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Revista Española de Enfermedades Digestivas

versión impresa ISSN 1130-0108

Rev. esp. enferm. dig. vol.105 no.3 Madrid mar. 2013

https://dx.doi.org/10.4321/S1130-01082013000300004 

TRABAJOS ORIGINALES

 

Preparación de una matriz extracelular tridimensional por descelularización de hígados de conejos

Preparation of a three-dimensional extracellular matrix by decellularization of rabbit livers

 

 

Gustavo A. Nari1,2, Mariana Cid3,4, Romina Comín3, Laura Reyna5, Gustavo Juri6, Ricardo Taborda5 y Nancy A. Salvatierra3,4

1Servicio de Cirugía. Hospital Florencio Díaz. Argentina.
2Cátedra de Cirugía I UHC 4. UNC. Argentina.
3Departamento de Química, Ingeniería Biomédica. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.
4IIBYT-CONICET. Argentina.
5LIADE (Laboratorio de Investigación Aplicada y Desarrollo). Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.
6Ingeniería Biomédica. Facultad de Ciencias Médicas. UNC. Argentina

Dirección para correspondencia

 

 


RESUMEN

Introducción: el número de hígados trasplantables es insuficiente para satisfacer las necesidades actuales de la demanda de injerto. La búsqueda de alternativas terapéuticas ha generado diferentes líneas de investigación, una de ellas es la utilización de matrices biológicas tridimensionales descelularizadas y la posterior siembra celular para obtener un órgano funcional.
Objetivo: obtención de un protocolo de descelularización de hígado de conejo que genere una matriz hepática tridimensional.
Métodos: una combinación de detergentes (Triton X-100 y SDS), agentes físicos y enzimáticos se utilizaron para descelularizar hígados de conejo. Los órganos se pefundieron en forma retrógrada con distintos agentes químicos durante 68 horas. Luego los hígados se examinaron por técnicas morfológicas (microscopía óptica y electrónica de barrido) y bioquímicas (cuantificación de ADN) para evaluar una correcta descelularización así como la obtención de una matriz extracelular preservada.
Resultados: la observación macroscópica del órgano permitió inferir la descelularización del mismo. Las tinciones macroscópicas utilizadas mostraron una correcta conservación de los árboles biliar y vascular. Por otro lado, la observación microscópica del hígado permitió corroborar los resultados macroscópicos observados, la tinción de hematoxilina-eosina mostró ausencia de células y de material nuclear así como la presencia de la tríada portal. La tinción de Wilde evidenció la conservación de las fibras de reticulina en la matriz descelularizada. Asimismo, la microscopía electrónica de barrido reveló una cápsula de Glisson conservada y la descelularización de la cuantificación de ADN fue inferior al 10 % en el hígado descelularizado con respecto al hígado control. Finalmente, el tiempo utilizado para la descelularización fue inferior a las 96 horas.
Conclusiones: el protocolo de descelularización propuesto fue apropiado ya que se verificó una ausencia de células y una matriz hepática con conductos vasculobiliares conservados y con una arquitectura tridimensional adecuada para una futura siembra celular.

Palabras clave: Hígado descelularizado. Andamios biológicos. Trasplante.


ABSTRACT

Introduction: the availability of transplantable livers is not sufficient to fulfill the current demand for grafts, with the search for therapeutic alternatives having generated different lines of research, one of which is the use of decellularized three-dimensional biological matrices and subsequent cell seeding to obtain a functional organ.
Objective: to produce a decellularization protocol from rabbit liver to generate a three-dimensional matrix.
Methods: a combination of physical, chemical (Triton X-100 and SDS) and enzymatic agents to decellularize rabbit livers was used. After 68 h of retrograde perfusion, a decellularized translucent matrix was generated. To evaluate if the decellularization protocol was successful, with the extracellular matrix being preserved, we carried out histological (light microscopy and scanning electron microscopy) and biochemical (DNA quantification) studies.
Results: the decellularization process was verified by macroscopic observation of the organ using macroscopic staining, which revealed a correct conservation of bile and vascular trees. A microscopic observation corroborated these macroscopic results, with the hematoxylin-eosin staining showing no cells or nuclear material and the presence of a portal triad. Wilde's staining demonstrated the conservation of reticulin fibers in the decellularized matrix. In addition, scanning electron microscopy revealed a preserved Glisson's capsule and a decellularized matrix, with the DNA quantification being less than 10 % in the decellularized liver compared to control. Finally, the time taken to develop the decellularization protocol was less than 96 hours.
Conclusions: the proposed decellularization protocol was correct, and was verified by an absence of cells. The hepatic matrix had preserved vascular and bile ducts with a suitable three-dimensional architecture permitting further cell seeding.

Key words: Decellularized liver. Biological scaffolds. Transplant.


 

Introducción

El trasplante hepático es hoy la única alternativa terapéutica para la insuficiencia hepática aguda, enfermedades hepáticas en estado terminal o trastornos metabólicos hereditarios originados en el hígado. La escasez de donantes resulta en que muchos de los pacientes que se encuentran en lista de espera nunca reciban el trasplante hepático y muchos pacientes con indicación del injerto no lleguen a acceder a las listas de espera.

La complejidad de la función del hígado hace difícil el uso de sistemas artificiales para darle soporte temporal como puede hacerse por ejemplo en los pacientes con insuficiencia renal, y los sistemas de soporte no biológicos propuestos en la literatura tienen indicaciones precisas y limitadas (1,2).

Los intentos de siembra de hepatocitos a través de la inyección en la vena esplénica o en la vena porta se encuentran lejos de ofrecer una solución temporal como puente al trasplante debido a la muerte precoz de los mismos y un número incapaz de corregir anormalidades o de rescatar al paciente de una insuficiencia hepática. Los cultivos de hepatocitos primarios pierden su morfología y función normal a los pocos días por una des-diferenciación o transformación en una transición epitelio-mesenquimal. Por otra parte se reportan complicaciones inherentes a la técnica tales como trombosis portal, hipertensión portal y embolia pulmonar entre otras (1,3,4).

Los andamios biológicos tridimensionales son comúnmente usados en cirugía reconstructiva. Vracko (5) describe la importancia de la matriz extracelular (MEC) para mantener la estructura y la regeneración hepática; avances recientes muestran la capacidad de la MEC para mantener el fenotipo de los hepatocitos y su función (1,4,6).

La creación de andamios tridimensionales de MEC a través de un proceso de descelularización de hígados donde puedan sembrarse posteriormente hepatocitos, células madre u otras estirpes celulares que puedan diferenciarse en hepatocitos con el fin de conseguir un hígado trasplantable en seres humanos es otra línea de investigación. Algunos grupos de investigadores proponen diferentes modelos de descelularización para obtener un andamio biológico que permita la posterior siembra celular (1,3,4,7-11) . La descelularización se obtiene a través del uso de agentes físicos y/o químicos que rompen por diferentes mecanismos las células del órgano dejando solo la MEC que será la que brindará soporte a la posterior siembra celular (12).

El objetivo del presente trabajo es presentar una técnica de descelularización propia en hígado de conejos y evaluar el resultado de la misma.

 

Material y métodos

Para el presente trabajo fueron operados 6 conejos machos neozelandeses de 2.100 ± 120 g con el objetivo de realizar una hepatectomía total con preservación de su vasculatura. Un conejo fue destinado para el conocimiento anatómico de la región, a otro conejo se le extrajo el hígado y fue destinado para control histológico y cuantificación de ADN. Los hígados de los cuatro conejos restantes fueron incorporados al protocolo de descelularización. Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo a las normas del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio aprobados por el comité de la Universidad Nacional de Córdoba. Se minimizó el sufrimiento y el número de animales utilizados.

Técnica quirúrgica

La anestesia se efectuó con ketamina 35 mg/kg de peso corporal asociada a xilacina 5 mg/kg por vía intramuscular (IM) como única dosis. Los conejos fueron colocados en posición decúbito dorsal con fijación de extremidades.

Cirugía: incisión mediana que posteriormente se amplió al hemitórax derecho. Identificación de la vena mesentérica e inyección intravenosa de heparina 1.000 UI.

Identificación de la tríada portal que se carga sobre una ligadura, identificación y disección de la vena cava inferior infrahepática, liberación del hígado de adherencias. Ampliación de la incisión hacia el tórax, identificación, disección, ligadura y sección de la vena cava inferior suprahepática. Hepatectomía total (Figs. 1 y 2).

Introducción de un catéter o cánula de teflón por vena cava inferior suprahepática o infrahepática que se fija con puntos de prolene 4/0 e inicio de perfusión de solución PBS para lavado.

Colocación del órgano en solución de PBS con hielo molido para transporte y su posterior congelamiento a -80 oC.

Técnica de descelularización

El hígado se congeló en 500 ml PBS durante 24 h a -80 oC y posteriormente se descongeló a temperatura ambiente para ayudar a la lisis celular.

El catéter o cánula de teflón introducido en la vena cava se conectó a una bomba peristáltica y se iniciaron ciclos de perfusión retrógrada a una velocidad de entre 6 y 10 ml/min de la siguiente manera. En primer lugar, se lavó 4 horas con tripsina 0,02 % y EDTA 0,05 % en agua deionizada. En segundo lugar, se perfundió con Triton X-100 3 % y EGTA 0,05 % en PBS. Se realizaron 3 lavados de dos horas cada uno, seguidos de un lavado de 16 h y 3 lavados posteriores de 2 horas cada uno. En tercer lugar, se usó el detergente iónico SDS (0,1 % en agua desionizada), el cual se perfundió durante 4 horas. En cuarto lugar, se volvió a perfundir el órgano con Triton X-100 y EGTA (3 % y 0,05 % en PBS) durante 14 horas. Posteriormente se realizaron lavados sucesivos con agua desionizada y PBS para arrastrar los restos celulares y los detergentes (1 hora de agua desionizada, 2 lavados de 1 hora con PBS, 30 min de agua desionizada, 2 lavados de 30 min con PBS). Por último se perfundió durante una hora con etanol al 4 % en PBS para desinfectar el órgano.

Evaluación microscópica

Microscopía óptica. Para la evaluación de la efectividad de descelularización se utilizaron dos técnicas de tinción histológica, una con hematoxilina-eosina (HE) y la otra, una técnica de tinción de plata de Wilde para evaluación de fibras reticulares (colágeno tipo III). Estas tinciones se realizaron en el hígado control y en los descelularizados.

Microscopía electrónica de Barrido. Un meticuloso análisis de la cápsula de Glisson y del parénquima hepático se realizó mediante microscopía electrónica de barrido en el LASEM, INIQUI-CONICET, UNSa. Se utilizó un microscopio electrónico de barrido marca JEOL modelo JSM 6480 LV.

Cuantificación de ADN

La cantidad de ADN se cuantificó usando el método descrito por Laird y cols. (13). Brevemente, se cortaron 25 mg de tejido proveniente de hígados control y descelularizado, a los cuales se trozaron y homogeneizaron en una solución conteniendo tripsina 0,25 % y EDTA 1 mM en agua desionizada. El homogenado se incubó a 37 oC con agitación durante 4 horas. Luego se continuó la lisis celular con una solución conteniendo SDS 2 %, EDTA 5 mM, NaCl 200 mM y TRIS-HCl 100 mM, pH 8,5 durante 24 h a 55 oC. Luego se realizó la extracción de ADN en isopropanol y la posterior disolución del mismo en una solución de TRIS. HCl 10 mM, 0,1 mM EDTA, pH 7,5. La cantidad de ADN se determinó por espectrofotometría a 260 nm.

 

Resultados

La técnica quirúrgica pudo llevarse a cabo sin dificultades, la identificación de los elementos anatómicos fue simple. La canulación de la vena cava se efectuó en dos oportunidades de manera suprahepática y en dos desde la cava infrahepática, las primeras dos con catéter K33 y en las siguientes con cánula de teflón N.o 16. La cantidad de PBS perfundida para realizar la limpieza del hígado previa a la congelación fue de 210 ml aproximadamente.

La técnica de descelularización se efectuó de la manera descrita previamente en los cuatro hígados de conejos y el tiempo empleado fue de 94,30 horas incluyendo las 24 h de congelación y las 5 h de descongelamiento a temperatura ambiente (Figs. 3 y 4).

La tinción del árbol biliar realizada en dos de los conejos con azul de metileno a través de la punción vesicular mostró la existencia de conductillos biliares como se observa en la Fig. 5. Una mezcla de azul de metileno con agarosa se perfundió a través de la vena cava en otros dos conejos, en los que se objetivó una buena tinción vascular (Fig. 5).

Desde el punto de vista histológico cuando se comparan los controles con HE y tinción de reticulina con los preparados descelularizados, se observa la desaparición total del patrón celular y la ausencia completa de núcleos; en la tinción de reticulina se evidencia la presencia de fibras reticulares sin restos celulares en el hígado descelularizado (Figs. 6 y 7, respectivamente).

Por otra parte cabe destacar que en la tinción con HE se observó la presencia de una tríada portal en el hígado descelularizado.

La técnica de SEM mostró que la morfología de la cápsula de Glisson es similar a la del hígado control (Fig. 8). En la Fig. 9, la SEM mostró en el parénquima hepático una descelularización completa respecto al parénquima del hígado control. Un test de Student para muestras no apareadas mostró que la cuantificación de ADN fue significativamente diferente (t = 4,151, p < 0,001) entre los valores de la matriz descelularizada (1.958 ± 579 ng/mg de tejido) y el hígado control (192 ± 53 ng/mg) (Fig. 10).

Discusión

La cantidad insuficiente de órganos para trasplante ha generado la búsqueda de opciones alternativas para cubrir estas necesidades. Desde las publicaciones alentadoras de descelularización exitosa de corazón realizadas por Ott y cols. (14) y la posterior comunicación de Uygun y cols. con hígado (8), diferentes grupos han comenzado el desarrollo de técnicas de bioingeniería para obtener como producto final un órgano trasplantable a partir de un andamio tridimensional de MEC, involucrando primero la descelularización del órgano y la posterior siembra de líneas celulares. El objetivo de la descelularización de un hígado es obtener un andamio de MEC con una arquitectura adecuada, contenida en una cápsula de Glisson intacta y con la estructura vasculobiliar lo más conservada posible (4,8).

Las técnicas y materiales utilizados para lograr este proceso son motivo de incesante revisión con el objetivo de lograr una mayor lisis celular preservando la MEC y disminuyendo el tiempo necesario para lograrlo. En la bibliografía existen diferentes protocolos en los cuales se modifican y se combinan de diferente manera los agentes químicos y físicos usados, así también como el tiempo de aplicación de los mismos (12,15). La elección del detergente se realiza básicamente por las características del órgano o tejido que se pretende descelularizar, por ejemplo la descelularización de un tendón requerirá detergentes diferentes que para la del pulmón o del hígado (12). Los protocolos de descelularización hepática publicados hasta la fecha involucran la perfusión a través de la vena porta o cava de combinaciones de los detergentes: Triton X-100 y SDS; y el animal donante del hígado en estos trabajos fue la rata. Uygun y cols. perfundieron el hígado con SDS 0,1 % (8), mientras que Shupe y cols. lo hicieron usando concentraciones crecientes de Triton X-100 seguidos con SDS 0,1 % (11). Por otro lado Soto y cols. usaron primero un agente enzimático: tripsina y luego Triton X-100 al 3 % (4). Previamente probamos estos protocolos (4,11) y no obtuvimos una descelularización completa. Eliminamos la alternativa de perfundir solo con SDS ya que en la literatura se describe que permite una buena descelularización debido a que es muy efectivo para eliminar los restos celulares pero con mucha pérdida de factores de crecimiento y de estructura hepática (12) necesarios para el proceso de recelularización. Atendiendo a lo anterior, desarrollamos un nuevo protocolo utilizado en este trabajo que involucra un primer tratamiento con tripsina, la cual permite un mejor ingreso de los detergentes al tejido, luego SDS 1 % y finalmente una perfusión con Triton X-100. Por lo tanto, la descelularización se efectuó mediante una combinación de un tratamiento enzimático (tripsina), seguido de un detergente iónico (SDS) y finalmente de un detergente más suave no iónico (Triton X-100). Esta estrategia de usar tres agentes diferentes en el proceso de descelularización minimiza el tiempo de contacto de cada uno de estos agentes con la MEC y por otro lado elimina las células y sus restos por tres mecanismos de acción diferentes favoreciendo una mayor descelularización (12). Cabe aclarar que cambiar de especie animal significa un cambio en el tamaño del órgano a ser descelularizado y que esto implica el desarrollo de un nuevo protocolo de trabajo ya que la penetración de los detergentes al interior del tejido así como la eliminación de los restos celulares a medida que aumenta el tamaño del órgano es más complicada.

La evaluación del resultado de la descelularización de los hígados se realiza mediante microscopía óptica (MO) con tinción de HE, microscopía electrónica de barrido (SEM), presencia de núcleos celulares con la técnica DAPI, cuantificación de ADN y determinación de longitud de pares de bases (bp). En este último caso se considera exitosa la descelularización cuando se logran fragmentos con un número menor a 300 bp según algunos autores, aunque otros proponen que deben tener menos de 200 bp. Esto disminuiría o no generaría reacción inflamatoria en el huésped (4,16,17). La búsqueda de restos de ADN en andamios comerciales demostró contenido de restos celulares y ADN en los mismos, aunque estos no serían suficientes para desencadenar una respuesta inflamatoria. Por otra parte la cuantificación de Gal alfa 1,3 también resultó insuficiente para desencadenar un rechazo agudo, este último sería el responsable de los mismos en los xenotransplantes (16,18). Ante la posibilidad de la presencia de restos de ADN de retrovirus en andamios biológicos para xenotrasplante que pudieran transmitir posteriormente una enfermedad al huésped, varios estudios, algunos de ellos en células porcinas apoptósicas, refieren que no cabría esa posibilidad (19-21).

Los resultados obtenidos en nuestra experiencia mostraron una descelularización satisfactoria cuando los observamos en la tinción con HE en la MO que permiten corroborar la existencia de una MEC bien conservada. Asimismo, la tinción para fibras de reticulina (colágeno tipo III) evidenció la presencia de las mismas en el hígado descelularizado. También en la MO pudimos observar la presencia de la tríada portal completa, dato importante ya que la preservación de conductos biliares es un característica deseada y de difícil alcance en este proceso. La presencia de un tracto biliar preservado posibilita la posterior reconstrucción del mismo con células epiteliales biliares (4), de la misma manera que la red vascular preservada permitirá la posterior siembra de las células endoteliales.

La visualización microscópica de los conductos biliares se constató en la tinción macroscópica realizada del árbol biliar a través de la punción y tinción de la vesícula biliar. Además, el árbol vascular se conservó después del proceso de descelularización, lo cual se evidenció mediante la perfusión a través de la vena cava de azul del metileno en agarosa al 2 %.

Atendiendo a lo observado en nuestra experiencia y coincidiendo con algunos autores, consideramos que el uso de combinaciones que incluyan tripsina, SDS, Triton X-100 asociado a EGTA, previa congelación a -80 oC como se mostró previamente, son por ahora y para nosotros las mejores alternativas para lograr una descelularización aceptable en un hígado de alrededor de 100 g. Aunque la aparición de nuevos productos o la incorporación de otras técnicas como la sonicación o la electroporación pueden en el futuro formar parte del protocolo (15,22). La mayoría de los hígados descelularizados por otros grupos son de ratas lo que implica descelularizar tamaños hasta 10 veces menores que los de conejos, por lo que si se logra una recelularización de un hígado del tamaño del que posee el conejo, la masa celular trasplantable ofrecerá mejores oportunidades de recuperación de la función hepática a los pacientes (7). Una técnica quirúrgica depurada preservando los elementos vasculobiliares y la cápsula de Glisson, así como la introducción de la cánula de teflón o de un catéter de manera cuidadosa permitirán una perfusión adecuada de los diferentes lóbulos del hígado de conejo. A diferencia de algunos y en concordancia con otros autores preferimos realizar la perfusión de manera retrograda (flujo cavo-portal), ya que de esta manera la perfusión se logra de una forma más completa que haciéndolo de manera anterograda (porto-caval) (3,4). De la misma manera el manejo de una bomba peristáltica con flujos que oscilan entre 6 y 10 ml/min de manera controlada ayuda a garantizar como resultado una MEC con una arquitectura conservada. El protocolo de descelularización propuesto por nuestro grupo mostró resultados satisfactorios tanto en la tinción con HE, técnica para colágeno III, SEM y cuantificación de ADN. El tiempo requerido para la descelularización, incluyendo el tiempo de congelación fue inferior a 96 horas.

En conclusión, si bien los resultados obtenidos son alentadores existen algunos puntos en los que debemos seguir trabajando, uno de ello es verificar la presencia de factores de crecimiento en nuestra MEC debido a que en el posterior proceso de recelularización es necesaria la presencia de los mismos (23). Estos factores son imprescindibles porque dictarán el comportamiento, la adhesión, migración, diferenciación, proliferación y supervivencia de las células sembradas (1,6,24). En un protocolo de descelularización con características similares al descrito por nosotros, la cantidad remanente de factores de crecimiento fue alrededor del 30-50 %, lo cual permitió la recelularización de la MEC con hepatocitos (4). Por último y una vez abocados a la recelularización, la provisión de oxígeno y de nutrientes al cultivo adquirirá relevancia para obtener un órgano útil y funcional.

 

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Paul Hobson la traducción del texto y a Silvia Blanco la asistencia técnica de la microscopía electrónica de barrido. N.A.S. es investigadora de la carrera de investigador científico del CONICET.

 

 

Dirección para correspondencia:
Gustavo Adrián Nari
Servicio de Cirugía
Hospital Florencio Díaz. Argentina
e-mail: gusnari@hotmail.com

Recibido: 10-10-2012
Aceptado: 26-12-2012

 

 

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