Asociación entre las mutaciones del gen NOD2/CARD15 con los antecedentes quirúrgicos por enfermedad de Crohn

M. Barreiro, C. Núñez¹, J. E. Domínguez-Muñoz, A. Lorenzo, F. Barreiro², J. Potel² y A. S. Peña^1,3

Servicio de Aparato Digestivo. Hospital Clínico Universitario. Santiago de Compostela. ¹Laboratorio de Inmunogenética. Vrije Universiteit Medisch Centrum. Amsterdam, Holanda. ²Servicio de Cirugía General. Hospital Clínico Universitario. Santiago de Compostela. ³Servicio de Gastroenterología. Vrije Universiteit Medisch Centrum. Amsterdam, Holanda

RESUMEN

Objetivo: conocer la influencia de las principales mutaciones descritas en el gen NOD2/CARD15 en la cirugía asociada a la enfermedad de Crohn.
Pacientes y diseño experimental: se estudió un total de 165 pacientes con enfermedad de Crohn, analizándose los antecedentes de cirugía de estos pacientes en relación con su enfermedad, se analizaron los antecedentes de cirugía en global e, individualmente, de las dos formas principales de cirugía, resección ileal y cirugía de las fístulas. Se estudió también la necesidad de apendicectomía. Todos los pacientes fueron genotipados para las tres mutaciones del gen CARD15 y se llevaron a cabo estudios de asociación mediante el empleo de test Chi cuadrado o test exacto de Fisher cuando este fue necesario.
Resultados: individuos portadores de las mutaciones G908R o 1007fs requieren cirugía con mayor frecuencia, tanto sea esta considerada de forma global como en resección ileal y cirugía de fístulas individualmente. Por el contrario la apendicectomía no aparece asociada significativamente al gen CARD15.
Conclusiones: la necesidad de cirugía asociada a enfermedad de Crohn, es mayor en pacientes que portan las mutaciones G908R o 1007fs del gen CARD15. Sin embargo, la mutación R702W parece no influir en población gallega. La influencia de esas dos mutaciones no es, sin embargo, suficiente como para que puedan ser utilizadas con fines predictivos.

Palabras clave: NOD2/CARD15. Enfermedad de Crohn. Fenotipos. Cirugía.

INTRODUCCIÓN

La etiología de la enfermedad de Crohn (EC) se desconoce todavía con exactitud. Sin embargo, parece que esta patología se debe a una alteración de la respuesta inmune de la mucosa digestiva, desencadenada por constituyentes de la microflora intestinal en individuos genéticamente susceptibles. Aunque se han implicado diversos genes en el origen de esta enfermedad (1,2), el gen CARD15, anteriormente denominado NOD2, es hasta el momento el principal gen de susceptibilidad a EC en la mayoría de las poblaciones estudiadas (1,3). El gen CARD15 se localiza en la región pericentromérica del cromosoma 16 (16q12) y codifica para la proteína NOD2, la cual actúa como un receptor intracelular a componentes bacterianos, concretamente a peptidoglicano. Existen tres mutaciones funcionales del gen CARD15, dos cambios de base y una deleción, especialmente asociadas a EC: R702W, G908R y 1007fs. Sin embargo, esta asociación no se ha detectado en todas las poblaciones estudiadas hasta el momento. Además, se han visto importantes diferencias en la frecuencia de estas mutaciones en función de las razas y la localización geográfica de las poblaciones (4-13). En la mayoría de estos estudios la presencia de estas mutaciones se ha asociado con el fenotipo de afectación ileal, que suele conllevar con más frecuencia la necesidad de cirugía.

Recientemente, un estudio llevado a cabo en población gallega (13) ha revelado la asociación de las mutaciones G908R y 1007fs a la EC, confirmando así la influencia del gen CARD15 en la EC en la citada población.

La enfermedad de Crohn es una entidad que en múltiples ocasiones requiere cirugía durante su curso evolutivo, siendo las intervenciones más frecuentes las resecciones ileales y la cirugía de las fístulas. Es importante señalar que un gran número de estos pacientes sufren también apendicectomía, bien previamente al diagnóstico o en el momento en que se produce dicho diagnóstico. Sin embargo, hasta ahora no se ha estudiado específicamente la relación entre las tres mutaciones principales del gen CARD15 y la cirugía de la EC.

El objetivo de este trabajo es describir la influencia de las mutaciones del gen CARD15 en las distintas cirugías que se realizan en la EC y determinar si estas mutaciones podrían tener un valor predictivo para alguna de ellas.

MÉTODOS

Pacientes y controles

Se estudiaron un total de 165 pacientes con enfermedad de Crohn a seguimiento en la Unidad de Enfermedad Inflamatoria Intestinal del Servicio de Aparato Digestivo del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela. Todos los pacientes eran de origen gallego y residentes en Galicia. Como grupo control se estudiaron 165 sujetos sanos, sin presencia de familiares directos con enfermedad inflamatoria intestinal, con las mismas características en cuanto a edad, sexo y origen (todos eran gallegos y residentes en Galicia). De cada sujeto se obtuvo una muestra de sangre por venopunción en tubos con EDTA, tras la previa firma de un consentimiento informado.

El diagnóstico de EC se realizó a través de métodos clínicos, endoscópicos, radiológicos e histológicos, siendo todos ellos revisados por el mismo especialista en Aparato Digestivo para confirmar la EC y evitar distintos criterios de selección. En colaboración con el Servicio de Cirugía General del mismo hospital, se llevó a cabo un estudio retrospectivo de los pacientes atendiendo a la necesidad previa de cirugía en relación con la EC. Así mismo, se subestratificó en las principales cirugías, resección ileal y cirugía de fístulas (principalmente perianales), para poder evaluarlas de forma individual. También se objetivó el haber sido apendicectomizados, ya fuese previamente o en el momento del diagnóstico de la enfermedad.

Determinación de las mutacioes CARD15

El DNA genómico se aisló empleando el kit de purificación de Roche (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany), a partir de las muestras de sangre obtenidas de cada individuo. Todos los participantes en este estudio fueron genotipados para las tres mutaciones descritas como implicadas en EC (R702W, G908R y 1007fs) mediante PCR-RFLP. Los fragmentos de restricción fueron visualizados bajo luz ultravioleta tras electroforesis en geles de agarosa al 2% (G908R) o 4% (R702W y 1007fs) con bromuro de etidio. Los cebadores empleados para la variante R702W fueron:

5'CGCACAACCTTCAGATCACA3' (sense) y

5'GGATGGAGTGGAAGTGCTTG3' (antisense).

Los cebadores de la variante G908R fueron:

5'AAGTCTGTAATGTAAAGCCAC3' (sense) y

5'CCCAGCTCCTCCCTCTTC3' (antisense),

mientras que los cebadores empleados para la variante 1007fs fueron:

5'GGCAGAAGCCCTCCTGCAGGGCC3' (sense) y

5'CCTCAAAATTCTGCCATTCC3' (antisense).

La asociación de las distintas mutaciones con la EC en conjunto o para cada subfenotipo específico, se estudió mediante tests Chi cuadrado o el test exacto de Fisher cuando fue necesario. Los análisis fueron llevados a cabo considerando la influencia de cada mutación específica sobre la enfermedad, así como la influencia de portar más de una mutación. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. Los análisis estadísticos fueron realizados empleando el programa SPSS versión 11.0.

El presente estudio ha sido aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia (2002/151).

RESULTADOS

Los 165 pacientes incluidos en este estudio fueron seguidos durante una media de 8 años desde el diagnóstico de la enfermedad, con un rango comprendido entre 1 y 33 años. La edad media fue de 36 años, con un rango entre 17 y 76. Se observó un ligero predominio de mujeres (57,6%).

Un total de 85 pacientes (51,5%) fueron intervenidos quirúrgicamente en relación con la EC. Entre ellos, 51 pacientes (60%) habían sufrido algún tipo de resección ileal, en ocasiones más de una, mientras que 19 pacientes (22,4%) se habían sometido a algún tipo de intervención en relación con su enfermedad fistulizante. Así mismo, 32 pacientes (19,4%) habían sido apendicectomizados, ya fuese antes o en el momento de diagnóstico de la enfermedad.

El 27,9% de los pacientes presentaron al menos una de las mutaciones del gen CARD15 previamente asociadas con la EC. La mutación R702W se observó en 22 pacientes (13,3%), G908R en 13 (7,9%) y 1007fs se observó en 14 pacientes (8,5%). La mutación R702W resultó también estar presente a una frecuencia relativamente elevada (11,5%) en individuos gallegos que no presentaban la enfermedad y fueron tomados como control en un estudio previo (13), por lo que dicha mutación no parecía estar significativamente asociada a susceptibilidad a EC en población gallega.

Analizando los resultados de forma global, se observa que el 39,1% de los pacientes que habían sido intervenidos quirúrgicamente en alguna ocasión por su EC (cirugía de fístulas o resección ileal) presentaban al menos una de las tres principales mutaciones en el gen CARD15, frente al 19,8% en los pacientes con EC que no habían sido intervenidos en ninguna ocasión. Las diferencias entre ambos grupos eran estadísticamente significativas (p < 0,01). Al considerar únicamente las dos mutaciones que parecían estar asociadas con la EC en población gallega, G908R y 1007fs, el 27,5% de los individuos que portaban ambas mutaciones habían sido sometidos a algún tipo de cirugía, frente a tan sólo el 6,3% de individuos portadores no intervenidos quirúrgicamente, observándose también diferencias estadísticamente significativas (p < 0,001). El análisis más detallado de las intervenciones realizadas, mostró que las mutaciones en CARD15 eran significativamente más frecuentes en pacientes que habían sufrido algún tipo de resección ileal (43,1%) que en los que no habían presentado esta cirugía (21,1%) (p = 0,003), observándose del mismo modo diferencias estadísticamente significativas cuando se consideraban únicamente portadores de G908R y 1007fs (29,4 frente al 8,8% de individuos portadores con o sin cirugía, respectivamente, p = 0,001). En el caso de los pacientes que habían sido intervenidos por sus fístulas, aunque en ambos casos se observaba una mayor frecuencia de mutaciones en CARD15 en pacientes que habían experimentado este tipo de cirugía, las diferencias sólo eran significativas cuando se consideraban pacientes portadores de las dos mutaciones asociadas a EC en población gallega. Así, el 29,4% de los pacientes que habían experimentado cirugía de fístulas portaban las variantes G908R o 1007fs, frente al 8,8% en pacientes sin este tipo de cirugía (p < 0,01).

Analizando de forma individual cada una de las tres mutaciones, se observa que la variante R702W aparece aproximadamente a igual frecuencia en pacientes intervenidos o no quirúrgicamente (13,0 frente al 13,5%, respectivamente). Sin embargo, la situación es muy diferente al observar la frecuencia de las otras dos mutaciones. La mutación G908R se observó más frecuentemente en pacientes con cirugía previa (14,5%) que en los que no habían sido intervenidos (3,1%), siendo estas diferencias significativas. La variante de inserción (1007fs) se observó en el 14,5% de los pacientes operados y en el 4,2% de los no intervenidos (p < 0,05). La frecuencia de cada una de las tres variantes con respecto a los tres tipos de cirugía considerados en este estudio se muestra en la tabla I. Al analizar los resultados para cada tipo de cirugía en particular, se observa que los individuos portadores de G908R presentan significativamente una mayor frecuencia de intervenciones por fístulas (31,6 frente al 4,8% en los no intervenidos, p < 0,01). En cuanto a las intervenciones por cirugía ileal, la mutación 1007fs se encontró significativamente asociada a este tipo de cirugía (el 17,6% de los pacientes con cirugía ileal portaban esta mutación frente al 4,4% de los pacientes sin cirugía ileal, p < 0,05). La variante G908R también era más frecuente en pacientes intervenidos quirúrgicamente por fístulas (13,7 frente al 5,3%) y las diferencias se aproximaban a la significación (p < 0,1).

El análisis de la relación entre las mutaciones en CARD15 y la apendicectomía no reflejó en ningún caso resultados significativos, si bien se observó en todos los casos que la frecuencia de mutaciones en CARD15 era siempre mayor en los pacientes que no habían experimentado apendicectomía.

DISCUSIÓN

En estudios previos se ha sugerido que entre un 70 y un 80% de los pacientes con EC son intervenidos quirúrgicamente en relación con su enfermedad al menos en una ocasión, aunque con frecuencia en mayor número (14). Aunque todavía no se conocen con certeza los factores que predicen la cirugía en la EC, es sabido que se produce un mayor número de intervenciones en los pacientes con patrón estenosante y con localización ileal. En la población analizada en este estudio, el 51,5% de los pacientes habían sido intervenido en alguna ocasión en relación con su EC, si bien esta frecuencia de intervenciones es menor que la descrita previamente; se trata de una cohorte relativamente joven, con una media de años de enfermedad de 7,5 años y con un grupo considerable de pacientes con menos de 4 años de enfermedad.

El número de pacientes con al menos una de las tres mutaciones estudiadas en el gen CARD15 en población gallega (27,9%), aunque inferior a la mayoría de poblaciones europeas estudiadas (5,11,12,15-17), sirve como referencia válida para poder evaluar su relación con las indicaciones quirúrgicas de la EC. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la inclusión de un mayor número de pacientes podría favorecer la detección de más resultados significativos.

En primer lugar, es interesante observar que en ningún caso la apendicectomía parece significativamente asociada con las mutaciones en el gen CARD15. Sin embargo, llama la atención que existe en todos los casos una mayor frecuencia de mutaciones en pacientes que no han sido intervenidos por apendicectomía. Se sabe que la apendicectomía tiene un papel protector frente al desarrollo de la colitis ulcerosa. Sin embargo, con respecto a la EC, los resultados son todavía contradictorios, aunque parece que aquellos pacientes que requieren apendicectomía en el momento de desarrollo de la enfermedad presentan una forma más severa de la misma, mientras que en aquellos que han experimentado la apendicectomía previamente, esta podrían tener un papel protector para la EC, sugiriéndose además que retrasa la edad de aparición de esta enfermedad (18,19). Por tanto, los resultados observados en este estudio podrían ser debidos a que la apendicectomía estaría previniendo la aparición de la EC en individuos con genes de susceptibilidad a la misma, lo que podría romper la asociación entre mutaciones en CARD15 y la EC. La posible asociación negativa podría además estar indicando que los casos de EC en individuos que han sufrido apendicectomía se deben a un mecanismo independiente de CARD15.

En el caso de la cirugía debida específicamente a la EC, sí parece existir una clara influencia del gen CARD15. El número de casos que han requerido intervención quirúrgica es significativamente superior para individuos portadores de al menos una de las mutaciones descritas como previamente envueltas en EC. Cuando se analiza cada mutación en particular, se observa que las mutaciones G908R y 1007fs son también más frecuentes de manera individual en individuos operados. Resultados similares ofrece el estudio específico de cada uno de los subgrupos quirúrgicos: resección ileal y cirugía de fístulas. En ambos casos, los individuos portadores de una de las mutaciones G908R o 1007fs presentan un mayor riesgo a sufrir intervenciones quirúrgicas. El hecho de que la mutación R702W no parezca relacionada con la necesidad de cirugía no es extraño, puesto que esta mutación no se había encontrado asociada a EC en la población gallega.

Con respecto a la mayor necesidad de cirugía ileal en los individuos con mutaciones en CARD15, esta apenas se había evidenciado previamente, pero sí se había constatado en varios grupos una mayor presencia de mutaciones en los individuos con patrón fibroestenosante, normalmente de localización ileal, que suelen ser aquellos que necesitan cirugía (11,12,20).

Si consideramos la necesidad de cirugía como un índice de gravedad, estos resultados estarían de acuerdo con las afirmaciones que apuntan un importante papel del gen CARD15 en la susceptibilidad y casos más severos de la EC. Resultados similares fueron encontrados con anterioridad (21-25), aunque no hay muchos trabajos que hayan estudiado esta asociación de manera específica.

Sin embargo, hay que resaltar que a pesar de la relación existente entre estas mutaciones y la necesidad de cirugía en la EC, la proporción de pacientes portadores de mutaciones dentro de aquellos que requieren cirugía es todavía demasiado baja como para poder utilizarlo de manera predictiva. Además, hay que considerar que existe siempre un porcentaje de individuos que requieren intervención quirúrgica y no portan mutaciones en este gen. Por tanto, aunque queda pendiente el estudio de una muestra mayor de pacientes para poder obtener resultados más concluyentes, a la vista de estos resultados parece clara la influencia de CARD15 en formas severas de enfermedad pero no el empleo de mutaciones en este gen con fines predictivos.

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