IL-6 y remodelación de la matriz extracelular

J. A. Solís Herruzo, P. de la Torre, T. Díaz Sanjuán, I. García Ruiz y T. Muñoz Yagüe

Departamento de Medicina. Servicio de Medicina Aparato Digestivo. Centro de Investigación. Hospital 12 de Octubre. Madrid

ABREVIATURAS

AP1: activator protein 1; CAT: Chloramphenicol acetyl transferase; ECM: Extracellular matrix; HSCs: Hepatic stellate cells; Jak: Janus tyrosine kinases; JNK: c-Jun N-terminal kinase; MMPs: Matrix metalloproteinases; PP2A: Protein phosphatase 2A; TIMPs: Tissue inhibitor MMPs; IL-6: Interleukin-6.

INTRODUCCIÓN

Una de las lesiones más características de las hepatopatías crónicas es la fibrosis hepática. Es el resultado del depósito de cantidades excesivas de proteínas de la matriz extracelular (MEC) en el hígado como respuesta a diversas agresiones, entre las que figura el abuso alcohólico, las hepatitis virales y el depósito de hierro. Esta lesión tiene importantes consecuencias fisiopatológicas sobre la función y la estructura del hígado. En primer lugar, la fibrosis puede contribuir a aumentar las resistencias vasculares intrahepáticas al flujo portal y a originar hipertensión portal. Las células estrelladas del hígado (CEH) pueden contribuir a este efecto, ya que tienen capacidad contráctil y pueden modular el flujo sanguíneo a nivel sinusoidal (1). En segundo lugar, la fibrosis perisunusoidal representa una barrera que interfiere con el intercambio de nutrientes y de metabolitos entre la sangre de los sinusoides y los hepatocitos. Además, el depósito de MEC en el espacio de Disse provoca la pérdida de ventanas en las células endoteliales de los sinusoides (2). En tercer lugar, la MEC es un reservorio de citoquinas y de factores de crecimiento situado en la proximidad de las células. La unión de estos factores a los componentes de la MEC modula su actividad biológica y las protege de su proteolisis (3).

La MEC del hígado está compuesta por tres tipos diferentes de proteínas, en concreto, los colágenos, las glicoproteínas no colágenas y los proteoglicanos (Fig. 1). Los colágenos I, III y V son moléculas heterotriméricas que forman una estructura helicoidal triple con tendencia a originar agregados supramoleculares (4,5). El colágeno tipo V, en el hígado normal, se dispone alrededor de las células, pero está también presente en cantidades aumentadas en los septos y en los espacios porta. El colágeno IV es el tipo de colágeno dominante en las membranas basales. Se trata de un tipo especial de colágeno, ya que sus moléculas forman una red tras establecer conexiones transversales por sus extremos. Estas capas de colágeno suelen estar entremezcladas físicamente o unidas directamente a otros componentes de la membrana basal, tales como la laminina, el nidogen o el perlecán.

Todos estos tipos de colágenos están aumentados en la fibrosis y en la cirrosis hepática. Cuando la fibrosis es mínima, los colágenos I y III están aumentados por igual; sin embargo, cuando la fibrosis es intensa, el tipo de colágeno dominante en las bandas de tejido conectivo es el del tipo I, de manera que la proporción colágeno I a colágeno III es de 4:1 (5). En estas condiciones, el colágeno IV se deposita en los espacios de Disse, transformando los sinusoides en capilares. Aunque el colágeno I es el componente principal de la MEC en la fibrosis y en la cirrosis hepática, hay otras muchas proteínas que también forman parte de este complejo fibroso. Este es el caso de las glicoproteínas (fibronectina, lamininas, tenascina, undulina, trombospondina, SPARC) y de los proteoaminoglicanos (perlecán, biglicán, decorin, agrecán), que también están aumentados en las cicatrices y en los septos.

Aunque es posible que todas las poblaciones celulares del hígado participen en la producción de los componentes de la MEC, parece que las células estrelladas del hígado (CEH) son el principal tipo celular fibrogénico. Las CEH son células no parenquimatosas residentes que se localizan en el espacio subendotelial, entre los hepatocitos y las células endoteliales de los sinusoides. En el hígado normal, las CEH se encuentran en un estado casi de reposo en cuanto a la síntesis de MEC se refiere (7,8). Sin embargo, cuando se produce una lesión hepática, estas células sufren un proceso complejo por el que las células pasan de su estado de reposo a otro de actividad. En esta situación, adquieren capacidad proliferativa, fibrogénica y contráctil (9,10). La activación de las CEH se asocia con cambios en su metabolismo [producción de colágenos I, III y IV, laminina, fibronectina, metaloproteinasas (MMPs), inhibidores titulares de MMPs (TIMPs)] y en su capacidad para la producción de citoquinas, factores de crecimiento y de sus receptores.

La fibrosis experimental intensa puede desaparecer si se elimina el agente causante de la lesión hepática. En efecto, la fibrosis o cirrosis inducida en ratas por la obstrucción biliar o por la exposición al tetracloruro de carbono puede revertir a lo largo de uno a tres meses (11). Igualmente, en ratones y conejos con schistosomiasis hepatoesplénica se ha comprobado que puede desaparecer la fibrosis hepática experimental (12). Evidencias recientes indican que la regresión de la fibrosis hepática y de la cirrosis micronodular avanzada es una realidad cuando se consigue eliminar de forma eficaz la causa de la lesión hepática (13-17). Sin embargo, este proceso puede no ser completo y consecuencia de ello es que la cirrosis micronodular se puede transformar en una cirrosis macronodular. La remodelación de las lesiones residuales se encuentra limitada por la existencia de uniones transversales entre las moléculas de colágeno que están mediadas por la transglutaminasa (18). Estas uniones proporcionan a la MEC una gran resistencia a su degradación por las MMPs (19). Por ello, estas uniones pueden limitar la degradación de la matriz aún en presencia de MMPs activas.

La degradación de la MEC en la fibrosis hepática es un proceso complejo en el que participan las MMPs, los TIMPs específicos y enzimas que activan las MMPs latentes (20). En un modelo experimental de fibrosis hepática, la sobreexpresión transitoria de la MMP-1 en el hígado atenúa eficazmente la fibrosis ya establecida (21).

Las MMPs constituyen una gran familia de endopeptidasas dependientes del zinc relacionadas entre sí por compartir una estructura similar. Todas ellas son capaces de degradar una amplia variedad de componentes de la MEC (22-24) y, por ello, juegan un papel esencial en la resolución de la fibrosis hepática una vez que ha desaparecido el agente causante. La MMP-1 y la MMP-13 degradan los colágenos intesticiales (tipos I, II, III y X). La MMP-2 (gelatinasa A), la MMP-10 (estromelisina-2) y la MMP-7 (matrilisina) degradan un gran número de sustratos, incluyendo a los proteoglicanos y al colágeno y a proteínas no colágeno. Las MMPs ligadas a las membranas (MMP-14 a MMP-25) se encuentran ancladas a la superficie de las células a través de su región transmembranosa carboxílica. Este tipo de MMP de membrana degradan colágenos, proteínas no colágeno, proteoglicanos y juegan un papel importante en la activación de la MMP-2 y MMP-13. En ratas y en ratones hay únicamente un tipo de MMP intersticial, la MMP-13, la cual comparte un 86% de homología con la MMP-13 humana. La MMP-13 es capaz de degradar los colágenos I, II, III, IV, X y XIV, la teneascina, la fibronectina y el agrecán (25).

Las MMPs son secretadas como proenzimas inactivas; por ello, necesitan ser activadas tras su secreción por diversos mecanismos entre los que figura la fragmentación enzimática (plasmina, una serina proteasa; estromelisina-1; MMPs ligadas a las membranas) (20,26). Las MMPs activadas producen un número muy limitado de fragmentaciones moleculares en las hélices de las tres cadenas a de los colágenos intersticiales. Por ejemplo, en el colágeno I originan un corte entre la Gly⁷⁷⁵ y la Ile⁷⁷⁶ de la cadena a1 y en la correspondiente secuencia Gly/Leu de la cadena a2. Se originan así dos fragmentos: el que incluye el extremo amínico representa tres cuartos de la longitud de toda la molécula, mientras que el fragmento carboxílico se limita al cuarto restante. Esta fragmentación inicial de los colágenos intersticiales permite su desdoblamiento molecular y, con ello, el acceso de las gelatinasas a sus fragmentos. La actividad de las MMPs se encuentra regulada por un mecanismo complejo en el que interviene el control de la expresión genética, la activación de las proenzimas y la fijación de proenzimas o de enzimas activas a los TIMPs.

Los TIMPs son glicoproteínas de bajo peso molecular capaces de unirse de forma irreversible a las formas proenzimáticas o enzimáticas activas de las MMPs. Esta unión se produce de forma esteoquimétrica 1:1 e inactiva a una gran variedad de enzimas MMPs degradantes. Debido a que las interacciones entre los TIMPs y las MMPs son uno a uno, pequeños cambios en los niveles de TIMPs pueden provocar cambios muy importantes en la actividad biológica de las MMPs. Una producción excesiva de TIMPs en relación con la de MMPs puede contribuir a la progresión de la fibrosis hepática, mientras que se puede aumentar de la degradación de la MEC tanto mediante la reducción de la síntesis de TIMPs como aumentando la expresión de MMPs. Sin embargo, algunos TIMPs tienen especial relación con MMP concretas (27,28). Los TIMPs son moléculas multifuncionales que no sólo inhiben las MMPs sino que también estimulan la proliferación de diferentes tipos celulares y pueden proteger a las células de la apoptosis (29,30).

La gravedad de la fibrosis hepática es el resultado del grado de síntesis de colágeno y el destino del colágeno depositado en la MEC del hígado, lo cual, a su vez, depende del equilibrio entre la producción y la activación de las MMPs y el nivel de TIMPs. En las hepatopatías crónicas humanas y en los modelos animales de fibrosis hepática, la expresión de la MMP-1/MMP-13 no cambia de forma llamativa a medida que la fibrosis hepática progresa y se desarrolla, mientras que se produce un marcado aumento de la expresión de los TIMP-1 y TIMP-2 (31). En homogenizados preparados de hígados cirróticos, los niveles de TIMP-1 aumentan aproximadamente cinco veces en comparación con los niveles que se encuentran en el hígado normal. La regresión de la fibrosis hepática se caracteriza por la degradación de la MEC y la restitución de la histología hepática normal. Cuando cesa la lesión hepática, la actividad colagenásica hepática aumenta unas cinco veces, lo cual se asocia con un descenso progresivo de los niveles de expresión de los TIMP-1 y TIMP-2, pero sin que ello se acompañe de un cambio en el de la MMP-1. Estudios realizados en cultivos de CEH han analizado las bases moleculares de la activación del TIMP-1 en el curso de la fibrogénesis hepática. Estos estudios han identificado la región del promotor del TIMP-1 que es decisiva para la expresión genética (32). Sin embargo, hasta ahora, no se ha podido individualizar la proteína que interactúa con esta región. Muchos tipos celulares entre los que figuran las CEH, las de Kupffer y las inflamatorias producen diversos tipos de MMPs cuando se encuentran en cultivo (20,26).

Muy pocos estudios han examinado el efecto de las citoquinas sobre la degradación de la MEC en CEH. Sin embargo, es bien sabido que la producción de MMPs puede ser incrementada por diversas hormonas (PTH, cortisol), factores de crecimiento (platelet derived growth factor, basic fibroblast growth factor), citoquinas (TNFa, IL-1a, IL-6, IL-10, IFNg, oncostatina M, macrophage migration inhibitory factor) y promotores tumorales (ésteres de forbol) (20,26,33-40). Por otro lado, la MMP-13 es deprimida por el TGFß (transforming growth factor) y el factor de crecimiento similar a la insulina (ILGF). Igualmente, varias citoquinas (TNFa, IL1ß, IL-6, oncostatina M, IFNa) y factores de crecimiento (TGFß) estimulan (41-43) o deprimen (44-47) la expresión de TIMPs en cultivos de CEH.

La interleuquina 6 (IL-6) es una glicoproteína multifuncional producida por monocitos activados, macrófagos, células endoteliales y CEH que interviene en un gran número de funciones de diversas células, tales como los fibroblastos, hepatocitos y CEH (48). La IL-6 induce la proliferación y diferenciación celular y regula la expresión de genes específicos (49), particularmente la expresión de proteínas de fase aguda por los hepatocitos (48,50). Las hepatopatías agudas y crónicas, en especial la hepatopatía alcohólica, son similares, en muchos aspectos, a la respuesta de fase aguda. En efecto, los pacientes con hepatitis alcohólica presentan fiebre, pérdida de masas musculares, neutrofilia, aumento de la producción de proteína C reactiva, a1-antitripsina y amiloide A (50,51). En el suero de los pacientes con cirrosis alcohólica se pueden detectar tasas elevadas de IL-6 (52-54) y algunos autores han mostrado que existe una correlación entre las concentraciones en sangre de IL-6 y las séricas de proteína C reactiva (55,56), una proteína inducida por la IL-6. Por ello, la IL-6 parece ser uno de los factores más importantes en la regulación de la respuesta inflamatoria en el hígado.

Nosotros hemos mostrado que la IL-6 aumenta los niveles de la MMP-13 y los del ARN mensajero (ARNm) de la MMP-13 de forma proporcional a la dosis y al tiempo de exposición (Fig. 2) y que este efecto lo produce actuando sobre el promotor del gen de la MMP-13 (57). Este efecto es evidente tras 6 horas de exposición, pero es particularmente significativo a las 24 horas. El que la IL-6 requiera un tiempo de exposición prolongado para activar la expresión genética de la MMP-13 sugiere que este efecto requiere la síntesis "de novo" de una proteína. Esta suposición es apoyada por el hecho de que el aumento del ARNm de la MMP-13 pueda ser bloqueado inhibiendo la síntesis proteica con cicloheximida (Fig.2C).

Este aumento de la expresión genética de la MMP-13 se asocia con una aumento marcado de la MMP-13 inmunoreactiva (Fig. 2D). Estos resultados coinciden con los publicados por Franchimont y cols. (58) y Kusano y cols. (59), quienes también demostraron que la IL-6, en presencia de su receptor soluble, aumenta los niveles de ARNm de la MMP-13, de MMP-13 inmunorreactiva y de su actividad biológica. Es probable que la IL-6 tenga un efecto sobre el metabolismo extracelular de la MMP-13, ya que el efecto de la IL-6 sobre la MMP-13 secretada en el medio de cultivo es mucho más marcado que el que tiene sobre el ARNm de la MMP-13. Aunque algunos autores han mostrado que la IL-6 aumenta de forma significativa la producción de ARNm del TIMP-1 y la expresión de TIMP-1 en fibroblastos humanos y en otras líneas celulares (60-64), en nuestra experiencia, la IL-6 aumenta también el TIMP-1 inmunorreactivo, pero en un grado más bajo (Fig. 2D). De hecho, los promotores genéticos de TIMP-1 y del MMP-13 contienen elementos reguladores comunes, por ejemplo, el lugar de unión del AP1 (TRE) y del PEA-3 (65). Por ello, factores que estimulan la expresión genética de MMP-13 pueden también estimular la del TIMP-1.

El promotor del gen de la MMP-13 posee una organización similar a la de otros miembros de la familia de las MMPs (66,67), en particular en lo que concierne a las genes de la MMP-1 humanos (68) y de conejo (69). Todos ellos comparten una organización común con 10-exones (67,68,70), poseen en su promotor una caja típica TATA, además de un elemento TRE y un lugar consenso para el "polyomavirus enhancer activator 3" (PEA-3) (67-74). Ello sugiere que existe un mecanismo regulador de la transcripción genética que es común para todos ellos. El gen de la MMP-13 de rata contiene también los consensos comunes para el reconocimiento de las secuencias de factores de transcripción tales como el C/EBP, Cbfa1, p53, AP-2 y AP1 (75) (Fig. 3). En las células transfectadas con plásmidos cuya actividad está dirigida por porciones de diferente longitud del promotor del MMP-13, nosotros hallamos que se puede prescindir de las secuencias situadas por encima del par de bases -79 sin que la IL-6 induzca su efecto pleno estimulante sobre el gen de la MMP-13. Estos experimentos también muestran que la integridad de la región TRE del gen MMP-13 es esencial para lograr la respuesta a la IL-6 (Fig. 4). La región TRE ha sido implicada en la expresión de muchos de los genes de las MMPs (76,77), incluyendo el de la MMP-13 (77). En células transfectadas con un plásmido de luciferasa que contenía dos copias del elemento TRE por encima del promotor mínimo, nosotros también pudimos confirmar el efecto estimulante de la IL-6 sobre la región TRE (Fig. 5). Existe poca información sobre los efectos de la IL-6 sobre genes que poseen este elemento TRE. Sin embargo, mientras Daffada y cols. (78) hallaron que la IL-6 carece de efectos sobre la actividad CAT en células transfectadas transitoriamente con el plásmido pTRE-CAT, sugiriendo que el AP1 no es inducido por el tratamiento con IL-6, Melamed y cols. (79) mostraron que la IL-6 induce la formación de un complejo unido al TRE que puede ser impedido con anticuerpos específicos anti-Jun.

El estímulo de la expresión genética habitualmente se induce mediante la unión de un factor de transcripción a elementos específicos en el promotor genético. Nuestro estudio sugería que la IL-6 estimula la expresión del gen de la MMP-13 mediente el factor de transcripción AP1 y a través del elemento TRE. Experimentos de retardo del ADN en gel muestran que la IL-6 provoca la unión de una proteína nuclear a la región TRE que es dependiente de la dosis de IL-6 y del tiempo de exposición (Fig. 6). Los complejos proteína nuclear-ADN inducidos por el tratamiento con la IL-6 contienen c-Jun fosforilado, ya que si antes de desarrollar la prueba de retraso incubamos el extracto nuclear con anticuerpos específicos frente al c-Jun fosforilado se obtiene la formación de dos complejos superretardados. Estos resultados apoyan el papel que juega el TRE y el AP1 en la mediación de los efectos de la IL-6 sobre la expresión genética de la MMP-13 de rata.

El factor de transcripción AP1 está organizado en dímeros de Jun-Jun, Jun-Fos o Jun-ATF y la presencia de miembros de la familia Jun en estos dímeros permite a AP1 unirse a los elementos cis de los promotores genéticos. Estas proteínas forman una variedad de homo- y heterotrímeros que se unen a un elemento del ADN que es común a todos ellos, el TRE (58,80,81). Como muestran la figura 7, el cultivo de los fibroblastos con la IL-6 provoca el aumento de los ARNm de c-Jun, JunB y c-Fos (Fig. 7A), activa los promotores c-jun y c-fos (Figs. 7B y 7C) y aumenta las proteínas c-Jun y c-Fos (Figs. 8A y 8B). Otros autores también han mostrado que la IL-6 estimula la expresión del gen junB en diversos tipos de celulares (82-86,) y Cressman y cols. (87) han mostrado que la expresión de junB está marcadamente reducida en el hígado de ratones deficientes en IL-6.

La actividad transcripcional de AP1 depende no sólo de la cantidad de los componentes de AP1 y de su capacidad para unirse al ADN, sino también del grado de fosforilación de esas proteínas (80,88). La fosforilación de c-Jun en su región de activación en las serinas 63 y 73 prolonga su vida media y su capacidad para activar la transcripción bien en forma de homodímero o bien como un heterodímero con c-Fos (80). Western blots empleando anticuerpos monoclonales específicos para el c-Jun fosforilado en la serina 63 demuestran que la IL-6 induce un aumento de esta forma de c-Jun, que es particularmente marcada tras 12 horas de tratamiento (Fig. 8C). Lütticker y cols. (84) también mostraron que la IL-6 provoca un retraso en la fosforilación de STAT3 a nivel de los residuos de serina. Numerosas quinasas de proteínas, entre las que figura JNK (c-Jun N-terminal kinase), pp42, pp54, pp44- y p38-quinasa de proteínas activada por mitógenos (89), p34cdc2, quinasa de proteínas C y quinasa de caseína II, son capaces de fosforilar c-Jun (90). JNK, también conocida como quinasa de proteínas activada por el estrés, es el miembro más eficaz de la familia de quinasas de proteínas activadas por mitógenos (MAPK) que participan en la fosforilación de c-Jun en las serinas 63 y 73 del c-Jun y en la potenciación de su función transactivadora (91,92). Además, la JNK forma parte de una vía de las MAPK que es crítica para el estímulo de la expresión genética de las MMPs por la IL-1 en diversos tipos celulares (93). Sin embargo, nuestro estudio indica que la IL-6 no provoca la fosforilación de c-Jun mediante el estímulo de la JNK. Como muestra la figura 9A, la incubación de las células con 10 a 20 ng/mL de IL-6 durante 15 minutos, pero no durante 5 minutos, produce un descenso de la actividad JNK hasta el 84 y 64%, respectivamente, de la actividad existente en las células controles. Además, Western blots utilizando anticuerpos policlonales específicos contra la JNK muestra la presencia de una banda única localizada a nivel de los 46 kDa, cuya densidad no se modifica tras la incubación con IL-6. Igualmente, este tratamiento no modifica el JNK fosforilado, como lo demuestran los Western blots obtenidos cuando se emplean anticuerpos IgG monoclonales específicos contra el JNK fosforilado (Fig. 9B). Considerando que la doble fosforilación que la MAP quinasa quinasa (MKK4 y MKK7) produce en los aminoácidos serina/treonina es imprescindible para la activación de la JNK (94), estos resultados apoyan la conclusión de que esta quinasa no participa en el aumento que la IL-6 produce tanto en el c-Jun fosforilado como en la expresión de la MMP-13. Estos resultados coinciden con los comunicados por diversos autores que muestran que la IL-6 no tiene efectos detectables sobre la JNK (95,96) o incluso que inhiben la activación de esta MAP quinasa (97,98).

Según lo mencionado más arriba, además de la JNK, hay una amplia variedad de quinasas de proteínas, entre las que se incluyen ERK, p38 kinase, casein kinasa II y PKC (99), que pueden fosforilar eficazmente a c-Jun (90,100). Además, en algunas líneas celulares, la vía ERK parece que juega un papel importante en la mediación de algunos efectos de la IL-6 (98). Sin embargo, el bloqueo de estas quinasa con inhibidores específicos no elimina el efecto estimulante de la IL-6 sobre la fosforilación de c-Jun (Fig. 10A), la unión de AP1 al ADN (Fig. 10B) o la expresión de la MMP-13 (Fig. 10C). En un estudio reciente (101), nosotros bloqueamos ERK con PD98059, p38 MAP quinasa con SB203580, la quinasa proteínas C (PKC) con H7 y GF 109203X, la quinasa de proteínas A con H8 y H89, la quinasa de proteínas dependiente de la calmodulina con calmidazolio y la quinasa del fosfatidil-inositol 3 con wortmanina. Considerando todos estos estudios, nuestros resultados indican que ninguna de estas quinasas de proteínas es requerida por la IL-6 para inducir la expresión de la MMP-13.

El estado de fosforilación de c-Jun es un proceso dinámico que está controlado tanto por las quinasa de proteínas como por la fosfatasa 2A de proteínas (PP2A) (102). Por ello, el aumento de c-Jun fosforilado puede producirse no sólo por un incremento de la actividad de las quinasas sino también por un descenso de la actividad de la PP2A. De hecho, numerosos estudios han demostrado claramente que la inhibición de la PP2A da lugar a una inducción de la colagenasa, de los ARNm del JunB y c-Fos y a una potente activación de AP1 a través de la fosforilación en serina/treonina (103-106). Hay cuatro grupos de fosfatasas de proteínas específicas en serina/treonina. Estas incluyen a la PP1, PP2A, PP2B (calcineurina) y PP2C. La PP2A y la PP1 se encuentran ampliamente distribuidas por el citoplasma de las células de mamíferos y se ha mencionado que están implicadas en las vías intracelulares de transmisión de señal, modificando la actividad de diversas quinasas de proteínas (107). La determinación de la actividad PP2A en fibroblastos tratados con concentraciones crecientes de IL-6 muestra que esta citoquina desciende esta actividad de forma proporcional a la dosis (Fig. 11A). Igualmente, la incubación de las células con 20 ng/mL de IL-6 durante 15 minutos a 24 horas da lugar a un descenso de la actividad fosfatasa de serinas/treonina, lo cual es particularmente marcado entre las 3 y las 6 horas de incubación. A las 12 y 24 horas, esta actividad permanece aún por debajo de la actividad control (Fig. 11B).

El papel crítico que juega la PP2A en la inducción producida por la IL-6 sobre la expresión genética de la MMP-13 viene también avalado por experimentos realizados en fibroblastos Rat-1 pretratados durante 20 minutos con 25 nM de ácido okadaico, un potente inhibidor de la fosfatasa 1 de proteínas y de la PP2A (108). En esta condición experimental, los niveles de ARNm de la MMP-13 aumentan de forma muy marcada y la adición de 20 ng/mL de IL-6 durante 24 horas no modifica este efecto (Fig. 12). Por el contrario, y como era de esperar, la inhibición de las fosfatasas de tirosina con 0,1 mM de pervanadato no modifica los efectos estimulantes de la IL-6 sobre la expresión del gen MMP-13. Además, el ácido okadaico reproduce los efectos de la IL-6 sobre la expresión genética de la MMP. Muchos otros autores han mostrado estos efectos del ácido okadaico sobre la expresión de los genes de las MMPs, así como sobre la fosforilación de c-Jun y la actividad fijadora de AP1 al ADN (105,109,110). El I₂^PP2A, otro potente inhibidor de la PP2A, ha originado efectos similares (106). Este descenso de la actividad PP2A no se debe a una menor cantidad de la proteína PP2A en los fibroblastos expuestos a la IL-6. En efecto, la determinación de estos niveles en extractos celulares de fibroblastos tratados con 20 ng/mL de IL-6 durante 3 a 16 horas demuestra que esta citoquina no produce ningún cambio en los nivels intracelulares de PP2A.

El núcleo estructural de la PP2A consiste en un complejo de tres subunidades (102,111,112). Una subunidad catalítica C (PP2A_C), de 36 kDa de peso molecular, se encuentra formando un complejo con la subunidad A estructural de 65 kDa (PP2A-A). Este dímero se asocia con un tercer componente, subunidad reguladora B, variable y con carácter regulador, que probablemente influye sobre su especificidad sobre el sustrato y sobre la localización celular (102). La fosforilación de la tirosina 307 situada en el extremo carboxílico de la subunidad catalítica de la PP2A regula su actividad fosfatasa (113,114). Es bien sabido que esta fosforilación se asocia con una pérdida del 90% de su actividad enzimática y, por ello, con una persistencia de los efectos de las quinasas de proteínas (113,115), incluyendo el estado de fosforilación del c-Jun. Por el contrario, la desfosforilación de la PP2AC reactiva a esta enzima (102). Considerando este mecanismo de regulación de la actividad de la PP2A, se puede suponer que la unión de la IL-6 a sus receptores específicos en la superficie celular debe inhibir a la PP2A mediante el aumento del grado de fosforilación de la tirosina en su subunidad catalítica, lo cual, a su vez, debe contribuir a prolongar la activación de AP1. Una secuencia similar de fenómenos se ha demostrado tras la adición de insulina a las células de músculo esquelético (115,116). Además, la inhibición de la PP2A con I₂^PP2A aumenta tanto la concentración como la unión al ADN del c-Jun y la actividad transcripcional del AP1 (106). Igualmente, los inhibidores de PP2A provocan la fosforilación en treonina de STAT3, otro factor de transcripción citoplásmico que tras su activación se trasloca al núcleo donde activa a diversos genes diana (117,118).

Estudios de Western blot utilizando anticuerpos frente a la PP2A fosforilada en la tirosina 307 muestran que existe un marcado aumento en la fosforilación de PP2A en tirosina (Fig. 13A). Por otro lado, mientras que la inmunoprecipitación de la PP2A empleando anticuerpos específicos contra la subunidad estructural de la PP2A demuestra que la IL-6 no afecta a la cantidad total de esta subunidad, la inmunodetección de proteínas fosforiladas en tirosina utilizando anticuerpos antifosfotirosina indica que el tratamiento de las células con 20 ng/mL de IL-6 durante 0 a 60 minutos provoca un aumento de la fosforilación en tirosina de la subunidad PP2A_C (Fig. 13B). Este resultado concuerda con los publicados por Choi y cols. (119), quien también halló que la IL-6 induce la fosforilación en tirosina de la PP2A.

La IL-6 inicia sus efectos biológicos tras su unión a un complejo receptor específico situado en la membrana celular. Este complejo está formado por dos subunidades: una de 80 kDa que es la proteína a la que se fija el IL-6 y otra de 130 kDa que atraviesa la membrana y que inicia la transmisión de la señal (gp130) (48). Otros miembros de la superfamilia de citoquinas de la IL-6 (oncostatina M, IL-11, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotropina-1, neurotrofina-1/factor 3 estimulante de las células B) (120-122) comparten esta misma proteína gp130 en su receptor. La activación de la señal de traducción por la IL-6 implica la homodimerización de la gp130 y la fosforilación en tirosina del extremo citoplásmico de la gp130 por las quinasas de tirosina Janus (JAKs) que se encuentra asociada a la gp130. Estas quinasas son reclutadas en la membrana plasmática y activadas tras la activación celular por citoquinas y factores de crecimiento (123). Todas las JAKs poseen al menos una copia de una secuencia de péptidos que es consenso para la unión de la PP2A (124,125). Se ha demostrado que esta fosfatasa forma complejos estables con varias quinasas de proteínas, incluida la JAK2 (115,126,127). Por ello, es comprensible que la fosforilación de PP2A_C producida por la IL-6 y la inhibición de la PP2A pueda estar mediada por JAK2. Así, como muestra la figura 14, el pretratamiento de las células durante 60 minutos con 5 µM AG490, un inhibidor específico de JAK2 (128), anula completamente el aumento de ARNm de la MMP-13 producido por la IL-6, la unión de las proteínas nucleares a las secuencias consenso para AP1, la fosforilación del c-Jun y de la PP2A_C y reduce la actividad de la PP2A. Por lo que conocemos, no disponemos información sobre el papel de las JAKs y de la PP2A en la mediación de los efectos de IL-6 sobre la expresión genética de la MMP-13. Sin embargo, la oncostatina M, otro miembro de la superfamilia de citoquinas de la IL-6 (122), también induce la expresión del gen de las MMPs en astrocitos, fibroblastos y osteoblastos (37,130) y su efecto se asocia con la fosforilación de JAK1 y JAK2.

Podemos concluir que, al menos "in vitro", la IL-6 es una citoquina antifibrogénica que puede contribuir a remodelar el tejido conjuntivo. La IL-6 aumenta la expresión genética de la MMP-13 a nivel transcripcional utilizando para ello la vía del AP1. La IL-6 aumenta la expresión genética del c-jun y de c-fos, la fosforilación de c-Jun y provoca la unión de AP1 al promotor de la MMP-13. El aumento de c-Jun fosforilado no se debe a un incremento en la actividad de la quinasa N-terminal de Jun (JNK), sino a un descenso de la actividad de las fosfatasas de serina/treonina. La IL-6, tras su unión a los receptores específicos en la superficie celular, activa la quinasa de tirosinas JAK2, la cual, a su vez, fosforila a la subunidad catalítica de la fosfatasa de proteínas 2A (PP2A) a nivel de la tirosina 307 e inhibe su actividad de forma que prolonga el estado de fosforilación de c-Jun (Fig. 15).

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