EDITORIAL

 

El significado de las mutaciones de CARD15 en la enfermedad de Crohn. La contribución española

The significance of CARD15 mutation in Crohn´disease. The Spanish contribution

 

 

A. S. Peña

Laboratorio de Inmunogenética. Departamento de Patología y Gastroenterología. Centro Médico Universitario VU. Amsterdam, Países Bajos

 

 

la NOD2 es una proteína citosólica que se expresa principalmente en monocitos, macrófagos y células dendríticas, que se detecta también en las células de Paneth del intestino delgado (1,2). La estructura básica de la proteína (1040 aminoácidos) contiene tres regiones: a) dos dominios de reclutamiento de caspasas N-terminales (CARD), por los que el Comité de Nomenclatura Internacional decidió cambiar el nombre del gen que codifica esta proteína por el de CARD15; b) un sitio central de unión de nucleóticos (NBS); y c) múltiples repeticiones carboxiterminales ricas en leucina (LRR), similares a los dominios extracelulares de los receptores de tipo "TOLL" "peaje" e importantes para detectar una proteína superficial específica de las bacterias grampositivas y gramnegativas: el muramil-dipéptido. La unión del muramil-dipéptido a la NOD2 activa el factor nuclear κB (NF-kB) en circunstancias normales. En 1996, una búsqueda de todo el genoma, realizada en dos paneles consecutivos e independientes de familias con varios miembros afectados mediante un método no paramétrico de ligamiento bipuntual entre pares de hermanos, identificó un locus de susceptibilidad a la EC en el cromosoma 16q12 (3). En 2001, tres grupos independientes que emplearon abordajes y poblaciones diferentes implicaron a la NOD2 en la susceptibilidad a la enfermedad de Crohn, señalando un posible vínculo entre la respuesta inmunitaria innata a los componentes bacterianos y el desarrollo de la enfermedad (4-6). A estos primeros estudios España contribuyó activamente aportando pacientes y familias afectas de enfermedad de Crohn procedentes de los hospitales de Sant Pau de Barcelona y de Trias i Puyol de Badalona (5). De manera más fundamental, España ha contribuido con los trabajos pioneros de Gabriel Núñez sobre el papel de las proteínas NOD-LRR en las interacciones huésped-microorganismo y los procesos inflamatorios (7-12). En la raza blanca se han hallado al menos 30 mutaciones en el gen CARD15 que producen cambios no conservadores de la proteína (13,14), pero las más frecuentes, localizadas en el tercio distal del gen, son dos mutaciones de cambio de sentido: una, la SNP8 (2104C > T; rs17860491), lleva a (R702W) (sustitución de arginina por triptófano); la otra, la SNP12 (2722G > C; rs17860492), lleva a (G908R) (sustitución de glicina por arginina). También está la mutación SNP13 (3020insC; rs17860493) debido a la inserción de citosina (L1007finsC) que da por resultado una proteína NOD2 más corta. Estas tres mutaciones representan más del 82% de los cromosomas mutados (14) y son las responsables de los alelos de susceptibilidad a la enfermedad. Ello significa que los portadores de estos alelos tienen riesgo de sufrir de la enfermedad de Crohn. Sin embargo, el riesgo no es igual para los tres alelos de susceptibilidad. En la mayoría de los estudios, los portadores de R702W tienen un riesgo dos veces mayor, los de G908R un riesgo tres veces mayor y los mutantes 1007fs un riesgo cuatro veces mayor; el riesgo de homozigóticos mutados (generalmente de la mutación 1007fs) o los heterozigotos compuestos es de 17,1; IC 95% 10,7-27,2 (15). En algunas poblaciones, como la de Toledo, en España, y de Rennes, en Francia, la mutación R702W fue la mutación de CARD15 que se asoció de manera más significativa a la enfermedad de Crohn. Es más, esta variante de susceptibilidad presentó una asociación independiente al comportamiento estenosante de la enfermedad (16,17).

Ya se ha visto anteriormente que un cromosoma mutado normalmente lleva sólo una de las variantes frecuentes. Así, los individuos afectados que portan mutaciones compuestas proceden de ambos cromosomas 16, indicando que los han heredado del padre y de la madre. Estas mutaciones compuestas son las responsables de la falta de respuesta a los productos bacterianos específicos, como se demostró elegantemente en Michigan y París (18-20). Estas mutaciones determinan una respuesta anormal al muramil-dipéptido (MDP) que pueden conducir a la enfermedad, principalmente en el íleon (15,21). Sin embargo, incluso en este subgrupo de pacientes resulta obvio que, para que se exprese la enfermedad, son necesarios otros factores genéticos y ambientales. Así, los pacientes con afectación ileal y los portadores de mutaciones de CARD15 presentan también un descenso específico de las alfa-defensinas que repercute enormemente sobre los microorganismos luminales (22). Además, los pacientes con anticuerpos frente a Saccharomyces cerevisiae (ASCA+) tienen una frecuencia mayor de alelos mutantes de CARD15, aunque los títulos mayores de ASCA se han asociado a mayores probabilidades de enfermedad de Crohn ileal y de conducta estenosante/penetrante con independencia del estado de CARD15 (23). En un estudio poblacional de Canadá se ha confirmado que el CARD15 y el consumo de tabaco son factores de riesgo independientes entre sí. El riesgo atribuible a los portadores de CARD15 fue del 26,7% y el achacado a ser fumador activo fue del 46,8% (24). De Diego y cols. analizaron la frecuencia del hábito tabáquico en pacientes con mutaciones de CARD15 y observaron una asociación inversamente significativa con el tabaquismo tanto en los pacientes heterozigotos para 1007fs como en los heterozigotos y homozigotos compuestos; el 72% de los fumadores no tenían ninguna de estas tres mutaciones (25). Al igual que en la periodontitis, otra enfermedad compleja frecuente, la máxima frecuencia de portadores de mutaciones de CARD15 se encontró entre los pacientes no fumadores sin Porphyromonas gingivalis ni Actinobacillus actinomycetemcomitans (29,4 frente a 17,4% en los controles) (26). La diferencia no fue significativa pero confirma la falta de interacción entre estas mutaciones y este importante factor ambiental, que interviene en la regulación de la permeabilidad intestinal y la inflamación (27,28).

Un metaanálisis de las mutaciones de CARD15 en la enfermedad de Crohn de poblaciones diversas ayudó a cartografiar la frecuencia y las diferencias geográficas de las mutaciones; las frecuencias de alelos y genotipos de las tres mutaciones más habituales se calcularon en 3.575 controles sanos de raza blanca reclutados por 15 grupos distribuidos en tres continentes. Las frecuencias alélicas de las mutaciones R702W, G908R y 1007fs eran del 4,3% (3,6-4,9), el 1,2% (0,8-1,6) y el 2,3% (1,8-2,8), respectivamente, con grandes fluctuaciones geográficas de los alelos G908R, 1007fs y de tipo silvestre o salvaje (p < 0,0001). A nivel poblacional, no se observó ninguna relación sencilla entre las frecuencias de las mutaciones y las incidencias de la enfermedad en las poblaciones estudiadas. A nivel individual no se halló ningún déficit significativo de portadores de mutaciones de dosis doble entre los controles sanos, lo que prueba en gran medida que la penetrancia de la mayoría de los genotipos de riesgo es baja y confirma que el CARD15 opera interactuando con otros cofactores de riesgo desconocidos (29). Los estudios de controles de diferentes regiones de España (16,30-33), como Oviedo y Valladolid, no difieren significativamente de los datos obtenidos a partir de 15 cohortes de controles sanos de raza blanca entre los que no había españoles (29) (Tabla I).

El artículo publicado en este número de Revista Española de Enfermedades Digestivas aporta datos recientes sobre la frecuencia de estas mutaciones habituales en la población sana de Asturias y en pacientes con enfermedad de Crohn. Los autores muestran que la prevalencia de las mutaciones de CARD15 no era diferente de la observada en la población de control, aunque la mutación 1007fs, al igual que en los resultados de Toledo (16), seguía la misma tendencia positiva en los pacientes con afectación ileal; el 11,3% portaban esta mutación en dosis simple y el 17,3% en heterozigotos compuestos. Las diferencias observadas con otros centros no se deben a las observadas en la población de control sana, a pesar del pequeño número de controles procedentes de Asturias con genotipo de las mutaciones más frecuentes de CARD15, como puede verse en la tabla I. Desgraciadamente no es posible hacer comparaciones estrictas, ya que no todos los autores citan las frecuencias alélicas en sus publicaciones, además la selección de pacientes es diferente. En España no hay estudios poblacionales y muchas de las publicaciones proceden de centros de referencia como el de Madrid y el de Barcelona (32,34-36).

Varios estudios han hallado una asociación positiva entre presencia de mutaciones, especialmente las 1007fins, intervención quirúrgica previa debida a la enfermedad de Crohn, principalmente resecciones ileales (37), resecciones ileocecales y alto riesgo de recidiva postoperatoria y reoperación (38). Seiderer y cols. hallaron que la presencia homozigota de la variante 1007fs de CARD15 se asocia a un curso muy agresivo de la EC con afectación ileal en todos los pacientes afectados y una alta incidencia de estenosis fibroestenóticas que con frecuencia precisan intervención quirúrgica (39). Estos hallazgos se confirmaron también en Galicia (40) y en un estudio prospectivo de Barcelona (35). Entre 70 pacientes catalanes que precisaron cirugía, la recurrencia postoperatoria fue también más frecuente en los pacientes con variantes de CARD15 en los análisis univariado y multivariado (OR: 3,29; IC 95%: 1,13-9,56), necesitándose antes la reoperación (p = 0,03) (35). Más recientemente se ha realizado un interesante estudio clínico prospectivo para confirmar que la variante 1007fs de CARD15 es un factor pronóstico independiente de la aparición de estenosis intestinales y de la necesidad de intervención quirúrgica. A una serie de pacientes con enfermedad de Crohn que presentaban síntomas clínicos indicativos de estenosis intestinal les hicieron de manera prospectiva un genotipo en busca de las tres variantes más corrientes de CARD15, siguiéndoseles mediante enteroclisis por resonancia magnética para analizar la presencia de estenosis de intestino delgado. Además, basándose en hallazgos clínicos y radiológicos, la necesidad de intervención quirúrgica la valoró un cirujano independiente que no conocía los resultados del genotipo de CARD15. Veinticinco de los 40 pacientes (62%) con al menos una variante de CARD15 se diagnosticaron de estenosis intestinal con la enteroclisis por resonancia magnética (OR = 9,44; IC: 3,21-27,77; p = 0,00028, Bonferroni corregido). En concreto, la presencia de la variante 1007fs se asoció a un mayor riesgo de estenosis intestinal (OR = 12,00, IC: 3,47-41,54, p = 0,00042, Bonferroni corregido). Veintiuno de los 31 pacientes con estenosis (68%) requirieron cirugía, siendo 13 de estos 21 (62%) portadores de la variante 1007fs. El genotipo podría ser pues una importante herramienta diagnóstica en la clínica para identificar a los pacientes de alto riesgo con determinadas necesidades diagnósticas y terapéuticas. Este importante estudio también ha mostrado que la enteroclisis por resonancia magnética es una técnica excelente para diagnosticar las estenosis de intestino delgado (41). En otro estudio de niños con esta mutación se observó un riesgo 6,6 veces mayor de presentar fenotipos estenosantes con necesidad de cirugía, por lo que las pruebas genéticas pueden identificar a los niños con EC y riesgo de cirugía precoz (42).

La homozigosidad de la mutación 1007fs de CARD15 se asocia a un curso agresivo de la EII con una incidencia elevada de estenosis fibróticas que a menudo precisan intervención (39). Sin embargo, recomendar el genotipo de CARD15 como planteamiento diagnóstico en todos los pacientes de enfermedad de Crohn no está indicado en este momento, pues estas variantes genéticas sólo explican alrededor del 20% de la susceptibilidad de esta enfermedad. Sin embargo, como concluyeron Seiderer y cols. (41), las pruebas indican que los genotipos son una útil herramienta diagnóstica en los pacientes con síntomas clínicos sugerentes de estenosis intestinal para poder detectar lo antes posible a los enfermos de alto riesgo y posiblemente prevenir las complicaciones que se asocian a este subgrupo de pacientes.

Estos recientes resultados avalarían el desarrollo de pruebas basadas en el genotipo. De hecho ya se han comercializado pruebas basadas solamente en la genotipificación del ADN (p. ej., PROMETHEUS^® NOD2/CARD15, Prometheus Laboratories, San Diego, CA, USA). Tales pruebas identificarán de manera específica a algunos individuos de alto riesgo de presentar enfermedad de Crohn, portadores de 2 mutaciones frecuentes de CARD15 (43-45); sin embargo, la sensibilidad quizá sea baja al no lograr detectar las mutaciones raras. Se ha predicho que estas estarían presentes en el 25% de los portadores de mutaciones dobles (14), lo que posiblemente es una infraestimación causada por otras mutaciones de CARD15 causantes de la enfermedad y aun no identificadas (p. ej., en las regiones reguladoras y promotoras, aunque hasta ahora estas no parecen ser importantes para la susceptibilidad) o por variantes en el número de copias. Las pruebas de tipo secuencial para buscar variantes raras son muy laboriosas y caras por lo que normalmente suelen necesitarse otros análisis de muestras parentales (45).

La complejidad que poseen las bases genéticas de la enfermedad infamatoria intestinal hace que las pruebas genéticas convencionales sean demasiado caras y largas como para resultar prácticas. El IBDchip^® de Progenika (otra contribución española) permite un cribado rápido y rentable de gran número de los "polimorfismos debidos a una mutación de un nucleótido" (PSN) asociados a la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Acualmente, el IBDchip^® genotipifica 102 PSN en 63 genes. Estas mutaciones se analizan así simultáneamente. Este desarrollo ha demostrado que la factibilidad de la tecnología es casi perfecta, pues los coeficientes de especificidad y sensibilidad se hallan por encima del 99,7% respecto a todos los PSN comprobados. Esta potente herramienta de genotipificación se está validando en varias poblaciones de pacientes europeos y norteamericanos con enfermedad inflamatoria intestinal y la mejor selección de los PSN se espera que aumente el valor al predecir el curso de la enfermedad.

Se ha realizado recientemente un estudio del CARD15 para predecir el aumento de los costes quirúrgicos de la enfermedad de Crohn. Este estudio, que también precisa validación, ilustra también la importancia que tiene combinar las pruebas genéticas y serológicas. En una cohorte extrahospitalaria europea e israelí de diseño prospectivo (n = 228), a la que se siguió durante una media de 8,3 años (DE 2,6), la medición de los ASCA (IgG, IgA) y las tres mutaciones más comunes de CARD15 indica que los pacientes con EC que son positivos para G908R y ASCA devengan mayores costes sanitarios (46). Considerando que la frecuencia de G908R no es muy relevante en España basado en estudios de pacientes de centros de referencia, habrá que explorar otras combinaciones. En este sentido, la influencia combinada de las mutaciones de CARD15 y del genotipo 4G/4G del gen del inhibidor del activador del plasminógeno de tipo 1 (PAI-1) sobre el comportamiento de la enfermedad de Crohn ha mostrado en 170 pacientes estudiados de manera prospectiva que es capaz de predecir la enfermedad de Crohn complicada y, por lo tanto, que los pacientes con estas variantes podrían beneficiarse de intervenciones precoces (34).

Otra importante aportación española radica en el campo del trasplante alogénico de células madre (TCM). Un grupo de hematólogos de Barcelona (33) ha encontrado que había variantes de CARD15 en nueve (11%) de 76 pacientes sometidos a TCM alogénico con depleción de células T y seis (8%) de los 65 donantes. Estas variantes genéticas se asociaron a una menor supervivencia sin enfermedad (17 frente a 48%, p = 0,03). Además, la muerte por infección pulmonar fue más frecuente en el grupo de pacientes con mutaciones de CARD15. Estos resultados confirman los estudios previos en el terreno de los trasplantes (47-51) y avalan la hipótesis de que el efecto perjudicial de las variantes de CARD15 podría estar producido por una alteración del sistema inmunitario innato, más que por la activación del sistema inmunitario adaptativo (33). El papel de estas mutaciones en el deterioro de la función de barrera y la translocación bacteriana podría ser un tema importante en la fisiopatología de la sepsis precoz; la mortalidad relacionada con la sepsis (día 30) estaba aumentada en los pacientes con variantes de CARD15 (42 frente a 31%) y fue máxima (57%) en los 8 pacientes que portaban la mutación 1007fs (52).

Sin duda, los futuros estudios de este gen y de sus interacciones con otros genes y con los factores ambientales contribuirán al conocimiento de la enfermedad de Crohn. La importancia clínica de estas mutaciones y su aplicación se han revisado recientemente (43,53-55), pero está claro que habremos de seguir considerando estos importantes hallazgos como herramientas útiles con que seguir tipificando estas complejas enfermedades. Por el momento, las pruebas indican que los genotipos son una útil herramienta diagnóstica en los casos con síntomas clínicos indicativos de estenosis intestinal, con el fin de identificar a los pacientes de alto riesgo y posiblemente de prevenir las complicaciones de este subgrupo de pacientes con enfermedad de Crohn. Todavía queda mucho por hacer y descubrir pero está claro que la contribución de España en este campo es muy importante.

 

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