ARTÍCULO ORIGINAL

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MECANISMOS DE EXPRESIÓN PROTEICA EN EL NERVIO ÓPTICO DE LA RATA.
MODIFICACIONES POR EXPOSICIÓN AL ALCOHOL

MECHANISMS OF PROTEIN EXPRESSION IN THE RAT OPTIC NERVE. 
MODIFICATIONS BY ALCOHOL EXPOSURE

PINAZO-DURÁN MD¹, CERVERA R², PONS S², ZANÓN-MORENO VC², 
GALLEGO-PINAZO R³, GUERRI C

RESUMEN Objetivos: Nuestros trabajos previos han demostrado que el consumo abusivo de etanol durante la gestación induce retraso en el desarrollo y alteraciones estructurales en los ojos y en la visión (Pinazo-Durán et al., Teratology ’93; Eur J Ophthalmol ’97; Strömland and Pinazo-Durán, Teratology ’94; Alcohol Alcoholism ’02). Nos proponemos estudiar a un nivel celular y molecular si el etanol modifica la expresión de proteínas marcadoras del desarrollo glial durante los estadíos pre- y postnatal de la rata, que puedan contribuir a la dismorfogénesis del nervio óptico. Método: Para estudiar las acciones del etanol sobre el desarrollo del nervio óptico de ratas sometidas a un proceso de alcoholización y ratas controles, las madres fueron alimentadas con dieta líquida durante la gestación y la lactancia, conteniendo alternativamente etanol (5% p/v; 35% del aporte calórico diario) o carbohidratos isocalóricos (35% aporte calórico diario). Los ojos fueron enucleados junto a los nervios ópticos y procesados para técnicas inmunocitoquímicas, morfológicas y western blot, utilizando anticuerpos contra la proteína fibrilar ácida de la glia (GFAP), proteína de los neurofilamentos (NFP) y proteína básica de la mielina (MBP). Resultados: Constatamos tres diferencias principales entre el grupo tratado con etanol respecto al control: 1) el tamaño del nervio óptico fue significativamente inferior en el grupo expuesto al etanol, 2) objetivamos cambios estadísticamente significativos en el desarrollo de los astrocitos, oligodendrocitos, axones ópticos y vainas de mielina de los nervios ópticos de ambos grupos y 3) apreciamos el retraso y anomalías en la expresión de proteínas implicadas en su desarrollo. Conclusiones: Los resultados confirman, como en trabajos anteriores, los efectos adversos del alcohol en el desarrollo del sistema visual. Sugerimos que el etanol debe actuar negativamente sobre la expresión de genes implicados en el desarrollo del sistema visual. Estos resultados pueden extrapolarse a los hallazgos clinicos del síndrome alcoholico fetal y de las neuropatias ópticas tóxicas. Palabras clave: Expresión proteica, síndrome alcohólico fetal, nervio óptico, desarrollo.

SUMMARY Purpose: Previous work from our group demonstrated that regular high consumption of ethanol during pregnancy induces a delay in growth and structural changes in the developing eye and vision (Pinazo-Durán et al., Teratology ’93; Eur J Ophthalmol ’97; Strömland and Pinazo-Durán, Teratology ’94; Alcohol Alcoholism ’02). Our main goal is to study at a cellular and molecular level, whether or not the prenatal alcohol exposure may change the development of the glial cells and inducing the optic nerve dysmorphogenesis. We have used key protein markers to analyse the expression in the rat optic nerve throughout the pre- and postnatal periods. Methods: To better understanding the actions of ethanol on optic nerve development in alcohol-induced and control dams, these were fed a liquid diet during gestation and lactation, containing either ethanol (5% w/, 35% of the daily food intake) or isocaloric carobydrates (35% of the daily food intake). Eyes were enucleated and processed to immunocytochemical and morphological tecnhiques and western blot approaches, using antibodies against the glial fibrillary acidid protein (GFAP), neurofilament protein (NFP) and myelin basic protein (MBP). Results: Three main observations were made in the ethanol-exposed and control groups: 1) the optic nerve size was significantly lower in the ethanol group than in the control group, 2) there were statistically significant changes in optic nerve astrocytes and oligodendrocytes, optic axons and myelin sheaths and 3) a delay and altered expression of developmental proteins. Conclusions: All data support our earlier studies confirming the deleterious effects of ethanol on the developing visual system. We suggest that ethanol may alter the expression of precise genes involved in eye development and posterior remodelling. These results can be extrapolated to clinical advances in fetal alcohol syndrome and toxic optic neuropathies (Arch Soc Esp Oftalmol 2005; 80: 99-104). Key words: Protein expression, fetal alcohol syndrome, optic nerve, development.

 

 

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Recibido: 11/2/04. Aceptado: 15/2/05.
1 Doctor en Medicina. Unidad Investigación Oftalmológica "Santiago Grisolía". Hospital Universitario Dr. Peset, Valencia.
2 Licenciado en Biología. Universidad de Valencia. Unidad Investigación Oftalmológica "Santiago Grisolía". Hospital Universitario Dr. Peset, Valencia.
3 Licenciado en Medicina. Universidad de Valencia. Unidad Investigación Oftalmológica "Santiago Grisolía". Hospital Universitario Dr. Peset, Valencia.
4 Doctor en Ciencias Biológicas. Universidad de Valencia. Instituto de Investigaciones Citológicas de Valencia.
Comunicación presentada parcialmente en el LXXIX Congreso de la S.E.O. (Valencia 2003).
Proyecto de investigación concedido a la Dra. M.D. Pinazo-Durán y subvencionado por el Instituto de Salud Carlos III y Fondos Europeos, FIS/FEDER P1020191 (becarios adscritos al proyecto R. Cervera y S. Pons).

Correspondencia:
M.D. Pinazo Durán
Unidad Investigación Oftalmológica "Santiago Grisolia"
Hospital Universitario Dr. Peset
Avda. Gaspar Aguilar, 90
46017 Valencia
España

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INTRODUCCIÓN

El abuso de alcohol durante la gestación induce una serie de efectos adversos en el organismo en desarrollo, cuyo máximo exponente es el síndrome alcohólico fetal (SAF), que incluye malformaciones oculares y pérdida de la visión (1-4). El alcohol es un agente teratógeno que induce retraso en el crecimiento y desarrollo del globo ocular así como alteraciones en el desarrollo del nervio óptico (2,3). En este trabajo pretendemos analizar tanto los mecanismos de acción del alcohol sobre el nervio óptico en desarrollo, como las posibles variaciones de parámetros morfológicos, morfométricos y esterológicos y alteraciones en el patrón de expresión de proteínas. La finalidad del análisis del desarrollo del nervio óptico es estudiar, en un modelo experimental, las manifestaciones oftalmológicas descritas en niños nacidos de madres alcohólicas que presentan el SAF, principalmente la hipoplasia del nervio óptico descrita en el 70% de los niños con el síndrome tóxico gestacional (4).

Las células macrogliales, astrocitos y oligodendrocitos, son un componente citoarquitectural esencial para el nervio óptico cumpliendo diversas funciones en el mantenimiento y defensa de neuronas y axones ópticos, formando la vaina de mielina y favoreciendo la integridad y actividad de la misma. Empleamos técnicas de estudio de la expresión de marcadores del desarrollo del sistema nervioso, como la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP), proteína de los neurofilamentos (NFP) y proteína básica de la mielina (MBP). Nuestros resultados morfológicos, morfométricos y los datos de las técnicas inmunológicas confirman que la ingesta abusiva de bebidas alcohólicas en la gestación altera la morfogénesis del nervio óptico, induciendo cambios sustanciales en la expresión proteica durante los períodos pre- y postnatal del desarrollo.

MATERIAL Y MÉTODO

Veinte ratas hembra jóvenes de la raza Wistar (200 g peso corporal) fueron mantenidas en el estabulario del Instituto de Investigaciones Citológicas, de la Fundación de Estudios Avanzados de Valencia, bajo las condiciones usuales de laboratorio, con el propósito de destinarlas a éste y a otros trabajos similares (utilizando el mismo animal en diferentes estudios) y con los permisos de los comités correspondientes. Los experimentos se adecuaron a los criterios de la Comunidad Europea para este tipo de trabajos (86/609). Las ratas se alimentaron con dieta líquida (5) que contenía etanol (5% p/v; 35% CDT; n=10; GEtOH) o con carbohidratos isocalóricos (35% CDT; n=10; GC), durante las 6 semanas previas a la inducción de su gestación, a lo largo de la misma (que dura aproximadamente 3 semanas) y de la lactancia (unas 2-3 semanas tras el nacimiento). De este modo las ratas alcanzaron una dependencia del etanol provocada mucho antes del propio estado gestacional, de forma que se pueda extrapolar a las condiciones de alcoholismo crónico humano. Así pues, los efectos que éste produce en las crías son consecuencia del alcoholismo crónico provocado en las ratas madre. Las crías se sacrificaron en etapas clave de su desarrollo pre- (E) y postnatal (P): 21E, 7P, 14P, 21P con el fin de obtener sus ojos y nervios ópticos. Los nervios ópticos derechos se congelaron a –85ºC y almacenaron hasta la realización de las técnicas de western blot e inmunoblotting, utilizando los anticuerpos frente a la GFAP, MBP y NFP (de 200 kD) comprados a laboratorios Sigma, laboratorios Randox y laboratorios Santa Cruz. Para el desarrollo de la técnica de western blot las muestras se homogeneizaron en cinco volúmenes de tampón de lisis, determinando la concentración de proteínas mediante la técnica del ácido bicichincoico (BCA). Los nervios ópticos izquierdos se procesaron e incluyeron en dos tipos diferentes de resinas para estudios microscópicos: a) en el Epon 850, para obtener secciones transversales semifinas (0,5-1 micras) que se examinaron con un microscopio óptico LEICA y sistema analizador de imágenes Q-WIN y b) en resina Lowicril K4M, de forma que las secciones semifinas (0,5-1 micra) obtenidas de cada muestra, se destinaron a técnicas inmunocitoquímicas (inmunogold plus silver enhancement) mediante los anticuerpos citados. Se llevaron a cabo diversos procedimientos morfológicos, morfométricos y estereológicos, siguiendo el procedimiento descrito por nosotros con anterioridad, para los nervios ópticos (2,3). Las microfotografías se clasificaron y se llevó a cabo un análisis de imágenes. Básicamente se tomaron tres medidas repetidas de cada uno de los parámetros descriptivos para obtener las medias y desviaciones estándar, analizando posibles diferencias en el mismo grupo y entre ambos grupos de estudio, a lo largo de cada uno de los días experimentales (realizando comparaciones emparejadas de seguimiento). Se emplearon las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y t de Student, tomando los intervalos de confianza al 95%. Todos los datos se procesaron estadísticamente mediante el programa Excel para Windows XP y el programa SPSS 10.0 (SPSS for Windows, SPSS Inc, Chicago, USA).

RESULTADOS

Los pesos corporales, cerebrales y oculares de las ratas expuestas pre- y postnatalmente al etanol fueron significativamente inferiores a los controles en todos y cada uno de los días experimentales (fig 1). Además, el área de la sección transversal del nervio óptico y la densidad de axones ópticos mielinizados fueron también significativamente inferiores a las obtenidas de los animales controles durante el desarrollo, como se refleja en la figura 1. El estudio morfométrico y estereológico de la sección transversal del nervio óptico demostró la disminución del área nuclear y volumen nuclear de las células macrogliales en el GEtOH frente al GC, en todos los dias del estudio evolutivo (fig. 2).

Fig. 1. Parámetros del desarrollo del globo ocular y nervio óptico de la rata expuesto a la acción del etanol. 
Los resultados son las medias ± DE de 10 ratas elegidas al azar.
* y ** muestran diferencias significativas entre grupos (intervalo de confianza al 95%).

 

Fig. 2. Parámetros morfométricos y estereológicos del desarrollo de las células macrogliales del nervio óptico de la ruta expuesto 
a la acción del etanol. Los resultados son las medias ± DE de 4 muestras elegidas al azar y de 5 micrografías por campo de estudio.
* y ** muestran diferencias significativas entre grupos (intervalo de confianza al 95%).

Los ensayos mediante la técnica de western blot muestran los geles de agarosa con la expresión de las proteínas del nervio óptico. La transferencia a membranas de nitrocelulosa e incubación en los anticuerpos citados, ha manifestado las bandas de expresión y el patrón creciente durante el desarrollo del nervio óptico para las tres proteinas analizadas (GFAP, MBP, NFP), como se aprecia en la figura 3. Todos los datos coincidian en la expresión tanto pre- como postnatal para cada una de las proteínas analizadas en ambos grupos de animales, presentando un pico tras el nacimiento que se hacia más patente entre la primera y segunda semanas del desarrollo del animal. Sin embargo, las bandas de expresión fueron menos marcadas en el GEtOH que en el GC. Y cuando las mismas se estudiaron objetivamente por tres investigadores, mediante densitometría de las transparencias obtenidas de las membranas de nitrocelulosa ya incubadas, la comparación entre grupos en unidades densitométricas relativas demostró la disminución de la expresión proteica en el GEtOH respecto al GC, a lo largo de todos los días del desarrollo (fig. 3).

Fig. 3. Expresión de la proteína básica de la mielina (MBP) (19.000 kD) en el nervio óptico de la rata. 
Técnica de western blot (SDS Page) e inmunoblotting. Las bandas de expresión y 
los resultados cualitativos (en unidades densitométricas) muestras 
que la expresión de la proteína en el nervio óptico de la rata fue notablemente superior en el GC que en el GEtOH.

Finalmente, el estudio inmunohistoquímico mediante la técnica del inmunogold plus silver enhancement y la comparación de las micrografías de ambos grupos, demuestra la disminución en la expresión protéica en el nervio óptico expuesto a la acción del etanol durante su desarrollo, como se aprecia en la disminución de la densidad de marcaje para el estudio de expresión de la proteína GFAP, marcadora específica de los filamentos intermedios del citoesqueleto de los astrocitos (fig. 4).

Fig. 4. Expresión de la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) en el nervio óptico de la rata. 
Técnica de inmunogold plus silver enhancement. Micrografías comparativas entre ambos 
grupos exprimentales (GEtOH vs GC) mostrando la mayor densidad de expresión proteica en 
los astrocitos no expuestos al tóxico durante su desarrollo.

 

DISCUSIÓN

El hábito de beber y el abuso en la ingesta de bebidas alcohólicas durante el período gestacional induce una serie de alteraciones en el desarrollo del organismo en formación que dependen esencialmente de la dosis ingerida, del tiempo de exposición al mismo y del estadio gestacional en el que se produce el contacto con el tóxico (1). Estas manifestaciones se han denominado internacionalmente Alcohol Related Bird Defects (ARBD) [World Congress on the Prenatal Ethanol Effects. National Institute of Health and National Institute of Alcohol Abuse and Alcoholism (USA), and Institute of Cytological Research (Valencia, Spain). Proceedings. Washington-Valencia 2001]. Engloban un rango de anomalías que van desde el retraso moderado en el peso y el crecimiento hasta malformaciones severas y retraso mental, siendo la manifestación más extrema el síndrome alcohólico fetal (SAF), descrito en 1973 por Jones y Smith (1).

El sistema visual es especialmente vulnerable a la acción de agentes tóxicos durante el desarrollo. Teniendo en cuenta que la neurotoxicología está sujeta a muchas variables clínico-epidemiológicas, y que éstas se exacerban durante la morfogénesis, el problema estriba en poder diferenciar los efectos derivados específicamente del agente tóxico, de otros factores que pueden interferir con la aparición de los signos y los síntomas. Los modelos animales nos permiten controlar muchos de estos factores y favorecer ciertas condiciones que ayuden a los investigadores a analizar en los laboratorios los mecanismos de acción del tóxico sobre las células y los tejidos. Diversos grupos han desarrollado modelos experimentales para el estudio de los efectos del alcohol y drogas, tanto para la intoxicación aguda como crónica, particularizando en las anomalías del sistema nervioso central (6-8). Por nuestra parte utilizamos el modelo de alcoholismo crónico en las ratas gestantes, mediante dieta líquida, amplicamente utilizado por investigadores de todo el mundo, por resultar la vía y forma de administración del tóxico más extrapolable al humano. Aplicamos este modelo animal al estudio del desarrollo del sistema visual y de forma particular al estudio de los efectos de la exposicion pre- y postnatal al etanol sobre el nervio óptico.

Los resultados morfológicos, morfométricos e inmunohistoquímicos del presente trabajo demuestran que la exposición pre- y postnatal al etanol altera el desarrollo del nervio óptico. Estos datos refuerzan descripciones previas de nuestro laboratorio y coinciden en lo esencial con las de otros grupos, revisadas recientemente por Strömland y Pinazo-Durán (9). Utilizando diferentes técnicas de estudio hemos confirmado los efectos nocivos de la exposición pre- y postnatal al etanol sobre el desarrollo de las células macrogliales (astrocitos y oligodendrocitos), axones ópticos y vainas de mielina, en el nervio óptico.

Según los resultados obtenidos de nuestro modelo experimental, y las últimas descripciones en relación a la inducción de apoptosis por la acción del alcohol sobre el SNC (6) sugerimos que la exposición pre- y postnatal al etanol puede interferir con la expresión de genes y moléculas concretas y esenciales para la neuro-retinogénesis. Esto induciría la alteración de los procesos de proliferación y diferenciación celular en etapas precoces del desarrollo dando lugar a las anomalías descritas en el transcurso de este trabajo. Y extrapolando estos datos a los hallazgos oftalmológicos del SAF en el humano (1,4,9) podemos concluir que el alcohol es un potente teratógeno para el desarrollo del nervio óptico.

 

BIBLIOGRAFÍA

1. Jones KL, Smith DW. Recognition of the fetal alcohol syndrome in early infancy. Lancet 1973; 2: 999-1001.         [ Links ]

2. Pinazo-Durán MD, Renau-Piqueras J, Guerri C. Developmental changes in the optic nerve related to ethanol consumption in pregnant rats: analysis of the ethanol-exposed optic nerve. Teratoloy 1993; 48-305-322.         [ Links ]

3. Pinazo-Durán MD, Guerri C, Strömland K, Renau-Piqueras J. Análisis comparativo de los parámetros del desarrollo del globo ocular y del nervio óptico en ratas expuestas prenatalmente al etanol. Arch Soc Esp Oftalmol 1996; 70: 65-72.         [ Links ]

4. Strömland K. Ocular abnormalities in the fetal alcohol syndrome. Acta Opththalmol Supp 1985; 171: 1-50.         [ Links ]

5. Lieber CS, DeCarli LM. The feeding of alcohol in liquid diets: two decades of applications and 1982 update. Alcohol Clin Exp Res 1982; 6: 523-531.         [ Links ]

6. Ikonomidou C, Bittigau P, Ishimaru MJ, Wozniak DF. Kock C, Genz K et al. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science 2000; 287: 1056-1060.         [ Links ]

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8. Bonthius DJ, West JR. Alcohol-induced neuronal loss in developing rats: increased brain damage with binge exposure. Alcohol Clin Exp Res 1990; 14: 107-118.         [ Links ]

9. Strömland K, Pinazo-Durán MD. Ophthalmic involvement in the fetal alcohol syndrome: clinical and animal model studies. Alcohol Alcohol 2002; 37: 2-8.         [ Links ]