El sistema visual es vulnerable a la acción de xenobióticos, incluidos diversos tóxicos como el alcohol, y los psicoestimulantes. Esto implica una mayor vulnerabilidad en el caso del consumo abusivo durante la gestación, causando un síndrome caracterizado por la triada patognomónica: malformaciones, retraso en el crecimiento y desarrollo ponderal, alteraciones del sistema nervioso (central y periférico) y retraso mental. Estas manifestaciones que denominamos síndrome tóxico gestacional (1) (STG) son comunes a diversos agentes, como los descritos para el abuso de alcohol (2) y la cocaína (3).

En 1985, Strömland describe la presencia de hipoplasia del nervio óptico y aumento de la tortuosidad vascular en el fondo de ojo de niños nacidos de madres alcohólicas crónicas (4). Los modelos animales han reproducido la afectación ocular en ratas expuestas prenatalmente al EtOH (5), puntualizando que los animales afectos nunca recuperaban las lesiones, incluso tras la deprivación del tóxico (6). Los modelos animales permiten controlar muchas de las variables que no pueden controlarse en el ser humano y realizar experimentos encaminados a esclarecer las bases celulares y moleculares de la acción de los tóxicos sobre los organismos en desarrollo.

Con este trabajo pretendemos analizar los mecanismos etiopatogénicos que intervienen en las anomalías del desarrollo de la retina y nervio óptico en dos modelos experimentales de exposición a psicoestimulantes o alcohol en la rata.

Diseño de los modelos experimentales y distribución de los animales

Hemos utilizado ratas Wistar en edad juvenil (2 meses de edad, y peso corporal 200-230 g), mantenidas en el Laboratorio de Patología Celular del Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia), y el Instituto de Investigación de Biología Molecular y Celular de Oporto (Portugal), bajo condiciones de laboratorio y para destinarlas a éste y trabajos similares (utilizando el mismo animal en diferentes estudios). Se obtuvieron los permisos de los comités correspondientes y todos los experimentos se adecuaron a los criterios de la Comunidad Europea para trabajos de experimentación animal (86/609).

La distribución de las ratas para el estudio puede observarse en la tabla I. En total, hemos utilizado 36 crías, a las que se les extrajeron el globo ocular y nervio óptico.

En el grupo de experimentación con MA, la administración fue por inyección subcutánea. Se les administraron 5 mg/kg peso y día, disuelto en 3 ml de suero salino (0,9%), dividido en tres dosis diarias de 1 ml con 1,6 mg de clorhidrato de metanfetamina, por dosis. La administración comienza el día 8 de gestación, hasta el 22. La determinación de los días de gestación se realiza mediante lavado del flujo vaginal. Al grupo control se les inyecta subcutáneamente suero salino. La razón de administrar esta última sustancia por vía subcutánea ha sido la dificultad en administrarlo por vía digestiva o por absorción de mucosas. El grupo control del modelo metanfetamina es isopair-fed respecto del grupo tratado. Para explicar esto, hay que concretar que el consumo de esta sustancia provoca una alteración en el hábito alimenticio, disminuyendo la ingesta de alimentos por los animales experimentales. Por ello, a los animales del grupo control se les suministra la misma cantidad de alimento que a los experimentales, con el fin de evitar diferencias entre ambos grupos debidas a un distinto aporte energético que dificulte o facilite los distintos procesos fisiológicos que tienen lugar durante el período de desarrollo.

En el grupo experimental tratado con EtOH, se administró a las ratas madres una dieta líquida que contiene el 5% de etanol (peso/volumen) de forma que este constituya el 35% de las calorías diarias. Esta dieta se administra durante 6 semanas para lograr que los animales sean alcohol-dependientes. A partir de aquí se unen a machos Wistar, y se determinan los días de gestación mediante lavado del flujo vaginal. Después del nacimiento de la descendencia se les sigue administrando, tanto a madres como a crías, la dieta líquida con alcohol hasta el día de sacrificio. En cuanto al grupo control del modelo alcohol, debemos decir que es isocalórico respecto al grupo tratado. De esta forma evitamos que las diferencias que se puedan observar entre ambos grupos se puedan ver influidas por un distinto aporte energético que dificulte o facilite los distintos procesos fisiológicos que tienen lugar durante el período de desarrollo.

Obtención y procesamiento de muestras oculares

Una vez finalizada la experimentación con los animales de los dos modelos procedemos a la obtención de las muestras. Los animales se sacrificaron tras perfundir con suero salino 0,9% caliente y realizando prefijación con formol. Posteriormente se extrae el globo ocular y el nervio óptico del animal. Según el procedimiento a seguir unas muestras se destinaron a métodos de fijación-inclusión y se clasificaron hasta su utilización, y otras muestras se congelaron y almacenaron a –85ºC.

En el primer caso, mediante técnicas de microcirugía se separan la retina y el nervio óptico y se fijan en una solución de glutaraldehído 2% y formaldehído 3% en tampón cacodilato, 0,1 Molar y pH 7,4, realizando deshidrataciones en concentraciones crecientes de etanol para finalmente incluirlas en resina EPON y realizar cortes semifinos y ultrafinos que se examinarán mediante las tinciones específicas para microscopía óptica y electrónica de transmisión, según descripciones previas (7) para estudiar la morfometría del nervio óptico.

En el segundo caso, cada muestra se mezcla con 5 volúmenes de tampón de lisis para facilitar la ruptura celular, y homogeneizar el material. Con este proceso lo que obtenemos es una suspensión uniforme, de la cual necesitamos conocer la cantidad de proteína utilizando el ensayo de proteínas del ácido bicinchonínico (BCA Sigma Aldrich), para así poder pasar a realizar la técnica de Western Blot, que nos permitirá determinar las proteínas implicadas en el desarrollo neural. Este ensayo nos sirve para medir la cantidad de proteína en general que tiene una determinada solución.

Una vez determinada la concentración proteica de las muestras ya podemos calcular el volumen adecuado que tenemos que usar para poder realizar la técnica Western Blot.

Las proteínas que hemos estudiado mediante el Western Blot, implicadas en el desarrollo neural, son:

— GFAP (Glial Fibrilaric Acidic Protein 45-50KD) que marca las células glíales en el nervio óptico, y en la retina los astrocitos, oligodendrocitos y células de Müller.

— NFP (Neurofilament Protein 200KD) que marca los axones en el nervio óptico y en la retina.

— MBP (Myelin Basic Protein 33KD) que señala la vaina de mielina que recubre las fibras ópticas que forman el nervio óptico.

Con los grupos de animales tratados y controles, y aplicando la metodología que hemos explicado anteriormente, hemos obtenido los siguientes resultados.

Modelo de exposición prenatal a EtOH

Mediante el estudio de la proteína GFAP hemos observado el desarrollo de los astrocitos. En el nervio óptico observamos en todos los días del estudio (p7, p14, p21) una disminución de la astroglía en el grupo tratado con el alcohol, pero sólo es estadísticamente significativa en el día 14, mientras que en el día 21 casi llega a igualarse al correspondiente control. También, en el estudio de esta proteína, hemos observado que en la retina es altamente significativa la disminución de la actividad glial en los días 7 y 14. En el día 21 ambos grupos se igualan (fig. 1).

Fig. 1. Expresión de la proteína GFAP en nervio óptico y retina de rata en grupos alcohol y control.

En el caso de la proteína NFP en el nervio óptico, hemos apreciado una expresión creciente a lo largo del desarrollo, pero con una disminución en el grupo EtOH respecto al control en todos los días del estudio. De forma similar, existe una disminución ostensible de la expresión de la proteína en el grupo tratado frente al control en la retina (fig. 2).

Fig. 2. Expresión de la proteína NFP en nervio óptico y retina de rata en grupos alcohol y control.

La expresión de la proteína MBP en el nervio óptico aumentó durante el desarrollo postnatal, sin embargo en el grupo etanol se mantuvo constante y no sufrió aumento a lo largo del tiempo estudiado. Además, se apreció que el patrón de expresión de la mielina en el grupo alcohol es distinto al del grupo control (fig. 3).

Fig. 3. Expresión de la proteína MBP en nervio óptico de rata en grupos alcohol y control.

Modelo de exposición a drogas psicoestimulantes, MA («ice»)

Los resultados de las medidas realizadas del área de la sección transversal del nervio óptico muestran que en el grupo metanfetamina el área de la sección transversal del nervio óptico es menor que en el grupo control, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa.

El número de núcleos de las células gliales por sección fue menor en el grupo control, pero las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas.

La densidad volumétrica de los paquetes de las fibras nerviosas fue significativamente menor en el grupo control (fig. 4).

Fig. 4. Microfotografías del nervio óptico de rata grupo control y metanfetamina.
Las imágenes de la parte superior muestran la diferencia en el radio del nervio óptico entre
el grupo control y mentafetamina. En las imágenes de la parte inferior se observa
la diferencia en la mielinización del nervio óptico entre ambos grupos.

La comparación de resultados entre los dos modelos experimentales de exposición a tóxicos, nos permite estudiar los mecanismos de acción de las substancias y las variaciones entre ambos tóxicos al repercutir sobre los tejidos oculares.

El alcohol se administró por vía oral, en dieta líquida, siguiendo el modelo descrito por Lieber (8) y que ha demostrado que provoca los mismos síntomas de alcoholismo crónico en las ratas, extrapolable a los humanos. Diversos trabajos han corroborado esta forma de administración tanto en animales (9,10) como en humanos (2-11). Aunque la vía de administración de la MA difiere del humano, la concentración que alcanza en sangre y tejidos fetales de la rata en este modelo experimental, es extrapolable a la que alcanza la droga en el hombre, salvando la escala filogenética. Estos datos han demostrado que la MA por vía subcutánea induce anomalías comparables a las alteraciones del comportamiento y lesiones en el desarrollo del Sistema Nervioso en niños con el Síndrome Tóxico Gestacional (12).

Los resultados obtenidos por la intoxicación mediante alcohol con la proteína GFAP deben dar lugar a un nuevo estudio para conocer porqué en el último día de estudio los niveles se igualan con el grupo control, tanto en la retina como en el nervio óptico. Si centramos nuestra atención con la proteína NFP los resultados son muy aclaratorios de que realmente en el grupo alcohol se sufre una disminución del número de fibras ópticas, tanto en la retina como en el nervio óptico, mermando así gravemente el sistema visual (13). En la última proteína a estudio, MBP, se observa que el abuso de alcohol provoca un cambio en el patrón de expresión de la proteína durante el período postnatal. Esta proteína es la mielina, que recubre las fibras ópticas y es necesaria para el buen funcionamiento de estas. Entonces, la disminución de la cantidad de mielina también puede ser debida al menor número de fibras ópticas (14).

En los resultados obtenidos en la intoxicación mediante metanfetamina se pueden observar las diferencias que existen entre el grupo control y el grupo metanfetamina, las cuales ponen de manifiesto y justifican el mayor diámetro del nervio óptico en el grupo control (15,16).

Por último, tras este estudio podemos concluir que el alcohol induce un retraso severo en el desarrollo de la retina y el nervio óptico, provocando también alteraciones ultraestructurales. Razón por la cual se puede decir que es un agente teratogénico para la retina y el nervio óptico de la rata, corroborando los resultados de Pinazo-Durán (7).

Después de estudiar la intoxicación por metanfetamina, podemos concluir que induce un retraso en el desarrollo y anomalías en la mielinización del nervio óptico de la rata, siendo una sustancia nociva para el desarrollo del sistema visual.

Ambas substancias deben ser evitadas durante el período gestacional en evitación de efectos no deseados.

1. Pinazo-Durán MD, Renau-Piqueras J, Guerri C. Efecto de la exposición intrauterina y postnatal al alcohol sobre el desarrollo del nervio óptico en la rata. Arch Soc Esp Oftalmol 1992; 63: 225-232.        [ Links ]

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6. Pinazo-Durán MD, Guerri C, Renau-Piqueras J. Efectos diferidos del alcohol prenatal en el globo ocular de la rata adulta. Consideraciones sobre los mecanismos reparadores. Arch Soc Esp Oftalmol 1997; 72: 545-552.        [ Links ]

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Dirección para correspondencia:
M.D. Pinazo-Durán
Unidad de Investigación Oftalmológica «Santiago Grisolía»
Edificio de Consultas externas. 1.ª planta. Hospital Universitario Dr. Peset
Avenida Gaspar Aguilar, 90
46017 Valencia
España
E-mail: pinazoduran@yahoo.es

Recibido: 5/4/06.
Aceptado: 17/1/07.