ARTÍCULO ORIGINAL

 

Identificación por métodos moleculares de adenovirus asociados a conjuntivitis

Identification of adenovirus associated with conjunctivitis by molecular methodology

 

 

Mejía-López H.¹, Matías-Florentino M.², Vélez-Montoya R.³

Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana. Unidad de Investigación. México D.F. México.
¹ Licenciada en Ciencias Biomédicas.
² Técnico de Laboratorio.
³ Doctor en Medicina.

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Objetivo: Por medio de métodos moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la secuenciación del material genético, identificar adenovirus en pacientes con conjuntivitis.
Métodos: Se procesaron muestras de raspado del saco conjuntival inferior de 51 pacientes (39 diagnosticados con conjuntivitis folicular y 12 diagnosticados con conjuntivitis vernal) para identificar adenovirus por medio de la PCR genérica. Todas las muestras positivas en la PCR genérica, fueron cultivadas en células VERO para el aislamiento del virus, éste se demostró por inmunofluorescencia. Se utilizó la PCR múltiple para la caracterización de los serotipos aislados y las variantes genéticas se identificaron mediante la secuenciación automatizada.
Resultados: Veintiocho de los pacientes diagnosticados con conjuntivitis folicular y seis de los diagnosticados con conjuntivitis vernal resultaron positivos a adenovirus (67%). El cultivo en células VERO permitió el aislamiento del virus de 8 muestras. Sólo tres de los aislados fueron identificados (un serotipo Ad1 y dos Ad2) por la PCR múltiple que identifica adenovirus del subgénero C. Por secuenciación automatizada se identificó una variante genética correspondiente al Ad1, mientras que los aislados de Ad2 fueron idénticos a los reportados en el Banco de Genes.
Conclusiones: La Reacción en Cadena de la Polimerasa y la Secuenciación son herramientas útiles para la identificación y caracterización de agentes causantes de enfermedades tales como la Conjuntivitis por Adenovirus .

Palabras Clave: Conjuntivitis folicular, conjuntivitis vernal, adenovirus, epidemiología molecular, infecciones oculares.

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ABSTRACT

Objective: To identify adenovirus in patients with conjunctivitis by molecular methods such as the Polymerase Chain Reaction (PCR) and DNA sequencing.
Methods: Samples of scrapings from the inferior fornix of 51 patients (39 diagnosed with Follicular Conjunctivitis and 12 diagnosed with Vernal Conjunctivitis) were processed by generic PCR to identify adenovirus. All the samples that were PCR positive were cultured on VERO cells for virus isolation, with this being demonstrated by immunofluorescence. For the identification of the isolated serotype, the multiplex PCR was utilized and DNA automated sequencing was employed to identify the genetic variants.
Results: Twenty-eight of the individuals diagnosed with Follicular Conjunctivitis and six of those diagnosed with Vernal Conjunctivitis, had positive results to adenovirus (67%). The cultures in VERO cells allowed the isolation of eight samples. Only three of the isolated viruses (one Ad1 and two Ad2) were identified by the multiplex PCR used to identify the subgenus C adenovirus. An Ad1 genetic variant was identified by automated sequencing while the Ad2 serotypes were identical to the ones reported by Genbank.
Conclusions: The Polymerase Chain Reaction and DNA sequencing are useful tools to identify and characterize microorganisms responsible for diseases such as conjunctivitis caused by adenoviruses (Arch Soc Esp Oftalmol 2006; 81: 375-382).

Key words: Follicular conjunctivitis, vernal conjunctivitis, adenovirus, molecular epidemiology, ocular infections.

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Introducción

Los adenovirus (Ad) están ampliamente distribuidos en el mundo, infectan millones de personas causando diversas manifestaciones clínicas tales como queratoconjuntivitis, cistitis hemorrágica, gastroenteritis y afectan seriamente vías respiratorias altas y bajas. Las enfermedades por adenovirus varían de esporádicas a epidémicas sin producir signos o síntomas patognomónicos, son usualmente agudas y autolimitadas, pero en niños muy pequeños pueden ser fatales o estar asociados con daños crónicos. Se conocen más de 100 serotipos y se han identificado 6 subgéneros (A-F), basados en varias características biológicas y moleculares, sin embargo, se han reportado 51 de ellos capaces de infectar al hombre (1,2). Las infecciones que producen estos virus son íntimamente relacionadas con su tropismo en diverso tejidos; Ad8, Ad19 y Ad37 infectan ojo Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5 y Ad6 infectan preferentemente vías respiratorias mientras que Ad40 y Ad41 causan infección en tracto digestivo (3).

Numerosos reportes muestran un amplio rango de andenovirus pertenecientes a los subgeneros B (Ad3 y Ad7), C (Ad1, Ad2, y Ad5), o E (Ad4), como causantes esporádicos de conjuntivitis, conjuntivitis folicular o fiebre faringo-conjuntival (4-6). Brotes epidémicos son producidos por el subgenero D fundamentalmente por Ad8 causando queratoconjuntivitis (7). Por estas razones y debido a que en México no se conocen reportes que aporten datos sobre su dinámica epidemiológica, resulta importante la rápida identificación del virus fundamentalmente en casos en donde las formas características no están presentes. Diversa metodología se emplea en la actualidad para la identificación de adenovirus. El aislamiento en líneas celulares apropiadas es de gran utilidad en la formación de bancos genómicos en caso de brotes epidémicos, sin embargo, requiere de 2 a 4 semanas para su identificación (8). La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica moderna, extraordinariamente específica, sensible y rápida, que requiere de una muestra pequeña del especimen en estudio (9), por estas razones en el presente trabajo utilizamos la PCR para analizar muestras de pacientes que acudieren a la consulta externa de nuestro instituto y que fueron diagnosticados con conjuntivitis vernal o conjuntivitis folicular. Una modificación, la PCR múltiple fue empleada para la identificación de serotipos responsables de la infección; este rubro es de nuestro particular interés debido a que ciertos serotipos afectan preferentemente al ojo y al respecto no existen reportes en México. Con el fin de conocer las variantes genotípicas, estudiamos la secuenciación de tres serotipos aislados.

 

Sujetos Material y Métodos

Muestras clínicas

Fueron analizadas muestras de pacientes con conjuntivitis vernal o conjuntivitis folicular, de octubre de 2004 a agosto de 2005. La toma de la muestra se realizó haciendo un raspado de saco conjuntival inferior utilizando un hisopo de arginato de calcio, el cual se introdujo posteriormente, en un medio de trasporte conteniendo 50 mg/ml de gentamicina, 500 U de penicilina-estreptomicina/ml, fungizona 1mg/ml y 5% albúmina sérica bobina en un buffer de Hank.

Extracción de DNA

La extracción de ADN se realizó con el mini kit QIAamp según protocolo de Quiagen (QIAGEN, Sciences. Maryland, USA). El material genético fue almacenado a -20°C hasta su identificación.

Aislamiento de adenovirus

Las muestras biológicas fueron inoculadas en células epiteliales de riñón de mono verde (VERO), una línea celular susceptible a ser infectada por Ad. Después de 3 a 5 pases en las células VERO (células epiteliales de riñón de mono verde), hasta la obtención del efecto citopático característico, se realizó la prueba de inmunofluorescencia directa (IF) (10), utilizando el Kit de Chemicon (Chemicon International Inc.). Como colorante de contraste fue empleado yoduro de propídio el cual tiñe de color rojo al material genómico. Todos los cultivos positivos en la prueba de inmunofluorescencia, fueron procesados para la PCR genérica para adenovirus, con el fin de confirmar el aislamiento.

PCR genérica

Los oligonucleótidos ADRJC1 y ADRJC2 fueron usados para amplificar un producto de PCR de 140pb (tabla I). Este amplificado corresponde a una región altamente conservada del ADN que codifica para la proteína que constituye a los capsómeros de todos los adenivirus. Como controles se usaron Ad1, Ad2 y Ad5, aislados de pacientes con Infección Respiratoria Aguda, previamente caracterizados. Cada reacción fue hecha según el protocolo de Elnifro EM et al. (11). La reacción se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Co. Norwalk, Connecticut). Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1,5% teñidos con bromuro de etidio (1 µg/ml). Se usó como marcador estándar de pesos moleculares el Ready-Load 100 bp DNA Ladder (Invitrogen, L.T.).

PCR múltiple

Serotipos específicos fueron identificados por un PCR múltiple, se usó para ello, olinonucleótidos que reconocen el exón que codifica para el filamento de los adenovirus Ad1, Ad2 y Ad5 del subgénero C. El oligonucleótido corriente arriba AdCF, es común en los tres Ad y los oligonucleótidos corriente abajo Ad1R, Ad2R y Ad5R pertenecen al ADN que codifica el filamento los serotipo específicos, estos permiten la obtención de los amplicones de 630pb, 204pb y 455pb, respectivamente (tabla I). Fueron usados como controles Ad1, Ad2 y Ad5, aislados de pacientes con Infección Respiratoria Aguda, previamente caracterizados. Cada reacción fue hecha según protocolo Adhikary AK et al. (12). La reacción se llevo a cabo en un termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Co. Norwalk, Connecticut, USA). Los productos de amplificación fueron separados en un gel de agarosa al 1,5%, posteriormente se extrajeron del gel según protocolo de QUIAEX II. (QIAGEN Sciences. Maryland, USA); la pureza y concentración de los mismos, fueron verificadas en un gel de agarosa al 1,5%, teñido con bromuro de etidio (1 µg/ml). Como marcador estándar de pesos moleculares se usó el Low Mass Ladder (Invitrogen, L.T.).

Secuenciación de serotipos

Para la secuenciación de los adenovirus que fueron identificados en el PCR múltiple, se realizó una PCR con los oligonucleótidos que identifican los serotipos del subgénero C (CF, 1R y 2R) y se utilizó el kit BigDye Terminator (Applied Biosystems) que contiene cada ddNTP marcado con fluorescencia, el volumen de reacción fue de 10 µL que contenía 10ng del ADN a secuenciar y 1 µM de cada primer. Las condiciones de amplificación fueron a 96ºC/30seg seguido de 25 ciclos a 50ºC/15seg y 60ºC/4min. Los productos de la reacción fueron purificados en Columnas CentriSep (Princeton Separations) y analizados en un secuenciador ABI Prism 310. Los electroferogramas obtenidos fueron comparados con secuencias de nucleótidos reportadas en el Banco de Genes, AB108423 para Ad1 y AJ278920 para Ad2.

 

Resultados

PCR genérica

Fueron analizadas 51 muestras de raspado de saco conjuntival inferior de pacientes de consulta externa. La tabla II muestra la lista de todos los pacientes estudiados y el resultado de la PCR en cada paciente. Resultaron positivos 28, que representan el 75% de los individuos diagnosticados con conjuntivitis folicular y 6, que representan el 50% de los diagnosticados con conjuntivitis vernal, en la figura 1 se muestran el amplificado de 140pb, representativo de un resultado positivo, obtenido con los oligonucleótidos genéricos.

Fig. 1. Gel 1,5% de agarosa teñidos con bromuro de etidio que representa un ejemplo
de amplificación del PCR genérico con ADRJC1 y ADRJC2. M, marcador estándar
Ready-Load 100 bp DNA; 2, control negativo; 3, amplificado de 140 pb.

Aislamiento de adenovirus

Todas las muestras positivas a la PCR genérica, fueron sembradas en cultivos de células VERO. Fueron aisladas 8 de las muestras inoculadas. La figura 2a muestra células VERO sin infectar, en la figura 2b se observa el efecto citopático característico de las células infectadas con el virus. Como pruebas confirmatorias del aislamiento, se utilizó la técnica de IF directa. En la figura 3 se presenta un ejemplo de la IF directa en células infectadas, en las que pueden apreciarse las inclusiones virales de color amarillo brillante.

Fig. 2. Cultivos de Células Vero. A) Células no infectadas.
B) Efecto citopático característico de adenovirus.

Fig. 3. Inmunofluorescencia directa en células Vero infectadas
 con una muestra de raspado conjuntival y teñidas con anticuerpos
específicos contra adenovirus (kit de Chemicon Co.). Inclusiones
virales de color amarillo brillante. Las células no infectadas aparecen
de color rojo.

PCR múltiple

Los aislados fueron probados con oligonucleótidos que identifican serotipos específicos del subgenero C de adenovirus. Tres muestras de las ocho aisladas, pudieron ser reconocidas en esta prueba. La figura 4 muestra los productos de amplificación obtenidos y puede observarse un amplificado de 630pb y dos de 204pb correspondientes a Ad1 y Ad2 respectivamente, al ser comparados con el control positivo de la reacción, el cual muestra los productos amplificados pertenecientes a Ad1, Ad2 y Ad5, este último de 455pb.

Fig. 4. Gel 1,5% de agarosa teñidos con bromuro de etidio. M, marcador estándar
Low Mass Ladder (Invitrogen, L.T.); Amplificación del PCR múltiple de subgénero C en:
2, control positivo; 3, control negativo; 4, 5 y 6 los aislados de los pacientes GAF, FBR
 y AAM, respectivamente.

Secuenciación de serotipos

Los tres serotipos identificados en la PCR múltiple fueron secuenciados. La figura 5 muestra la porción del electroferograma perteneciente a Ad1 en donde se encontró un cambió de A por G en el nucleótido 199 (flecha) el cual implica un cambio en el codón CAA que codifica para serina (en la secuencia encontrada en AB108423), a un CAG que codifica para asparagina. Las secuencias de los serotipos Ad2, fueron idénticas a las reportadas en la dirección AJ278920, par los amplificados obtenidos con los nucleótidos AdCF/Ad2R.

Fig. 5. Análisis de la secuencia del amplificado obtenido con AdCF/Ad1R (Ad1). Se observa un
cambio de A por G en el nucleótido 199 (flecha) el cual implica un cambio en el codón CAA
que codifica para serina (panel 1, secuencia encontrada en AB108423 del Banco de Genes),
a uno CAG que codifica para asparagina (panel II).

Discusión

En México Pizarro et al., identificaron adenovirus respiratorios usando las técnicas de fijación de complemento y neutralización (13-15). Por otra parte, no existen reportes sobre la prevalencia y dinámica epidemiológica de adenovirus que afectan al ojo. Por esta razón en el presente estudio se reporta el uso de técnicas modernas altamente específicas, sensibles y rápidas, que requieren de muy poco material biológico para identificar adenovirus como uno de los agentes más frecuentes en las infecciones oculares.

En nuestro reporte se pueden distinguir dos grupos, uno diagnosticado como conjuntivitis vernal y otro como conjuntivitis folicular. El 50% del primer grupo se encontró infectado con adenovirus y un paciente de este grupo (dato no mostrado) presentó herpes simple tipo 1 (HSV-1). La queratoconjuntivitis vernal es una de las formas de la alergia crónica en ojos que se presenta en niños, en donde hay una disminución visual debido al daños en la córnea. Recientemente Zhan et al. mostraron el papel inmunomodulador de las células de epitelio conjuntival en la expresión de moléculas coestimuladoras (16). También se ha demostrado una participación importante de la respuesta de tipo TH2 (17). Una incógnita a resolver en la conjuntivitis vernal, plantea el hecho de que si la infección induce la permanencia del cuadro clínico en esta alergia, puesto que los virus comprometen a una respuesta de tipo celular. Muy pocos estudios se han hecho al respecto, sin embargo, es crucial mencionar que en cuadros respiratorios los adenovirus tienen una participación en la transducción de los RNAm de la célula infectada, evitando la síntesis de enzimas inducida por interferón, permitiendo así, la replicación del virus al inicio de la infección. Por otro lado, Un producto del gen E3 de trascripción temprana del virus, induce la internalización y degradación del receptor para el factor de crecimiento epidermal (EGF-R). El EGF-R, es una proteína transmembranal con actividad de tirosina cinasa, que al ser estimulado por su ligando, induce la fase de síntesis celular. Otra proteína codificada por E3 antagoniza la respuesta inflamatoria mediada por TNF-a. Estos mecanismos facilitan la persistencia del virus en las células infectadas (18,19).

Las manifestaciones clínicas en el ojo por infección con adenovirus pueden incluir conjuntivitis folicular aguda, bulbar o palpebral, con una quemosis que causa dolor y alteraciones de la visión, también puede haber formación de membranas. Esta enfermedad está frecuentemente acompañada de linfoadenopatía auricular significativa; pueden ser partes de un síndrome respiratorio faríngeo (fiebre faringo-conjuntival) o presentarse como una entidad separada. El 76% de los pacientes captados en este estudio fueron diagnosticados con conjuntivitis folicular, sin embargo, estos síntomas no son patognomónicos de una infección por adenovirus, otros patógenos pudieron ser la causa del cuadro como son, citomegalovirus, enterovirus, o coxsakie virus (20).

Debido a que los adenovirus tienen un tropismo marcado por células epiteliales de los tejidos que infectan, es de crucial importancia la identificación de los serotipos que circulan en nuestra población; con este fin, utilizamos una prueba PCR-múltiple con la que hemos podido definir la presencia de Ad1 y Ad2, puesto que se han mostrado con alta frecuencia serotipos del subgénero C produciendo daños oftalmológicos (4,5). En este reporte, se muestra el aislamiento del virus a partir de cultivo en células VERO y la caracterización de 2 serotipos pertenecieron al subgénero C. Es fundamental el estudio de un mayor número de casos, para comprender la dinámica epidemiológica de este virus en México.

La secuenciación automatizada es una herramienta moderna y muy útil en el estudio del material genético, aquí permitió mostrar que la PCR múltiple fue sensible en la identificación de los serotipos Ad1 y Ad2 como causantes de la infección y además, nos aporta datos para reconocer variantes genéticas que pudieran tener relevancia en el ámbito clínico.

La secuenciación de los Ad1 y Ad2 identificados por PCR múltiple, corresponde al amplificado del exón que codifica el filamento de estos serotipos y que los identifica específicamente (12). Resulta interesante, que el subgénero C de los adenovirus tiene un genoma íntimamente relacionado y se han reportado en el banco de genes varias secuencias de su genoma, lo que de alguna manera habla de su enorme diversidad. La variante encontrada en el Ad1 aislado, refleja lo reportado en la literatura sobre el polimorfismo de este grupo tan especial (21). Un mayor número de muestras permitirá conocer los serotipos circulantes en México y por medio de su secuenciación poder identificar las variantes antigénicas.

De este trabajo se puede concluir que la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación son herramientas útiles para la identificación y caracterización de agentes causantes de enfermedades tales como la conjuntivitis por adenovirus y son muchos más sensibles que la técnica de aislamiento por cultivo en células VERO.

 

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Dirección para correspondencia
Chimalpopoca 14 Col. Obrera
Del. Cuauhtemoc. CP 06800
México D.F.
México
E-mail: linchm10@yahoo.com

Recibido: 20.10.05.
Aceptado: 19.7.06.