TRABAJOS ORIGINALES

 

El bloqueo de las proteínas cinasas activadas por mitógenos mejora las alteraciones motoras inducidas por el lipopolisacárido en íleon

Mitogen activated protein kinases blockade improves lipopolysaccharide-induced ileal motor disturbances

 

 

Sergio Gonzalo, Laura Grasa, Ligia Verónica Hernández, María Pilar Arruebo, Miguel Ángel Plaza y María Divina Murillo

Departamento de Farmacología y Fisiología. Unidad de Fisiología. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza. Zaragoza

Este trabajo se presento, en parte, en el LXVII Congreso Anual de la Sociedad Española de Patología Digestiva (SEPD), Sitges, Junio 2008.

Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, España (Dirección General de Investigación AGL2006-04317 y FEDER), el Gobierno de Aragón (B61/2008-2010) y la Universidad de Zaragoza (UZ2009-BIO-03). Sergio Gonzalo ha disfrutado de una beca del Ministerio de Educación y Ciencia, España (BES-2007-156469).

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Introducción: varias enfermedades como la sepsis pueden afectar al íleon. El lipopolisacárido (LPS), una endotoxina presente en la pared celular de las bacterias gram-negativas, es un agente causal de la sepsis.
Objetivos: los objetivos del presente estudio fueron: a) investigar el papel de las proteína cinasas activadas por mitógenos (MAPKs) en los efectos del LPS en las contracciones inducidas por acetilcolina en el íleon de conejo; y b) estudiar la localización de las MAPKs en el íleon.
Material y métodos: la contractilidad ileal se estudió en un baño de órganos y las MAPKs se localizaron mediante inmunohistoquímica.
Resultados: el LPS disminuyó las contracciones inducidas por acetilcolina. El SB203580, el SP600125 y el U0126 bloquearon los efectos del LPS sobre las contracciones inducidas por acetilcolina. La p38 y la ERK fosforiladas se detectaron en las neuronas del plexo mientérico y la p38 y la JNK fosforiladas en las células del músculo liso del íleon.
Conclusión: concluimos que la p38, la JNK y la ERK MAPKs parecen estar involucradas en el mecanismo de acción del LPS en el íleon.

Palabras clave: Contractilidad intestinal. LPS. p38. ERK. JNK. Plexo mientérico. Músculo liso.

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ABSTRACT

Background: several diseases such as sepsis can affect the ileum. Lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin present in the cell wall of gram negative bacteria, is a causative agent of sepsis.
Objectives: the aims of this study were: a) to investigate the role of mitogen activated protein kinases (MAPKs) in the effect of LPS on the acetylcholine-induced contractions of rabbit ileum; and b) to study the localization of MAPKs in the ileum.
Material and methods: ileal contractility was studied in an organ bath and MAPKs were localized by immunohistochemistry.
Results: acetylcholine-induced contractions decreased with LPS. SB203580, SP600125 and U0126 blocked the effect of LPS on the acetylcholine-induced contractions. Phosphorylated p38 and ERK were detected in neurons of myenteric plexus and phosphorylated p38 and JNK in smooth muscle cells of ileum.
Conclusion: we can suggest that p38, JNK, and ERK MAPKs are involved in the mechanism of action of LPS in the ileum.

Key words: Intestinal contractility. LPS. p38. ERK. JNK. Myenteric plexus. Smooth muscle.

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Introducción

El íleo paralítico es una complicación frecuente en la sepsis (1,2). El uso del lipopolisacárido (LPS), una endotoxina presente en la pared celular de las bacterias gram negativas, está ampliamente extendido para reproducir los síntomas de la sepsis. Por ejemplo, la administración de LPS produce una disminución de la contractilidad del músculo liso longitudinal ileal (3).

Las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPKs) son una familia de proteínas cinasas que están involucradas en muchos procesos celulares como la proliferación, diferenciación y muerte celular y se ha observado una activación anormal de las MAPKs en procesos patológicos como la sepsis. Los grupos más importantes de MAPKs son la p38, la c-Jun-N-cinasa terminal (JNK1/2) y la cinasa regulada por señales extracelulares (ERK1/2) MAPK (4).

Los objetivos de este estudio fueron: a) investigar el papel de las MAPKs en los efectos del LPS en las contracciones inducidas por la acetilcolina en el íleon de conejo; y b) estudiar la localización de las MAPKs en el íleon.

 

Método

Soluciones y substancias ensayadas

La acetilcolina (ACh) y el lipopolisacárido (LPS, del serotipo Escherichia coli 0111:B4) se obtuvieron de Sigma (Madrid, España). El 4-[5-(4-Fluorofenil)-2-[4-(metilsulfonil)fenil]-1H-imidazol-4-il]piridinahidrocloruro (SB-203580), el antra[1-9-cd]pirazol-6(2H)-uno (SP-600125), y el 1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis[2-aminofeniltio]butadieno (U-0126) se adquirieron en Tocris (Madrid, España).

Animales

Todos los protocolos experimentales se aprobaron por el Comité Ético de la Universidad de Zaragoza (España). Los conejos macho de la raza Neozelandesa, con un peso de 2-2,25 kg, se mantenían con pienso de conejo estándar y libre acceso al agua.

Los conejos se dividieron en 8 grupos y se inyectaron i.v. con: 1) solución salina; 2) LPS (0.2 µg kg^-1); 3) SB203580 (30 µg kg^-1); 4) SB203580 + LPS; 5) SP600125 (25 µg kg^-1); 6) SP600125 + LPS; 7) U0126 (30 µg kg^-1) o U0126 + LPS. El SB203580, el SP600125 o el U0126 se administraron 15 minutos antes del LPS o de la solución salina. Los animales se sacrificaron de forma humanitaria con un golpe en la cabeza 90 minutos después de la inyección de LPS o de solución salina.

Estudios funcionales: contractilidad muscular

Los segmentos de íleon de conejo se extraían, lavaban y se disecaba el mesenterio. Los registros isométricos de la contractilidad ileal se estudiaron en un baño de órganos como se ha descrito previamente (5). Cada protocolo se realizó en 8 segmentos de íleon (4 de músculo longitudinal y 4 circular) tomados del mismo conejo, y repetidos en tres o cuatro animales diferentes. Después del periodo de estabilización, se añadía acetilcolina (10^-7 a 10^-3 mol l^-1) al baño de órganos durante 3 minutos de forma no acumulativa. Se incrementaron las concentraciones a intervalos de 20 minutos.

Inmunohistoquímica

El protocolo se realizó siguiendo las instrucciones del kit Vectastain ABC (Laboratorios Vector, CA, EE. UU.) y como se ha descrito previamente (6). Las preparaciones se incubaron a 4 ^oC durante toda la noche con los anticuerpos de ratón anti-p38 fosforilado (p-p38) (1:100), anti-JNK fosforilado (p-JNK) (1:2000) o anti-ERK fosforilado (p-ERK) (1:100) diluidos en suero normal (10%). Los anticuerpos para la p-p38, p-JNK y p-ERK se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU., SC-7973, SC-6254 y SC-7383, respectivamente).

Análisis de los datos y estadística

La respuesta motora a la acetilcolina (MR) se calculó y expresó en mN s^-1 mm^-2 como se ha descrito previamente (5).

Los resultados se expresaron como la media ± s.e.m. Las comparaciones entre las medias se realizaron mediante el análisis de varianza (ANOVA) y los valores de p se determinaron usando el test de Bonferroni. Las diferencias con valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

 

Resultados

Efectos del SB203580, SP600125 y U0126 sobre las alteraciones de la contractilidad ileal inducidas por el LPS

El tratamiento con LPS (0.2 µg kg^-1, 90 minutos) disminuyó la respuesta inducida por la acetilcolina en el músculo longitudinal y circular de íleon de conejo, como se ha descrito previamente, en parte, por nuestro laboratorio (7). El tratamiento con SB203580 (Fig. 1A, B), SP600125 (Fig. 1C, D) o U0126 (Fig. 2E, F) bloqueó el efecto del LPS sobre las contracciones inducidas por acetilcolina tanto en el músculo longitudinal como en el circular. Los inhibidores de las MAPKs no tuvieron efecto per se en las contracciones inducidas por la acetilcolina.

Inmunohistoquímica

La expresión de la p-p38, p-JNK y p-ERK1/2 se detectó tanto en los conejos tratados con solución salina como con LPS. La p-p38 se detectó en las neuronas del plexo mientérico y en las células de músculo liso de íleon (Fig. 2A, B). La p-JNK se detectó en las células musculares lisas (Fig. 2D, E). La p-ERK se detectó principalmente en las neuronas de los ganglios mientéricos y ligeramente en las células musculares lisas (Fig. 2G, H).

La especificidad del marcaje obtenido se comprobó omitiendo el anticuerpo primario, observándose una clara supresión del marcaje en todos los casos (Fig. 2C, F, I).

 

Discusión

El tratamiento con LPS es uno de los modelos más utilizados para estudiar la sepsis, todavía uno de los grandes retos de la medicina. Estudios previos de nuestro grupo muestran que el LPS altera la contractilidad intestinal (7). En este estudio, se demuestra que el bloqueo de las vías de la p38, la JNK1/2 o la ERK1/2 abolió el efecto del LPS sobre las contracciones inducidas por la acetilcolina en el íleon de conejo. Nuestro grupo ha descrito resultados similares en el duodeno de conejo (6,8,9), aunque existen algunas diferencias. El efecto del LPS en la capa muscular longitudinal es mayor en el duodeno que en el íleon (58 vs. 43% de reducción), mientras que el efecto del LPS es similar en la capa muscular circular de duodeno e íleon.

En este estudio se ha detectado la p-p38 en las neuronas del plexo mientérico y en las células musculares lisas, la p-JNK en las células musculares lisas y la p-ERK principalmente en las neuronas de los ganglios mientéricos y ligeramente en las células musculares lisas de íleon. En estudios previos se ha descrito una localización similar de estas MAPKs en el duodeno de conejo, aunque la expresión de la p-p38 y la p-ERK1/2 en el músculo liso de duodeno fue menor que en íleon (6,8,9).

En definitiva, los resultados de este estudio sugieren que la p38, la JNK1/2 y la ERK1/2 MAPKs están involucradas en los efectos del LPS en el íleon y, por tanto, el bloqueo de las MAPKs podría ser una diana para evitar las alteraciones motoras intestinales observadas en la sepsis.

 

 

Dirección para correspondencia:
María Divina Murillo
Departamento de Farmacología y Fisiología
Unidad de Fisiología
Facultad de Veterinaria
Universidad de Zaragoza
c/ Miguel Servet, 177
50013 Zaragoza
e-mail: dmurillo@unizar.es

Recibido: 22-11-2011
Aceptado: 03-03-2012

 

 

Bibliografía

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3. Weisbrodt NW, Pressley TA, Li YF, Zembowicz MJ, Higham SC, Zembowicz A, et al. Decreased ileal muscle contractility and increased NOS II expression induced by lipopolysaccharide. Am J Physiol 1996; 271(3 Pt 1):G454-G460.         [ Links ]

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5. Fagundes DS, Gonzalo S, Grasa L, Castro M, Arruebo MP, Plaza MA, et al. Trolox reduces the effect of ethanol on acetylcholine-induced contractions and oxidative stress in the isolated rabbit duodenum. Rev Esp Enferm Dig 2011;103(8):396-401.         [ Links ]

6. Gonzalo S, Grasa L, Arruebo MP, Plaza MA, Murillo MD. Inhibition of p38 MAPK improves intestinal disturbances and oxidative stress induced in a rabbit endotoxemia model. Neurogastroenterol Motil 2010;22(5): 564-72,e123.         [ Links ]

7. Rebollar E, Arruebo MP, Plaza MA, Murillo MD. Effect of lipopolysaccharide on rabbit small intestine muscle contractility in vitro: role of prostaglandins. Neurogastroenterol Motil 2002;14(6):633-42.         [ Links ]

8. Gonzalo S, Grasa L, Arruebo MP, Plaza MA, Murillo MD. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) is involved in LPS-induced disturbances in intestinal motility. Neurogastroenterol Motil 2011;23(2):e80-90.         [ Links ]

9. Gonzalo S, Grasa L, Arruebo MP, Plaza MA, Murillo MD. Lipopolysaccharide-induced intestinal motility disturbances are mediated by c-Jun NH2-terminal kinases. Dig Liver Dis 2011;43(4):277-85.         [ Links ]