Introducción

En los trasplantes de tejidos compuestos (TTCs) se transfieren tejidos vascularizados antigénicamente heterogéneos. Los TTCs de miembros están formados por la piel, el tejido subcutáneo, nervioso, muscular, tendinoso, fascial, cartilaginoso, óseo y la médula ósea vascularizada (MOV).

Los protocolos convencionales de inmunosupresión (IS) mantienen al receptor en un "estado de ignorancia" frente al aloinjerto y contribuyen al éxito clínico del trasplante. La IS puede prevenir o revertir los episodios de rechazo agudo (RA). Sin embargo, el aloinjerto sigue expuesto a la aparición de rechazo crónico (RC) o vasculopatía crónica del aloinjerto. El RC se caracteriza por vasculopatía fibroproliferativa y fibrosis tisular del órgano trasplantado. La estenosis de la luz vascular puede producirse por un engrosamiento difuso y concéntrico de la íntima conocido como hiperplasia intimal, o por una fibrosis de la adventicia.⁽¹⁾ Las lesiones histopatológicas del RC son en gran medida irreversibles y producen progresivamente la disfunción del aloinjerto.⁽¹⁾ Si bien se desconoce la relación exacta entre el RA y el RC y los mecanismos moleculares que los regulan, los episodios de RA aceleran el desarrollo de RC tanto en trasplante de órgano sólido (TOS) como en modelos de TTC.^(1,2) Los fenómenos de RC pueden observarse en modelos experimentales de trasplante cuando se utiliza IS a dosis sub-terapéuticas.⁽³⁾

La MOV que aportan los huesos de los aloinjertos en los TTCs se integra en el espacio vascular del receptor tras la revascularización del aloinjerto.⁽⁴⁾ Las células madre de médula ósea (CMMO) del donante generan un estado de quimerismo sistémico en la sangre periférica, la médula ósea y los tejidos linfoides del receptor que puede contribuir a la inducción de tolerancia específica frente al donante.⁽⁵⁾ La tolerancia del trasplante podría definirse como la falta de respuesta inmunitaria del receptor frente a antígenos específicos del donante sin la necesidad de IS crónica para su mantenimiento, preservando intacta la respuesta inmunitaria frente al resto de los antígenos.⁽⁵⁾ Los linfocitos derivados de las CMMO del donante pueden contribuir a prolongar la supervivencia a largo plazo del aloinjerto mediante la regulación negativa de la respuesta inmunitaria del receptor específica frente al donante.⁽⁶⁾

El tráfico celular desde el receptor hacia el aloinjerto puede producirse mediante un fenómeno conocido como quimerismo reverso (QR) o quimerismo del aloinjerto. El QR consiste en la repoblación del aloinjerto por células del receptor. Hasta el momento se desconoce qué tipos de células son las responsable de la producción de QR, así como los mecanismo moleculares que lo regulan en los TTCs.⁽⁷⁾ Sin embargo, se especula que las CMMO del receptor en sangre periférica y que circulan a través del aloinjerto podrían diferenciarse en los diferentes fenotipos celulares que lo componen.⁽⁸⁾

El factor derivado del estroma 1 (SDF-1; CXCL12) es una citoquina multifuncional que pertenece a la familia de quimiocinas CXC y se expresa de forma constitutiva en células del estroma de la médula ósea (MO). El receptor de SDF-1, CXCR4, se expresa en diferentes tipos celulares entre los que se encuentran las CMMO CD34+ que juegan un papel crítico en la supervivencia, proliferación, migración y mantenimiento celular.⁽⁹⁾ Plerixafor es un fármaco antagonista del receptor alfa de la citoquina CXCR4 e impide la unión de SDF-1. Su administración produce la movilización de CMMO a sangre periférica. Por este motivo se ha utilizado en casos de linfoma y mieloma múltiple de tal manera que las CMMO CD34+ puedan extraerse, conservarse e infundirse de nuevo tras la finalización de tratamientos mieloablativos.

El objetivo del estudio fue evaluar la expresión de citoquinas en un modelo experimental de RC en aloinjertos osteomusculares heterotópicos de pata posterior de rata, sometidos a IS subterapéutica con tacrólimus, tras la movilización de CMMO CD34+ con plerixafor. Además se establecieron los siguientes objetivos secundarios: analizar el infiltrado leucocitario cualitativamente y cuantitativamente en el tercio medio del tejido muscular del aloinjerto, el grado de RC en los vasos femorales y del tercio medio y distal del tejido muscular del aloinjerto, y el porcentaje de QR en la MO del aloinjerto.

Material y método

Extracción del aloinjerto

El aloinjerto se extrajo a nivel de la raíz de la pata posterior de la rata, tomando los vasos femorales como pedículo (Fig. 1).

Fig. 1. Extracción del aloinjerto. Izquierda: disección de los vasos femorales a nivel de la ingle y de los vasos tibiales anteriores y posteriores a nivel del tobillo. Derecha: extracción del aloinjerto. 

Técnica quirúrgica en el animal receptor

En la rata receptora disecamos los vasos femorales como vasos receptores. Las anastomosis arterial y venosa las realizamos mediante técnica término-terminal. Tras comprobar la patencia vascular del aloinjerto procedimos a la eliminación de la totalidad del componente cutáneo y posterior acomodación heterotópica subcutánea a nivel abdominal (Fig. 2).

Fig. 2.  Técnica quirúrgica en el animal receptor. Superior izquierda: fijación del aloinjerto. Superior derecha: desepidermización del aloinjerto tras patencia vascular positiva. Inferior izquierda: acomodación heterotópica subcutánea abdominal del aloinjerto. Inferior derecha: cierre de la zona receptora. 

Protocolo de extracción de los aloinjertos

Transcurridas 9 semanas post-trasplante recuperamos los aloinjertos para su procesado y análisis (Fig. 3). Posteriormente sacrificamos los animales receptores.

Fig. 3.  Extracción del aloinjerto a las 9 semanas post-trasplante. 

Valoración del infiltrado leucocitario

• -Cualitativa. Realizamos una valoración subjetiva del infiltrado leucocitario en muestras del tercio medio del tejido muscular con tinción de hematoxilina-eosina (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y una magnificación de x100. El muestreo lo llevaron a cabo 2 observadores independientes en 5 cortes seleccionados de manera aleatoria para cada aloinjerto. La escala utilizada fue: 0 = Ausencia; 1 = Leve; 2 = Moderado; 3 = Intenso.

• -Cuantitativa. Realizamos un estudio inmunohistoquímico (IHQ) de los antígenos leucocitarios CD3, CD4, CD8, CD20 y CD68 a nivel del tercio medio del tejido muscular del aloinjerto con el objetivo de identificar los subtipos celulares. Para ello desenmascaramos los antígenos leucocitarios con un protocolo ajustado para cada anticuerpo primario mediante el sistema PTLink Dako® (Pre-Treatment). El equipo de tinción empleado fue el Autostainer Plus de Dako® siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los resultados mostraron los núcleos celulares en azul-violeta y las células positivas en marrón.

Escogimos 5 cortes aleatorios por aloinjerto y muestreamos 2 áreas de 90000 μm2 por corte, con una magnificación de x200. Consideramos positivas para el contaje aquellas células que mostraban núcleo y citoplasma. El muestreo se llevó a cabo por 2 observadores independientes (Fig. 4).

Fig. 4.  Valoración cuantitativa del infiltrado leucocitario. Superior: tinción IHQ CD4 (x200). Inferior: tinción IHQ CD68 (x200). 

RESULTADOS

Resultados de la expresión de citoquinas

Las concentraciones de citoquinas con diferencias significativas a nivel del tercio medio y distal del aloinjerto están representadas en diagrama Box-Plot en las Fig. 7 -9.

Fig. 7.  Representación Box-Plot de la concentración de G-CSF en tercios medio y distal. 

Fig. 8.  Representación Box-Plot de la concentración de IL-6 en tercio medio. 

Fig. 9.  Representación Box-Plot de la concentración de IL-12 en tercios medio y distal. 

Resultados del rechazo crónico

Todas las muestras estudiadas presentaron signos histopatológicos de RC. Los resultados de cada una de las muestras a nivel de los vasos femorales y de los vasos del tercio medio y distal del aloinjerto expresados como PI y PPA están representados en las Fig. 12 y 13. No encontramos diferencias significativas entre ambos grupos.

Fig. 12.  Resultados de la PI en los vasos femorales y en los tercio medio y distal del aloinjerto. 

Fig. 13.  Resultados del PPA en los vasos femorales y en los tercio medio y distal del aloinjerto. 

Resultados del quimerismo reverso

El porcentaje medio de QR en el grupo I y en el grupo II fue 85.61% ± 16.41% y 88.40% ± 16.97%, respectivamente (Fig. 14). No encontramos diferencias significativas entre ambos grupos.

Fig. 14.  QR en MO del aloinjerto expresado como porcentaje de células del receptor y del donante. 

Discusión

Las CMMO del donante tienen un efecto inmunorregulador favoreciendo la tolerancia del aloinjerto tras la producción de quimerismo sistémico hematopoyético en el receptor.⁽¹¹⁾ Se ha hipotetizado que el QR también podría promover la aceptación del aloinjerto por el receptor.⁽¹²⁾ Entre los mecanismos moleculares que regulan el rechazo y la tolerancia del aloinjerto se encuentran las citoquinas.⁽¹³⁾ Sin embargo, se desconoce el patrón específico de expresión de citoquinas tras un TTC así como su relación con el RC y el QR.⁽¹³⁾ Nuestros resultados muestran la presencia de RC y QR en MO en todos los aloinjertos. Además, la expresión de citoquinas en el tejido muscular del aloinjerto muestra una disminución significativa de G-CSF, IL-6 e IL-12. Estos cambios en el patrón de expresión de citoquinas podrían deberse al efecto regulador de la respuesta inmunitaria de las CMMO CD34+ movilizadas por plerixafor.

La transferencia de células de MO a través de los aloinjertos óseos vascularizados y los TTCs de miembros favorece la producción de quimerismo sistémico linfohematopoyético en el receptor, lo que se ha relacionado con una regulación negativa de la respuesta inmunitaria frente al aloinjerto y la supervivencia a largo plazo del tejido trasplantado.⁽¹¹⁾

La falta de homogeneidad en el diseño de los estudios experimentales y clínicos de TOS y TTCs es uno de los problemas que impide establecer un patrón específico de expresión de citoquinas en el aloinjerto ni relacionarlo directamente con el rechazo y la tolerancia.⁽¹⁴⁾ Se ha sugerido que la respuesta de los linfocitos T helper 1 (Th1) podría relacionarse con los episodios de rechazo, mientras que los linfocitos Th2 podrían estar involucradas en la generación de estados de tolerancia.⁽¹⁵⁾ Wu y col. observaron una mayor expresión de IL-1β, IL-2, IL-6, IFN-γ y TNF-α en aloinjertos cardiacos con rechazo.⁽¹⁶⁾ Van Hoffer y col. demostraron niveles aumentados de IL-2, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12 en aloinjertos cardiacos de pacientes con rechazo.⁽¹⁷⁾ De Mattos y col. identificaron expresión de IL-12 en aloinjertos renales durante los episodios de RA.⁽¹⁸⁾ No hay evidencia acerca de los niveles de expresión de G-CSF en los aloinjertos de TOS ni de TTCs. Sin embargo, Vrtovec y col. concluyeron que la administración exógena de G-CSF parecía estar asociada con una menor incidencia de RA y RC en aloinjertos cardiacos, sugiriendo un potencial efecto modulador de la respuesta inmunitaria.⁽¹⁹⁾

La regeneración celular del aloinjerto puede activarse para reparar los tejidos lesionados por la respuesta inmunitaria del receptor y la lesión por isquemia y reperfusión.⁽¹³⁾ Además, en los TTCs de miembros esta agresión se ve agravada por la osteotomía y la denervación del aloinjerto.⁽²⁰⁾ Diferentes autores como Olthoff o Miyake han sugerido que las citoquinas, la activación de factores de transcripción y la expresión de genes moduladores del ciclo celular están implicados en los mecanismos de regeneración celular.^(21,22) Olthoff estudió los mecanismos de regeneración celular en aloinjertos hepáticos observando que las células de Kupffer son una fuente primaria de IL-6 y factores de crecimiento tras el trasplante, implicados en el inicio de la regeneración hepática.⁽¹³⁾

La disminución significativa de IL-6 e IL-12 en los aloinjertos del grupo sometido a tratamiento movilizador de CMMO CD34+ con plerixafor observada en nuestros resultados podría estar relacionada con la presencia de un menor número de episodios de RA asociado al efecto modulador de la respuesta inmunitaria producido por las CMMO circulantes. Además, si suponemos que el daño tisular generado por los episodios de rechazo ha sido superior en el grupo no sometido a tratamiento movilizador de CMMO CD34+ con plerixafor, los valores de IL-6 también podrían verse incrementados como señal de una mayor regeneración tisular.

Diferentes teorías centradas en el QR intentan explicar el proceso que hace que el aloinjerto sea gradualmente menos inmunogénico. Medawar fue el primero en hipotetizar que la aceptación del aloinjerto podría ser el resultado del reemplazo endotelial de las células del aloinjerto por las del receptor, lo que se conoce como QR endotelial.^(12,23) Sin embargo, la función del aloinjerto depende de células especializadas que también pueden ser objeto de reemplazo, lo que se conoce como QR órgano específico.⁽²³⁾ Muramatsu y col. evidenciaron histológicamente en TTCs en ratas valorados a los 18 meses post-trasplante que el QR se producía gradualmente en la piel, el endotelio y la MO, pero la mayor del parte del periostio y del tejido muscular seguía estando formado por células del donante.⁽²⁴⁾ Mathes y col. encontraron que el QR en MO de TTCs en cerdos era progresivo y llegaba a ser completo a las 48 semanas post-trasplante.⁽²⁵⁾ Nuestros resultados muestran unos porcentajes de QR en MO evaluado a las 9 semanas post-trasplante que varían entre el 85% y el 88%, lo que confirma que el que el QR en MO del aloinjerto se produce de forma precoz y es independiente del tratamiento movilizador de CMMO CD34+ con plerixafor.

Entre otras limitaciones de nuestro estudio encontramos el tamaño muestral, ya que impidió detectar con suficiente potencia diferencias cuya significancia podría haberse alcanzado con un mayor tamaño. Además, el modelo de IS subterapéutica no se corresponde con la práctica clínica de la trasplantología pero permitió la generación de RC e incrementar los mecanismos de daño y regeneración celular.

Conclusiones

Encontramos disminuida significativamente la expresión de G-CSF, IL-6 e IL-12 en el tejido muscular del aloinjerto en el grupo sometido a tratamiento movilizador de CMMO CD34+ con plerixafor.

Las conclusiones obtenidas de los objetivos secundarios son: