Influencia del rofecoxib sobre la carcinogénesis cólica experimental en ratas

J. F. Noguera Aguilar, A. Plaza Martínez¹, I. Amengual Antich², J. M. Morón Canis³, C. Tortajada Collado⁴ y
J. J. Pujol Tugores⁵

IUNICS. Unidad de Cirugía General. Hospital Son Llàtzer. Baleares. ¹Servicio de Cirugía Vascular. Hospital Universitario
Dr. Peset. Valencia. ²Servicio de Anatomía Patológica. Fundación Hospital de Manacor. Valencia. ³Servicio de Cirugía
General. Hospital Universitario Son Dureta. ⁴Enfermería. Hospital Son Dureta. ⁵Servicio de Cirugía General y Aparato
Digestivo. Hospital Son Llàtzer. Baleares

 

RESUMEN

Objetivo: investigar el efecto de un inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa-2, rofecoxib, en la incidencia de tumores cólicos a nivel experimental.
Diseño experimental: estudio experimental con 35 ratas Sprague-Dawley macho, asignadas aleatoriamente a uno de los cuatro grupos: a) control (n=5), sin manipulación experimental; b) carcinogénesis farmacológica (n=10); c) carcinogénesis farmacológica y ácido acetilsalicílico (n=10), con administración de este fármaco al tiempo de la carcinogénesis farmacológica; y d) carcinogénesis farmacológica y rofecoxib (n=10) con administración de este fármaco junto a la carcinogénesis farmacológica. La inducción carcinogénica se realizó con 1-2 dimetilhidrazina dihidrocloruro a dosis semanal de 25 mg/kg de peso durante 18 semanas. Se analizaron los tumores cólicos inducidos en la semana 20. Los antiinflamatorios se administraron por vía oral a razón de ácido acetilsalicílico 30 mg/kg de peso del animal y rofecoxib 3 mg/kg.
Resultados: el porcentaje de tejido tumoral cólico fue inferior en el grupo con rofecoxib respecto al grupo control, tanto considerando todos los tumores conjuntamente como los adenocarcinomas por separado. El ácido aceetilsalicílico no mostró diferencias significativas respeto al grupo control.
Conclusiones: el rofecoxib, inhibidor seletivo de la ciclooxigenasa-2, reduce la aparición de tejido glandular neoplásico inducido farmacológicamente en ratas, suponiendo un freno a la carcinogénesis cólica inducida.

Palabras clave: Rofecoxib. Cáncer colorrectal. Rata. Adenocarcinoma. Ácido acetilsalícilico. Ciclooxigenasa.

 

INTRODUCCIÓN

El cáncer colorrectal (CCR) es el cáncer digestivo más frecuente en Europa Occidental y los Estados Unidos (1) y la segunda causa de muerte en el mundo occidental (2). Nuestro país presenta una incidencia de 20-30 casos por 100.000 habitantes y año, siendo responsable del 20% de las muertes por procesos malignos (3,4). El CCR presenta una supervivencia global del 60% a los 5 años (5).

Existen fundamentalmente dos estrategias en la prevención del CCR: la detección precoz de la enfermedad y de las lesiones premalignas, y la quimioprevención. El tratamiento precoz de las lesiones premalignas o malignas en estadio inicial, disminuye la incidencia y la mortalidad por CCR (6-8). La quimioprevención es la utilización de agentes químicos (farmacológicos o no) para prevenir el desarrollo del proceso de carcinogénesis. Se han propuesto diversos agentes que podrían actuar como posibles quimiopreventivos del CCR, entre ellos destacan fármacos como los inhibidores de la cicloxigenasa-2 (COX-2).

La ciclooxigenasa (COX) es la enzima que cataliza los dos primeros pasos de la síntesis de prostaglandinas a partir de ácido araquidónico. Existen dos isoformas de COX, estructuralmente similares y que catalizan la misma reacción química, pero que actúan en lugares y momentos diferentes: la COX-1 es constitutiva y está presente siempre en todos los tejidos, mientras que la COX-2 es inducible por varios estímulos generalmente asociados con la inflamación aguda o crónica (9-11).

La actividad COX-2 parece relacionada con la proliferación neoplásica en criptas aberrantes del colon, por inhibir la apoptosis o muerte celular programada de las células tumorales, por frenar la función de los linfocitos T-NK ("natural killer") y por favorecer la expansión tumoral induciendo la angiogénesis en el tumor (12). La COX-2 es inducible por oncogenes ras y scr, interleukina-1, hipoxia, benzopireno, luz ultravioleta, factor de crecimiento epidérmico y factor de necrosis tumoral alfa. La dexametasona, sustancias antioxidantes y la proteína p53 suprimen la expresión de la COX-2. La isoenzima COX-2 sintetiza prostaglandina E2 (PGE2) que inhibe la apoptosis y se asocia con la aparición de metástasis tumorales. Además, induce la interleukina-6 (IL-6) que se relaciona con la invasión de las células cancerosas y la haptoglobina, que estimula la angiogénesis y la implantación de dichas células.

La sobreexpresión de COX-2 se ha observado en tumores de colon; por consiguiente, los inhibidores específicos de la COX-2 podrían servir como agentes preventivos. Múltiples estudios han logrado aislar la enzima COX-2 del estroma de los adenomas y del estroma y del epitelio de los CCR (13-15), incluso algunos autores han relacionado la extensión de la expresión COX-2 con la supervivencia del CCR (16).

El presente estudio pretende valorar si existe un efecto inhibidor del rofecoxib sobre la carcinogénesis inducida. Este fármaco es un inhibidor selectivo de la COX-2, con una despreciable capacidad para inhibir la COX-1. Como objetivo secundario se pretende valorar si este efecto es mayor con el rofecoxib que con el ácido acetilsalicílico (AAS), inhibidor este último no selectivo de la COX.

Se inducirá carcinogénesis farmacológica, para dilucidar el efecto protector del rofecoxib y del AAS en el desarrollo tumoral inducido. La carcinogénesis inducida con 1-2 dimetilhidracina dihidrocloruro (DMH) provoca la formación de focos de criptas aberrantes en el epitelio intestinal y promociona la carcinogénesis tras su inducción. Este epitelio displásico sobreexpresa la COX-2 por lo que los inhibidores específicos de la COX-2 pueden tener un efecto supresor sobre los tumores colónicos inducidos.

MATERIAL Y MÉTODOS

En el estudio se emplearon 35 ratas Sprague-Dawley macho (Criffa, España), con un peso medio de 225 g (rango 165-300 g), distribuidas en cuatro grupos: a) cinco animales en el grupo tomado como control estricto, sin manipulación experimental, y diez animales en cada grupo experimental; b) grupo con carcinogénesis farmacológica (n=10); c) grupo con modulación con AAS (n=10); y d) grupo con modulación con rofecoxib (n=10). La inducción carcinogénica de las neoplasias colónicas se realizó con DMH (Sigma-Aldrich, España). La administración simultánea de antiinflamatorios no esteroideos (AINE) se realizó con AAS por vía oral disuelto en el agua de bebida (Aspirina^®, Bayer, España) y con rofecoxib oral, disuelto en agua de bebida (Vioxx^®, MSD, España).

Condiciones dietéticas y ambientales

Las ratas fueron alojadas en jaulas tipo III (Criffa, España), con dos animales por jaula. Las condiciones ambientales del estabulario fueron: periodo luz/oscuridad de 12/12 horas (luz de 8,00 am- 8,00 pm); temperatura homogénea de 22 ± 2 ºC, y humedad relativa del 60-70%. La dieta suministrada fue dieta de mantenimiento A.04 (Panlab, España).

Se cumplieron las directrices marcadas por el Real Decreto 223/1998 y por la Directiva de la Unión Europea 86/609/CEE, sobre la protección de animales utilizados para experimentación.

Inducción carcinogénica y administración de AINE

Los tumores de colon se indujeron mediante la administración semanal de una dosis de 25 mg de DMH/kg de peso por inyección subcutánea durante 18 semanas. Los AINE se administraron a una dosis diaria de 3 mg/kg de rofecoxib o de 30 mg/kg de AAS.

Seguimiento y sacrificio

Se examinaron los animales semanalmente, prestando atención especial a su peso, perímetro abdominal, presencia y calidad de las deposiciones y aparición de rectorragias. Todos los animales fueron sacrificados en la semana 20 tras la intervención farmacológica y el colon fue examinado en busca de tumores en el colon. El sacrificio se realizó con sobredosis anestésica y se practicó una laparotomía media buscando la existencia de tumores extradigestivos o de tumores macroscópicos en el intestino delgado. El colon fue extirpado en su totalidad, desde el ano hasta el ciego incluyendo además 1 cm de intestino delgado terminal. Las piezas fueron fijadas en solución de formol al 10% para su examen histológico.

Estudio de los tumores cólicos

Se examinó todo el intestino grueso de cada animal, buscando tumores macroscópicos y microscópicos para determinar tres parámetros: número de tumores, superficie tumoral y porcentaje de superficie tumoral (porcentaje de superficie cólica ocupada por tejido tumoral). La superficie y porcentaje tumoral se determinaron por ser más fieles indicadores de la cantidad de tejido tumoral que el mero tamaño del tumor. En el estudio histológico de las piezas colónicas se determinaron los parámetros descritos, evaluando además el tipo histológico de cada tumor, el grado histológico, la invasión tumoral y la afectación ganglionar.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron con los programas SPSS y G-Stat, y el análisis estadístico se realizó con modelos Anova unifactorial y Chi-cuadrado.

RESULTADOS

Se ha considerado por separado el grupo control estricto (n=5) en el que no se realizó ninguna manipulación. En este grupo, tras haberse mantenido en las mismas condiciones dietéticas y ambientales que el resto de animales, la incidencia espontánea de tumores cólicos o extracolónicos fue nula. Se analizan a continuación los resultados obtenidos en los 30 animales restantes, repartidos en los tres grupos experimentales a los que expusimos a la inducción carcinogénica (n=10), a la modulación con el AAS (n=10) o a la modulación con el rofecoxib (n=10).

Mortalidad

La mortalidad global del estudio fue del 0%. No hubo mortalidad atribuible a las neoplasias cólicas inducidas ni derivada de la administración del carcinógeno o de los AINE.

Alteraciones al tránsito cólico

No aparecieron alteraciones del tránsito gastrointestinal y el estudio macroscópico del colon tras el sacrificio de los animales no detectó ninguna neoplasia que fuera total o parcialmente estenosante.

Número de tumores

Se halló un total de 57 tumores cólicos en los 30 animales estudiados, con una media de 1,9 tumores por animal. De estos 57 tumores, 30 fueron tumores malignos, adenocarcinomas, y 27 fueron adenomas. La distribución de estos tumores se describe en la tabla I. No hubo diferencias significativas entre los grupos en relación con la incidencia de tumores malignos o benignos.

Superficie tumoral microscópica

En el conjunto de los animales se obtuvieron 16,47 cm² de superficie cólica tumoral. De estos, 7,34 cm² correspondían a tumores benignos y el resto, 9,13 cm², a adenocarcinomas. La media de la superficie tumoral fue mayor en el grupo con carcinogénesis inducida que en los grupos con AAS o con rofecoxib, tanto para todos los tumores considerados en conjunto, como para los adenomas y adenocarcinomas por separado. Las diferencias sólo fueron significativas entre los grupos con carcinogénesis inducida y con rofecoxib cuando se analizan conjuntamente todos los tumores, tanto los benignos como los malignos. En el grupo con rofecoxib disminuyó de forma significativa la formación de neoplasias benignas y malignas inducidas farmacológicamente (p<0,05). Las diferencias, sin embargo, no fueron significativas cuando se analizaron por separado los tumores benignos y malignos, así como tampoco lo fueron las diferencias en el grupo de animales tratados con AAS (Fig. 1).

Porcentaje tumoral microscópico

Si consideramos los AINE en conjunto, AAS y rofecoxib, y analizamos todos los tumores estudiados, benignos y malignos, se consigue con los AINE una reducción significativa (p < 0,05) en el porcentaje microscópico tumoral, respecto al grupo de ratas tratadas sólo con DMH. Esta situación cambia cuando se consideran los AINE por separado o cuando analizamos independientemente los tumores benignos o malignos. El porcentaje tumoral medio fue mayor en el grupo con carcinogénesis con DMH que en los otros dos grupos. En el grupo en el que se administró rofecoxib para modular la carcinogénesis farmacológica, se consiguió una reducción significativa en el porcentaje tumoral, que es el parámetro más fiable como expresión de la cantidad de tumor provocado. Esta reducción se produjo tanto en los tumores considerados en su conjunto como en los adenocarcinomas (p=0,038, LSD y Scheffé, Anova unifactorial de comparación de medias), si bien en los adenomas esta reducción no fue significativa. En el grupo tratado con AAS se produjo también una disminución en la carcinogénesis, pero este cambio no alcanzó significación estadística (Fig. 2).

Estudio histológico

Al realizar este estudio nos encontramos con varias situaciones diferentes: presencia de adenocarcinoma, presencia de adenoma, nodularidad colónica con mucosa normal y presencia de hiperplasia linfoide en la pared cólica. La hiperplasia linfoide se encontró asociada con cualquiera de las situaciones mencionadas.

Los adenomas (n=27) representaron el 47,37% de los tumores inducidos, de los que en 24 casos hallamos hiperplasia linfoide asociada a los adenomas (88,89%). También hallamos 30 adenocarcinomas, el 52,63% de los tumores inducidos. En 20 de estos casos (66,66%), estas lesiones se encontraban asociadas a hiperplasia linfoide. Los adenocarcinomas estaban bien diferenciados en el 53,33% de los casos, moderadamente diferenciados en 16,67% y pobremente diferenciados en el 30% restante (Tabla II). En cuanto al nivel de invasión, la mayoría de los adenocarcinomas (53,33%) alcanzaban la submucosa, eran "in situ" el 30% e invasores más allá de la submucosa el 16,66% (Tabla III). Se aislaron un total de 120 ganglios epicólicos (4 por rata), de los que 7 (5,8%) albergaban micrometástasis de adenocarcioma. Ninguna de las diferencias entre los grupos en relación a estos parámetros fue relevante.

DISCUSIÓN

La primera evidencia de la relación entre los AINE y el cáncer de colon procede de un estudio epidemiológico realizado por Kune, en 1988 (17), donde se observa una menor incidencia de CCR en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal que tomaban crónicamente sulfasalazina.

Existen más de 100 estudios publicados que evalúan la eficacia de los AINE en la quimioprevención del CCR inducido farmacológicamente en modelos animales y en más del 85% de ellos se demuestra que los AINE reducen la incidencia y la multiplicidad de estos tumores (18,19). En nuestro estudio hemos podido comprobar cómo considerando los dos AINE conjuntamente, AAS y rofecoxib, y analizando todos los tumores estudiados, benignos y malignos, se consigue con los AINE una reducción significativa (p < 0,05) en el porcentaje microscópico tumoral, en relación con el grupo tratado sólo con DMH. Este hallazgo aislado no aporta nada nuevo, ya que bien es conocido el efecto de los AINE en la prevención de la carcinogénesis colorrectal.

En cuanto a los inhibidores selectivos de la COX-2, la primera evidencia experimental de su eficacia la hallamos en estudios realizados en ratones Min (multiple intestinal neoplasia), que poseen una mutación dominante del gen APC (poliposis cólica adenomatosa) y que se caracterizan por desarrollar múltiples adenomas intestinales a edades tempranas (20). En estos animales, la administración de celecoxib frente a piroxicam produce una mayor disminución del número de adenomas. Del mismo modo, la administración de rofecoxib produce efectos similares en estos ratones (20-22). También se han estudiado los efectos de los inhibidores selectivos de la COX-2 en ratas expuestas al azoximetano, un potente carcinógeno cólico. En estos modelos de carcinogénesis inducida farmacológicamente se redujeron los focos aberrantes de las criptas del colon en un 40-49% si se administraba celecoxib. Estudios posteriores han confirmado importantes reducciones en la incidencia de CCR y en su multiplicidad en los animales expuestos al carcinógeno y tratados con celecoxib (23,24). La mayoría de estos estudios se han realizado con el celecoxib, pero existen muy pocos en los que se haya empleado el rofecoxib, cuya selectividad por la COX-2 es doble a la de celecoxib.

El rofecoxib, también conocido como MK-0966, se absorbe rápidamente por vía oral en ratas y alcanza su concentración máxima en sangre a los 30 minutos de la ingesta. Las dosis mayores de 5 mg/kg no se traducen en un mayores aumentos del nivel plasmático del fármaco en la rata (25). Se excretan preferentemente por vía biliar y sus metabolitos derivados de su oxidación, glucuronoconjugación y reducción no son activos en cuanto a la inhibición de las ciclooxigenasas 1 ó 2 (26). La dosis que se ha usado en este estudio, 3 mg/kg, correspondería a dosis alta de fármaco si la relacionamos con las dosis habitualmente usadas en el tratamiento de la artrosis o del dolor agudo, pero según estudios clínicos de farmacocinética, la inhibición de la COX-2 es mayor a dosis más altas y la tolerancia es correcta (27).

La mayoría de los estudios hacen referencia sólo al número de tumores cólicos dejando de lado parámetros tan importantes como la superficie y porcentaje tumoral. Cuando no hablamos de criptas aberrantes o de focos displásicos, sino de tumores cólicos inducidos, creemos que se debe evaluar el porcentaje tumoral microscópico, dado que es el único parámetro que relaciona la cantidad de tejido tumoral con la totalidad del colon estudiado. El régimen farmacológico empleado de 25 mg/kg de DMH durante 18 semanas con sacrificio en la semana 20 ha mostrado que es más eficaz que otros regímenes inductores con el mismo fármaco (28,29), además de conseguir acortar el tiempo de estudio.

En este estudio hemos encontrado que el rofecoxib reduce significativamente el porcentaje tumoral de los tumores malignos, adenocarcinomas inducidos farmacológicamente, respecto al grupo control con inducción farmacológica con DMH. Este resultado coincide con el reciente estudio publicado por Oshima y cols. en el que el rofecoxib inhibe la poliposis en ratones APCdelta716, raza de ratones que desarrollan poliposis cólica y carcinomas secundarios (22). Aunque el AAS produjo una disminución de la carcinogénesis respecto al control y hubo también diferencias entre el AAS y el rofecoxib, estas diferencias no fueron significativas. En estudios previos en los que se ha empleado un mayor número de animales, sí se ha podido observar un efecto inhibidor de los AINE no selectivos sobre la carcinogénesis inducida farmacológicamente.

La dosis de AAS empleada en el estudio (30 mg/kg de peso) también correspondería a una dosis elevada y superior a la empleada en el tratamiento del dolor agudo y crónico, al igual que en el caso del rofecoxib. El hecho de que con el AAS no se consiga una reducción significativa de la carcinogénesis puede obedecer a que el número de eventos evaluados no era muy elevado. Este hecho, por el contrario, va a favor del rofecoxib, pues con este mismo número de eventos se consigue una reducción significativa en el porcentaje tumoral. La diferencia entre ambos fármacos a la que atribuimos los diferentes resultados está relacionada con la escasa inhibición de la actividad COX-2 que se logra con el AAS y la específica y elevada inhibición de esta actividad que se consigue con el rofecoxib.

No encontramos diferencias significativas entre los grupos del estudio en lo relacionado con el grado de diferenciación tumoral, el de invasión y la afectación ganglionar.

Dado que el rofecoxib produce una inhibición de la carcinogénesis cólica inducida farmacológicamente en ratas, creemos que es un fármaco que se debe evaluar en futuros estudios relacionados con el cáncer colorrectal.

Las dosis que creemos que se deberían probar en los ensayos clínicos han de ser superiores a las que en la actualidad se vienen empleando. En los dos estudios clínicos relevantes que se están realizando en la actualidad, como el de Becerra y cols. (30) en CCR metastático y el que está todavía en fase de reclutamiento de David y cols. (31) en CCR en estadios II y III, las dosis de rofecoxib empleadas son de 25 a 50 mg diarios, muy alejadas de las que empleamos en este estudio experimental. Los 3 mg/kg de peso que empleamos en nuestro estudio supondrían unas dosis aproximadas de 150-200 mg diarios para adultos entre 50 y 70 kg de peso, es decir, unas 3-4 veces más de las empleadas en la actualidad en los ensayos clínicos. Estas dosis son bien toleradas tal como se demuestra en los estudios iniciales de farmacocinética y de seguridad en fases I y II (25-27).

Por los resultados obtenidos en nuestro estudio experimental creemos que el rofecoxib a dosis elevadas, de 3 mg/kg de peso, puede tener un papel importante en la modulación del cáncer colorrectal. Dicho efecto a estas dosis debería ser evaluado en posteriores estudios clínicos.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio ha sido cofinanciado por la Asociación Española Contra el Cáncer y Junta de Baleares. Queremos agradecer la colaboración del Departamento de Fisiología Animal de la Universitat de les Illes Balears, especialmente a los Profesores R. Rial y A. Gamundí.

 

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