referencia, tienen el potencial de expresar el gen esp. Sin embargo, no todas expresan este factor de virulencia. La literatura demuestra resultados contradictorios respecto a la función del gen esp en biofilm en formación. Toledo-Arana y sus colegas informaron que el 93,5% de E. faecalis esp^+/+ aislados forman biofilm en una superficie abiótica y ninguno de los E. faecalis esp^-/- aislados producen biofilm. Sugieren que esp promueve la formación de biofilm, sin embargo, ciertos determinantes adicionales pueden contribuir a la formación de biofilm en E. faecalis (6). El esp se ha asociado con una mejora en la adherencia a las superficies abióticas y la formación de biofilm de E. faecalis, especialmente en la presencia de 0,5% (wt/vol) de glucosa (6,19). La expresión de esp promueve una fuerte interacción entre el sustrato y las bacterias, dando lugar a un mayor número de bacterias adheridas (20).

Mohamed et al en el 2004 realizaron un estudio clínico de enterococcus, en el cual todas las cepas esp^+/+ (74) produjeron biofilm y 77 de 89 cepas esp^-/- también produjeron biofilm. Entre las cepas de enterococcus productoras de biofilm, el 69% produjeron biofilm fuerte, el 46% medianamente fuertes y el 30% fueron productores débiles de biofilm; ninguna de las 12 cepas no productoras de biofilm fueron esp positivas (p<0,001). Los autores concluyeron que esp no se requiere para la producción de biofilm, pero existe una fuerte asociación entre la presencia del gen esp y mayores niveles de producción de biofilm en E. faecalis (21). Otros estudios sugieren que este gen no parece ser necesario ni suficiente para la producción de biofilm en E. faecalis y E. faecium. Di Rosa y cols. (2006) también han demostrado que E. faecalis (36 de 83) y E. faecium (9 sobre 45) esp-positivos aislados no estaban asociados con la formación de biofilm. Sin embargo, estos autores informaron que algunas cepas esp-positivos producen biofilm más denso que los productores de biofilm esp-negativos (15). Los factores exactos, incluyendo esp, y mecanismos implicados en la producción de biofilm por enterococcus aún se desconocen y son un área de investigación activa. Giridhara P M y cols., en 2011, demostraron que el gen esp y la formación de biofilm son importantes factores para que E. faecalis pueda colonizar y causar infecciones nosocomiales asociadas a dispositivos médicos implantados. Además, las cepas no formadoras de biofilm pueden convertirse a un fenotipo formador de biofilm si se transforma en una cepa esp positiva. Se demostró que una proteína similar al esp en los estafilococos media la formación del biofilm, indicando que esta característica está ampliamente distribuida entre los organismos que causan infecciones nosocomiales relacionadas con dispositivos médicos implantados. El sistema que se diseñó en este estudio funciona para la expresión del gen el cual dio como resultado el biofilm en el estudio de la fluorescencia y PCR. Se comparó la cepa de referencia con las cepas clínicas y se encontró la expresión del gen esp con la aplicación de pruebas moleculares que determinan las sobreexpresión de estos genes cuando las bacterias crecen en biofilm.

 

Conclusiones

La presencia y expresión del gen esp podría estar asociado con la formación de biofilm en E. faecalis. El gen esp es sobre expresado por la bacteria cuando se encuentra en estado de formación de biofilm. Se diseñó un modelo de expresión génica de bacterias formando biofilm, permitiendo la comprensión de la función de factores genéticos a través del análisis in vitro de la expresión de los genes asociados a la formación de biofilm, que pueden conducir a mejores estrategias para su control.

 

Limitaciones y recomendaciones del estudio

Se requiere adaptar el sistema a un tubo recolector para recuperar de manera óptima el lisado celular durante la extracción del ARN con el reactivo QIAzol. Segundo, durante el corte de los dientes para la tinción con fluorescencia, es necesario realizar cortes más finos que permitan acercar más el objetivo del microscopio a la muestra, ya que esto permitiría utilizar objetivos de mayor resolución como 40× y 100×. Por último, el análisis de la expresión génica puede ser optimizado mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Una de las principales limitaciones fue el número de réplicas, es decir, el número de dientes utilizados, ya que esto impidió realizar la verificación de los resultados obtenidos para cada cepa bacteriana. Para futuros ensayos recomendamos ampliar el número de réplicas así como el de cepas clínicas y genes a estudiar.

 

Bibliografía

1. Czaran T, Hoekstra RF. Microbial communication, cooperation and cheating: quorum sensing drives the evolution of cooperation in bacteria. PloS one 2009;4(8):e6655. PubMed PMID: 19684853. Pubmed Central PMCID: 2722019.         [ Links ]

2. Nowak M, Kurnatowski P. Biofilm caused by fungi-structure, quorum sensing, morphogenetic changes, resistance to drugs. Wiadomosci parazytologiczne 2009;55(1):19-25. PubMed PMID: 19579780. Biofilm tworzony przez grzyby-struktura, quorum sensing, zmiany morfogenetyczne, opornosc na leki.         [ Links ]

3. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 1999;May 21;284(5418):1318-22. PubMed PMID: 10334980.         [ Links ]

4. Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ. Biofilm formation in medicated root canals. Journal of endodontics. 2002 Oct;28(10):689-93. PubMed PMID: 12398165.         [ Links ]

5. Stuart CH, Schwartz SA, Beeson TJ, Owatz CB. Enterococcus faecalis: its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment. Journal of endodontics 2006;Feb;32(2):93-8. PubMed PMID: 16427453.         [ Links ]

6. Toledo-Arana A, Valle J, Solano C, Arrizubieta MJ, Cucarella C, Lamata M, et al. The enterococcal surface protein, Esp, is involved in Enterococcus faecalis biofilm formation. Applied and environmental microbiology 2001;Oct;67(10):4538-45. PubMed PMID: 11571153. Pubmed Central PMCID: 93200.         [ Links ]

7. Donlan RM. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging infectious diseases 2002;Sep;8(9):881-90. PubMed PMID: 12194761. Pubmed Central PMCID: 2732559.         [ Links ]

8. Donlan RM. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2001;Oct 15;33(8):1387-92. PubMed PMID: 11565080.         [ Links ]

9. Hufnagel M, Koch S, Creti R, Baldassarri L, Huebner J. A putative sugar-binding transcriptional regulator in a novel gene locus in Enterococcus faecalis contributes to production of biofilm and prolonged bacteremia in mice. The Journal of infectious diseases 2004;Feb 1;189(3):420-30. PubMed PMID: 14745699.         [ Links ]

10. Tendolkar PM, Baghdayan AS, Shankar N. The N-terminal domain of enterococcal surface protein, Esp, is sufficient for Esp-mediated biofilm enhancement in Enterococcus faecalis. Journal of bacteriology 2005; Sep;187(17):6213-22. PubMed PMID: 16109963. Pubmed Central PMCID: 1196143.         [ Links ]

11. Hancock LE, Perego M. The Enterococcus faecalis fsr two-component system controls biofilm development through production of gelatinase. Journal of bacteriology 2004;Sep;186(17):5629-39. PubMed PMID: 15317767. Pubmed Central PMCID: 516840.         [ Links ]

12. Kristich CJ, Li YH, Cvitkovitch DG, Dunny GM. Esp-independent biofilm formation by Enterococcus faecalis. Journal of bacteriology 2004;Jan;186(1):154-63. PubMed PMID: 14679235. Pubmed Central PMCID: 365672.         [ Links ]

13. Pillai SK, Sakoulas G, Eliopoulos GM, Moellering RC, Jr., Murray BE, Inouye RT. Effects of glucose on fsr-mediated biofilm formation in Enterococcus faecalis. The Journal of infectious diseases 2004;Sep 1;190(5): 967-70. PubMed PMID: 15295702.         [ Links ]

14. O'Toole G, Kaplan HB, Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annual review of microbiology 2000;54:49-79. PubMed PMID: 11018124.         [ Links ]

15. Di Rosa R, Creti R, Venditti M, D'Amelio R, Arciola CR, Montanaro L, et al. Relationship between biofilm formation, the enterococcal surface protein (Esp) and gelatinase in clinical isolates of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. FEMS microbiology letters 2006;Mar;256(1):145-50. PubMed PMID: 16487332.         [ Links ]

16. Miller MB, Bassler BL. Quorum sensing in bacteria. Annual review of microbiology 2001;55:165-99. PubMed PMID: 11544353.         [ Links ]

17. Dworniczek E, Kuzko K, Mroz E, Wojciech L, Adamski R, Sobieszczanska B, et al. Virulence factors and in vitro adherence of Enterococcus strains to urinary catheters. Folia microbiologica 2003;48(5):671-8. PubMed PMID: 14976727.         [ Links ]

18. Ramadhan AA, Hegedus E. Biofilm formation and esp gene carriage in enterococci. Journal of clinical pathology 2005;Jul;58(7):685-6. PubMed PMID: 15976332. Pubmed Central PMCID: 1770729.         [ Links ]

19. Tendolkar PM, Baghdayan AS, Gilmore MS, Shankar N. Enterococcal surface protein, Esp, enhances biofilm formation by Enterococcus faecalis. Infection and immunity 2004;Oct;72(10):6032-9. PubMed PMID: 15385507. Pubmed Central PMCID: 517584.         [ Links ]

20. Waar K, van der Mei HC, Harmsen HJ, Degener JE, Busscher HJ. Enterococcus faecalis surface proteins determine its adhesion mechanism to bile drain materials. Microbiology 2002 Jun;148(Pt 6):1863-70. PubMed PMID: 12055306.         [ Links ]

21. Mohamed JA, Huang W, Nallapareddy SR, Teng F, Murray BE. Influence of origin of isolates, especially endocarditis isolates, and various genes on biofilm formation by Enterococcus faecalis. Infection and immunity 2004;Jun;72(6):3658-63. PubMed PMID: 15155680. Pubmed Central PMCID: 415661.         [ Links ]

 

 

Dirección para correspondencia:
Eduardo Covo Morales
Facultad de Odontología.
Universidad de Cartagena
Campus de la Salud
Correo electrónico: ecovom@unicartagena.edu.co

Fecha de recepción: 30 de enero de 2016.
Aceptado para publicación: 24 de febrero de 2016.