REVISIÓN

 

Regeneración hepática; el secreto mejor guardado. Una forma de respuesta al daño tisular

Liver regeneration - The best kept secret. A model of tissue injury response

 

 

Javier A.-Cienfuegos, Fernando Rotellar, Jorge Baixauli, Fernando Martínez Regueira, Fernando Pardo y José Luis Hernández Lizoáin

Departamento de Cirugía General. Clínica Universidad de Navarra. Pamplona

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

La regeneración hepática (RH) representa una de las formas más extraordinarias de respuesta al daño tisular. Debido a sus implicaciones terapéuticas, ha sido motivo de un interés extraordinario en las últimas décadas.
La RH es un proceso muy complejo y estrictamente regulado que cumple las características de los sistemas biológicos más evolucionados (robustness) y que explica la dificultad de interferir en ella con usos terapéuticos.
La RH reproduce el modelo fisiológico de respuesta al daño con una fase primera de preparación o "cebado" de los hepatocitos -transición G0-G1 del ciclo celular- y una fase ulterior de proliferación -fases S/M del ciclo- que termina con la recuperación de la masa hepática.
Dicho proceso se ha relacionado con los mediadores de la respuesta biológica al daño tisular: hormonas, sistema del complemento, plaquetas, citocinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β, IL-6), factores de crecimiento (HGF, EGF, VGF, etc.) y factores antiinflamatorios (Il-10, TGF-β).
Debido a su complejidad y a su estricta regulación, se explica que todavía hoy la única alternativa a la insuficiencia hepática sea el trasplante hepático.
La identificación reciente de las células pluripotenciales inducidas (iPS) y la capacidad plástica de las células madre mesenquimales (CD133+) ha suscitado nuevas expectativas a la terapia celular regenerativa. Dichos trabajos han confirmado la cooperación entre las células mesenquimales y epiteliales.
En el presente trabajo se describen los mecanismos fisiológicos de la regeneración hepática.

Palabras clave: Regeneración hepática. Respuesta inflamatoria estéril. Ciclo celular. p53. Respuesta estrés hiperproliferativo. Células pluripotenciales inducidas (iPS).

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ABSTRACT

Liver regeneration (LR) is one of the most amazing tissue injury response. Given its therapeutic significance has been deeply studied in the last decades.
LR is an extraordinary complex process, strictly regulated, which accomplishes the characteristics of the most evolutionary biologic systems (robustness) and explains the difficulties of reshaping it with therapeutic goals.
TH reproduces the physiological tissue damage response pattern, with a first phase of priming of the hepatocytes -cell-cycle transition G0-G1-, and a second phase of proliferation -cell-cycle S/M phases- which ends with the liver mass recovering.
This process has been related with the tissue injury response regulators as: complement system, platelets, inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6), growth factors (HGF, EGF, VGF) and anti-inflammatory factors (IL-10, TGF-β).
Given its complexity and strict regulation, illustrates the unique alternative to liver failure is liver transplantation.
The recent induced pluripotential cells (iPS) description and the mesenchymal stem cell (CD133+) plastic capability have aroused new prospects in the cellular therapy field. Those works have assured the cooperation between mesenchymal and epithelial cells.
Herein, we review the physiologic mechanisms of liver regeneration.

Key words: Liver regeneration. Sterile inflammatory response. Cell-cycle. p53. Hyperproliferative stress response. Induced pluripotentianl cells (iPS).

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Abreviaturas
AP-1: proteína activadora 1.
ABs: ácidos biliares.
ATP: adenosina trifosfato.
AR: amfiregulina.
ARNm: ácido ribonucleico mensajero.
Cdc25b: fosfatasa 2 inductora de fase M.
Cdk: quinasa dependiente de ciclina (del inglés: cyclin-dependent kinase).
CD117: células progenitoras hematopoyéticos.
CD133: células progenitoras endoteliales.
Ckls: inhibidores de los complejos Cdk-ciclina.
Cl4C: tetracloruro de carbono.
C-met: receptor de membrana de HGF.
CT-1: cardiotrofina 1.
C3a: fragmento proteolítico "a" de la proteína C3 del complemento.
C3b: fragmento proteolítico "b" de la proteína C3 del complemento.
C5a: fragmento proteolítico "a" de la proteína C5 del complemento (anafilotoxina).
DAMP: patrones moleculares asociados a la lesión (del inglés: damage-associated molecular pattern).
DNA: ácido desoxirribonucleico.
EGF: factor de crecimiento epidérmico.
EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico.
FAH -/-: homozigosis para la mutación de la flumaril acetotato hidrolasa (tirosinemia).
Fase M: fase de mitosis.
Fase S: fase de síntesis de DNA.
FGF: factor de crecimiento fibroblástico.
FXR: receptor X farnesoide.
gp 130: glicoproteína 130.
GSK3β: quinasa de la glucógeno sintetasa 3β.
G0: fase 0: "de descanso, quiescencia del ciclo celular". Del inglés: GAP.
G1: fase 1: "preparativa del ciclo celular, entre la fase M y la fase S". Del inglés: GAP.
G2: fase 2: "preparativa del ciclo celular, entre la fase S y la mitosis". Del inglés: GAP.
HB-EGF: factor semejante al factor epidérmico ligado a la heparina.
HGF: factor de crecimiento de los hepatocitos.
HIF-1α: factor de transcripción inducido por hipoxia 1α.
HMGB1: proteína de alta movilidad del grupo de caja 1 (high movility group box 1).
Hsp: proteínas del choque térmico (heat shock proteins).
IGF-1: factor de crecimiento insulínico.
IkbKβ: inhibidor citoplasmático de NF-Kβ.
IL: interleucina.
IL-1β: interleucina 1 beta.
IL-6: interleucina 6.
IL-18: interleucina 18
IL-6R/gp130: glicoproteína 130 receptor de IL-6.
iPS: células madre pluripotenciales inducidas (induced pluripotent stem cells).
JAK: proteína tirosina quinasa Janus o Janus quinasa.
KO: animal defectivo para un gen (del inglés: knout-out).
Linfocitos NK: linfocitos citolíticos naturales (del inglés: natural killer).
LPS: lipoproteína bacteriana.
MAPK: proteína quinasa activada por mitógeno.
ME: matriz extracelular.
Myc: oncoproteína Myc.
NF-Kβ: factor nuclear Kappa β.
NKT: linfocitos citolíticos naturales.
NLRP: subfamilia de receptores tipo NOD (NLR, del inglés: NOD-like receptors: nucleotide digomerization domain - containing protein).
NOD: proteína con el dominio de oligomerización que se une a nucleótidos (del inglés: nucleotide digomerization domain - containing protein).
PAF: factor activador de las plaquetas.
PAMP: patrones moleculares asociados a microorganismos patógenos (del inglés: pathogen associated molelular patterns).
PDGF: factor de crecimiento plaquetario.
Punto R: punto de "restricción" del ciclo celular.
p53: proteína p53.
RH: regeneración hepática.
ROS: radicales libres de oxígeno.
RRP: receptores para el reconocimiento de patrones.
RTK: receptor tirosina quinasa (del inglés: receptor tyrosine kinases).
RTT: receptores tipo toll (toll-like receptors).
SOCS: supresores de proteínas transmisoras de señales de citocinas.
SOCS-3: supresor de la señalización de citocinas.
STAT3: activador de la transcripción y transductor de la señal 3 (del inglés: signal transducer and activator of transcription).
TFG-α: factor de crecimiento transformante alfa.
TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa.
TNF-R: receptores del factor de necrosis tumoral.
TPM1: triptófano hidrolasa.
VEGF: factor de crecimiento endotelio-vascular.

 

"La naturaleza adapta el órgano a la función y no la función al órgano".
Artistóteles, en Sobre los Animales

 

Antecedentes

La regeneración hepática (RH) es uno de los fenómenos biológicos más enigmáticos y fascinantes de la escala animal. La rápida restauración del volumen y de la función hepática tras una hepatectomía mayor (> 70 %) o un daño hepatocelular severo y su estricta regulación en el inicio y en el cese de la regeneración, es una propiedad exclusiva del hígado (1-9).

La RH es el fundamento de aplicaciones clínicas, como las resecciones hepáticas extensas (> 70 % del parénquima hepático o cinco segmentos), el trasplante segmentario de cadáver (split liver transplantation) o de donante vivo, las hepatectomías secuenciales, la embolización portal aislada o asociada a transección hepática "in situ", el soporte artificial temporal en la insuficiencia hepática aguda y de las posibles aplicaciones clínicas de la terapia celular (10-21) (Fig. 1).

 

 

Aunque la capacidad regenerativa del hígado ya estaba reflejada en las penas infligidas por Zeus a Prometeo (Eschilo: 525 a.c.) no fue hasta 1879 cuando se realizó la primera descripción científica de la regeneración hepática (22-24). Dicha capacidad representa una de las respuestas fisiológicas más extraordinarias para mantener el medio interno. Además de las funciones homeostáticas y metabólicas, el hígado es el mayor órgano sólido inmune del organismo y el primer filtro natural para micro-organismos (bacterias, virus) y moléculas potencialmente tóxicas (xenobióticos) procedentes del intestino (25-28). En los últimos 50 años ha habido un interés extraordinario en conocer los mecanismos básicos de la RH e identificar posibles aplicaciones clínicas (4,7,29-31). En el presente artículo describimos las bases fisiológicas de la RH y su relación con situaciones clínicas.

 

Características de la regeneración hepática

En condiciones basales los hepatocitos permanecen en estado "quiescente" o fase G0 (G cero) del ciclo celular, pero, a diferencia de otros tejidos, mantienen la capacidad de reiniciar el ciclo celular ante cualquier lesión, pérdida de tejido hepático o a estímulos exógenos (factores de crecimiento, mitógenos) (32-35).

La regeneración se ha estudiado en múltiples modelos experimentales; desde cultivos celulares, a modelos "in vivo" de hepatopatía inducidos por tóxicos (Cl4C, galactosamina, tioacetamida), productos bacterianos (LPS), virus, y en modelos quirúrgicos como la hepatectomía del 70 %, o el trasplante hepático parcial. También se ha estudiado en animales modificados genéticamente en los que se ha sobre-expresado un gen (knock-in) o en animales knock-out (KO) en los que se ha inducido la deleción específica o condicional de un gen (2,5,36-38). Otros autores han realizado estudios transcripcionales analizando la expresión de miles de genes, tratando de obtener un patrón representativo de la regeneración (39-43). En la tabla I se resumen algunos de los modelos descritos.

 

 

De los modelos referidos, destacan los que evalúan la restauración del volumen hepático, la función hepática y supervivencia de los animales. Aunque los modelos KO han sido cruciales para identificar las vías de señalización y transcripción de la RH, debido al carácter pleiomórfico y redundante de la regeneración, su interpretación es difícil (40).

El modelo más utilizado es la hepatectomía del 70 % en roedores, ya que representa el mayor estímulo de regeneración y garantiza la respuesta sincrónica y homogénea del hígado remanente (36-38). Este modelo ha permitido comparar la regeneración en animales control -"tipo silvestre"- con animales modificados genéticamente para las moléculas de señalización, sus receptores y factores reguladores del ciclo celular (2,4,5,44).

Tras una hepatectomía o una lesión aguda, la recuperación de la masa hepática se debe a una "hiperplasia compensatoria" del hígado residual, y no a una regeneración epimórfica del tejido perdido, como ocurre en vertebrados inferiores -pez Zebra o la Salamandra- los cuales la capacidad de regenerar las extremidades amputadas u otras estructuras -la cola, la mandíbula inferior, el ventrículo cardiaco- a lo largo de toda su vida (45-49).

Estos animales regeneran el tejido perdido a partir del "blastema" formado por la desdiferenciación de células adultas en células precursoras tejido-específicas y por células madre mesenquimales (45,47,48).

Las características de la RH se pueden resumir en las siguientes:

1. Se trata de un fenómeno presente en todos los vertebrados, desde el pez Zebra hasta el ser humano, del que se han descrito mecanismos comunes: participación del sistema inmune innato, desarrollo de ploidía y aneuploidía, remodelación tisular y regulación estricta del volumen hepático (34,46,50,51).

2. La RH es una respuesta controlada, según el patrón descrito en la figura 2. La duplicación de los hepatocitos, las secuencias replicativas de las células mesenquimales, la morfogénesis y el control del volumen al término de la regeneración, están regulados genéticamente. Se trata de un fenómeno distinto de la embriogénesis y de la cicatrización tisular, aunque existan vías de señalización y programas transcripcionales comunes (4,49,52).

 

 

3. Es un proceso muy rápido que se inicia en segundos y termina en pocos días -5,7 días, dependiendo de la edad y de la especie-, con la restauración del volumen hepático, y en el que intervienen mecanismos de señalización -autocrinos, paracrinos y endocrinos-, los genes responsables de la proliferación celular, la morfogénesis, la "zonalización" hepática y la regulación del metabolismo (1,2,4,5,37,44,53). En los últimos años se han identificado las vías de señalización y transcripción de la RH, muchas de ellas relacionadas con la respuesta fisiológica del hígado al daño celular. En el presente trabajo veremos cómo en la RH se reproduce el patrón de los mecanismos de adaptación al daño tisular (54-56).

La RH se inicia con el reconocimiento de los patrones moleculares asociados a microorganismos patógenos (PAMP, del inglés: "pathogen-associated molecular pattern") o de los patrones moleculares asociados al daño celular (DAMP, del inglés: "damage associated molecular pattern"); generando una respuesta inmune innata -activación de las fracciones C3a y C5a del complemento, producción de TNF-α, síntesis de IL-6, IL-1β, IL-18- que estimulan la división de los hepatocitos mediante la transición del estado basal G0 a la primera fase G1 del ciclo celular (fase G1, del inglés Gap) (fase de preparación) y que ocurre en las primeras 4 horas tras una hepatectomía (57-67).

4. En la RH se reproducen las fases del ciclo celular, lo que ha suscitado un gran interés en conocer la expresión génica, los mecanismos de regulación y su traslación a otras situaciones, como el cáncer (33,35,42). La proliferación celular se sucede en un orden cronológico y secuencial; primero se dividen los hepatocitos y posteriormente las células de Kupffer y endoteliales, seguido de la neoformación de vasos y de los canalículos biliares, hasta reproducir la estructura hepática. Tras una hepatectomía del 70 %; el 95 % de los hepatocitos pasan en 4 horas de la fase G0 a la fase G1 del ciclo celular (1,4,68); al término de la cual existe el punto crítico de control, llamado de restricción ("R"), que determina si las células se dividen de forma irreversible. Hasta entonces el proceso es reversible y los hepatocitos podrían regresar a su estado previo (G0) si no se dieran las condiciones idóneas (factores de crecimiento, citocinas, etc.). Posteriormente progresan por las fases del ciclo celular hasta la división celular o citocinesis de los hepatocitos (69,70) (Fig. 2).

A los 30 minutos de una hepatectomía, se ha descrito un aumento de los factores de transcripción preformados en el citosol como respuesta a la unión de las citocinas a sus receptores: el transductor de señal y activador de la transcripción STAT3 (activador de la transcripción y transductor de la señal 3), factor nuclear Kappa-β (NF-Kβ) y la proteína activadora 1 (AP-1); que estimulan la síntesis de proteínas y la expresión de los genes necesarios para iniciar el ciclo celular (fase de preparación). En la rata, se ha descrito un incremento en la síntesis de DNA (fase S) a las 24 horas de la hepatectomía, y en el ratón, a las 36 horas. Los hepatocitos entran en mitosis de forma sincronizada a las 48 horas, seguidos de las células de Kupffer. Las células estrelladas y las del epitelio biliar tienen su fase S a las 48 horas y proliferan de forma más lenta. Las células endoteliales inician su proliferación a los 3 días, expresando un pico a los 5 días de la hepatectomía (3,4,42,68,71-73).

A las 72 horas de la hepatectomía, una subpoblación de los hepatocitos retornan al estado basal G0, mientras que otros reinician la mitosis hasta su retorno al estado previo G0, con la restauración de la masa hepática (4,6,72). Se ha postulado que este segundo pico proliferativo se debe a factores de crecimiento sintetizados por los propios hepatocitos o a co-mitógenos como la norepinefrina, insulina, somatostatina y el glucagón (1,2,4).

Recientemente, Miyaoka y cols. (52) han descrito que tras una hepatectomía del 70 %, los hepatocitos duplican su tamaño celular en las primeras 24 horas y se dividen 1,5 veces. Dichos autores han cuantificado el aumento del tamaño en 1,6 veces, y en 0,7 divisiones por célula, confirmando que la regeneración hepática se debe tanto a una hipertrofia como a la proliferación de los hepatocitos. Dichos autores observaron que, tras una hepatectomía menor (≤ 30 %), el hígado remanente aumentaba a expensas del tamaño celular en 1,4 veces; sin acompañarse de división celular (52).

Desde el punto de vista morfológico, en las primeras horas se observan acúmulos de hepatocitos (10-14 células mononucleadas y binucleadas con diferente grado de ploidía: tetraploides -4n-, octaploides -8n-; -16n-, -32n-). A los 2-4 días, se observa la proliferación de células estrelladas y sinusoidales, aumentando el tamaño de los lóbulos (35,74,75).

Ding y cols. (76) han confirmado la secreción de factores angiocrinos y la neoformación de vasos. La hipoxia relativa del hígado remanente induce la expresión de factor de transcripción, inducido por hipoxia (HIF-1α) -a las 12-48 horas de la hepatectomía parcial- que activa el factor de crecimiento endotelio-vascular (VEGF), el factor de crecimiento fibroblasto (FGF) y la sintetasa inducible de óxido nítrico (iNOS) (77-81). La proliferación de los hepatocitos progresa desde las áreas periportales a las áreas pericentrales del lobulillo. Una vez re-establecido el volumen inicial se produce un fenómeno de apoptosis, remodelación tisular y zonalización de los hepatocitos (42,44,72,82,83).

5. A diferencia de otros órganos sólidos como la piel o el intestino, la RH se debe a la proliferación de los hepatocitos maduros y de las células mesenquimales: células de Kupffer, endoteliales, estrelladas, linfocitos NK, y no a la proliferación y diferenciación de las células madre pluripotenciales o a las células ovales; si bien se ha descrito su proliferación cuando la regeneración hepática es insuficiente o está abolida, como en hepatopatías crónicas (1,2,3,5,42,44,72,84-87).

Con la identificación de las células ovales -precursoras de los hepatocitos y colangiocitos-, así como el descubrimiento de la plasticidad tisular de las células madre hematopoyéticas, de las células progenitoras endoteliales (CD133, CD117) y de las células madre pluripotenciales inducidas (iPS), descritas en 2005 por el premio Nobel de 2012 Shinya Yamanaka (88-90), en los últimos 20 años se ha producido una explosión de trabajos relacionados con la terapia celular en todo tipo de hepatopatías (91,92). Debido al ingente número de trabajos, referimos al lector a unas revisiones excelentes (93-97). A pesar de las enormes expectativas, los resultados han sido escasos incluso en los ensayos realizados con hepatocitos aislados en los errores congénitos del metabolismo, limitándose en la mayoría de los casos a una mejoría temporal (20,98). Recientemente se han publicado estudios preliminares mediante la infusión de factores de crecimiento de médula ósea (factor estimulante de granulocitos; G-CSF) en pacientes con el síndrome de insuficiencia aguda sobre crónica, y con la infusión de células progenitoras de médula ósea (CD133) en hepatopatías crónicas con fines regenerativos (96-99). Los resultados clínicos, al igual que ha ocurrido en otros órganos sólidos (corazón, páncreas, intestino), sugieren que la regeneración tisular es un proceso más complejo y dependiente de la cooperación específica entre diferentes estirpes celulares (87,100-102).

6. La capacidad regenerativa del hígado es casi ilimitada. Se han descrito hasta 7 hepatectomías del 50 % consecutivas en la rata, sin provocar insuficiencia hepática ni disminuir su potencial regenerativo (2-4). En un modelo de tirosinemia homozigota en el ratón (FAH -/- Miles), el trasplante de hepatocitos corrigió el déficit metabólico. Cuando se aislaron los hepatocitos trasplantados, estos revirtieron el déficit enzimático en una segunda generación de ratones FAH -/-; y así sucesivamente hasta ¡diez generaciones! Se ha estimado que los hepatocitos de un ratón podrían sufrir hasta 69 duplicaciones (generar 50 hígados de ratón) (103,104).

7. Otro enigma de la RH es la regulación estricta entre el volumen hepático y la superficie corporal, expresado como índice hepático (peso hígado/peso total x 100 ~ 2,5 %), conocida como regulación "hepatoestática". En el trasplante clínico y experimental -injertos pequeños en receptores grandes y viceversa- se ha confirmado la adaptación del volumen hepático donante a la superficie corporal del receptor. Dicho control se ha descrito incluso en el xenotrasplante de babuino al hombre (4,105-107). Aunque la regeneración se ha relacionado con los cambios en el núcleo, durante la división celular se deben duplicar los orgánulos citoplasmáticos. El control de la relación entre el tamaño del citoplasma y la duplicación de los cromosomas es uno de los mecanismos peor conocidos (69,108-110). La mayoría de los factores de crecimiento (el PDGF, el factor de crecimiento epidérmico -EGF-, el factor de crecimiento hepatocitario -HGF- y el factor de crecimiento insulínico -IGF-1-), además de tener efectos mitógenos, aumentan el tamaño y la supervivencia celular, inhibiendo la apoptosis (5,69,108). En los vertebrados inferiores y en los mamíferos, es frecuente observar hepatocitos poliploides, tetraploides (4n), octaploides (8n), bien mononucleados o binucleados (2 x 2n; 2 x 4n; 2 x 8n) a consecuencia de una alteración en la citocinesis (Figs. 3 y 4). El grado de ploidía varía según las especies; en las ratas el 80 % de los hepatocitos son poliploides y aneuploides, en el ratón el 60 % y en el ser humano entre 30-70 % (75,111). La primera consecuencia de la ploidía es el aumento del tamaño de los hepatocitos (2,112,113). Se ha postulado que el tamaño celular depende del contenido nuclear de DNA, de forma que un número mayor de cromosomas permite aumentar el tamaño (114-116).

 

 

Tras una hepatectomía en roedores se ha descrito una disminución de los hepatocitos binucleados desde el 20 % al 5 % y un aumento de los hepatocitos tetraploides -4n- y octaploides -8n-; e incluso hepatocitos 16n a las 72 horas, expresando que la hepatectomía es un estímulo muy intenso para la duplicación del DNA previo a la citocinesis (2,112,116,117).

En animales en los que se había inhibido la separación de los cromosomas, la recuperación de la masa hepática tras una hepatectomía se debió a la poliploidía de los hepatocitos -18n, 32n y n superiores- (118,119). Este fenómeno -conocido como endoreduplicación- da lugar a múltiples secuencias replicativas de los cromosomas sin la división celular, generando células con varias copias del genoma, capaces de aumentar la expresión génica (120). Duncan y cols. (35,74,111) han descrito la capacidad de los hepatocitos para desarrollar poliploidía y su reversión incluso a la aneuploidía como mecanismo de adaptación a estímulos xenobióticos o dietéticos. Es llamativo que en estos casos la función hepática fuera normal, confirmando la equivalencia funcional entre hepatocitos 2n, 4n y 8n (2,112).

Recientemente Kurina y cols. (117) han descrito el papel regulador de p53 en la integridad del genoma, tanto en hepatocitos quiescentes como durante la regeneración (7 días post-hepatectomía). Dichos autores han descrito que los ratones KO para p53 (p53 -/-) expresan un grado mayor de ploidía que ratones control p53 +/+, y que inician antes la división, desarrollan un tamaño mayor del núcleo y del citoplasma, y un grado mayor de ploidía que ratones p53 +/+ (tipo silvestre o control) tras una hepatectomía del 70 %. La ausencia de p53 altera la reversión de la ploidía, por lo que la regeneración en animales p53 -/- se debe primordialmente al aumento del tamaño celular. Aunque la recuperación de la masa hepática a los 7 días de la hepatectomía era equivalente en ambos grupos de ratones, dichos autores observaron más errores en la integridad cromosómica en los ratones p53 -/- (husos multipolares y cromosomas perezosos) que en los animales control (p53 +/+) (52,117,121,122).

8. Diversos autores han resaltado que cuanto más severo es el daño hepático (resecciones extremas > 70 % del parénquima, trasplante entre vivos con injertos ≤ 30 %, necrosis hepática submasiva...), más intensa es la respuesta proliferativa del hígado, y viceversa (52,113-116). En el trasplante entre vivos se ha descrito que la regeneración del injerto en el receptor es más rápida que la del hígado remanente en el donante, y que los injertos más pequeños (≤ 30 % del volumen estándar del hígado) regeneraban más rápidamente que los injertos mayores (≥ 40 %, considerado este como el mínimo aceptable) (123,124). Este patrón es similar a la respuesta fisiológica al estrés o al daño tisular (32,125-132).

9. El hígado -a pesar de su complejidad metabólica- mantiene las funciones homeostáticas: síntesis de proteínas, factores de coagulación, anti-proteasas, detoxificación de xenobióticos, etc. durante la regeneración. Estudios con microarrays han mostrado una respuesta selectiva en las primeras 40 horas, priorizando la expresión de los genes relacionados con la división celular y silencionando los relacionados con el metabolismo hidrocarbonado (42,72). Estudios con microscopia óptica y electrónica han revelado, a las 24 horas de una hepatectomía del 70 %, cambios selectivos en los hepatocitos de la zona 1, en contraste con la zona 3 del lobulillo hepático (34,42,72).

Wu y cols. (82) han referido que existen tres picos en la síntesis de DNA de los hepatocitos, inicialmente en la zona 1 y posteriormente en la zona intermedia del lobulillo. Curiosamente el 15 % de los hepatocitos no se dividen, mientras que un 11 % de los hepatocitos se dividen al menos tres veces, desconociéndose la causa.

10. El hígado es, con el cerebro, el órgano con mayor capacidad de mantener su integridad -morfológica y funcional- y responder a las alteraciones más variadas del medio interno. Esta propiedad está presente en otros "sistemas biológicos": homeostasis fisiológica, desarrollo de los tejidos, ciclo celular, resistencia ecológica, ritmo circadiano e incluso en el cáncer (133-135). Dicha propiedad se ha denominado como "robustness" o "fortaleza" y ha despertado gran interés en la biología evolutiva durante la última década. La RH reúne las cualidades requeridas: pleiomorfismo, redundancia y mecanismos de bio-feedback. Esto hace que su comprensión sea difícil y que, todavía, no se haya podido intervenir en la regeneración con fines terapéuticos (2,4,10,44).

 

Fases de la regeneración hepática

Se debe a Fausto y cols. (1,2) el mérito de haber integrado en un modelo "trifásico" los mecanismos celulares y moleculares de la RH. La RH puede dividirse en tres fases: una fase inicial de "preparación" o "cebado", que corresponde al paso de los hepatocitos quiescentes de la fase G0 a la fase G1 del ciclo celular, que ocurre en las primeras 4 horas tras la hepatectomía. Una segunda fase, o fase de "progresión", que corresponde a la transición desde la fase G1 hasta completar la mitosis (citocinesis); y una tercera fase de apoptosis, remodelación tisular y retorno a la fase G0. El modelo descrito se ha confirmado en especies diferentes y tiene la virtud de corresponderse con las fases del ciclo celular y del que se describen algunos aspectos básicos (32,69,136-138).

El ciclo celular se divide en cuatro fases: G1, S, G2 y M, según se describe en la figura 5. La síntesis del DNA, y la duplicación de los cromosomas, ocurre en la fase S (de síntesis). La segregración de los cromosomas tiene lugar en la fase M o mitosis, que se divide a su vez en cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase.

 

 

La división celular termina con la citocinesis, dando lugar a dos células semejantes que pueden reiniciar el ciclo o volver al estado de reposo G0. Las fases G1 y G2 (del inglés "Gap") o fases de "espaciado" o "preparativas" situadas antes de la fase S (síntesis de DNA) y de la fase M (mitosis) respectivamente, proporcionan tiempo para el crecimiento celular y regulan la transición a la fase siguiente dependiendo de señales intracelulares y extracelulares (69,137-139).

En el ciclo existen tres puntos de control: el punto "R" o de restricción que regula la entrada en el ciclo al final de la fase G1; y los dos puntos de control de la mitosis; el punto G2/M que controla el inicio de la mitosis y el punto de control de la transición metafase-anafase que da lugar a la segregación de las cromátidas "hermanas" y al término de la mitosis (69,70,136,140-142). El punto "R" regula la velocidad de la división celular y determina la irreversibilidad del ciclo. Una vez traspasado dicho punto la célula se dividirá inexorablemente aunque continúe sometida a los mecanismos de control (69).

La mayoría de los mitógenos y de los factores de crecimiento -factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDEGF), el EGF, el HGF y el factor de crecimiento transformador β (TGFβ)-, ejercen su acción en el punto de control "R" cuando la célula es más sensible a factores exógenos (138-140).

 

Fase inicial de "preparación" de los hepatocitos

Respuesta inicial inflamatoria estéril

Según el modelo descrito, la regeneración hepática es una respuesta fisiológica de adaptación al daño hepatocelular (63,143). El daño tisular se puede manifestar como "estrés celular" o como una de las formas de muerte celular: necrosis, apoptosis o necro-apoptosis (58,144-147). La necrosis induce la respuesta del sistema inmune innato debido al reconocimiento de los DAMP por los receptores de reconocimiento de dichos patrones (RRP). Dichos receptores se han descrito en la membrana plasmática, en las membranas endosómicas y en el citoplasma de las células mesenquimales y de los hepatocitos (44,54,55,61,62,148,149).

Dependiendo de la severidad de la lesión y de la respuesta regenerativa, la lesión será reversible o irreversible. En este último caso el hígado es incapaz de restaurar la homeostasis, lo que se asocia a una mortalidad muy elevada y cuya única alternativa es el trasplante hepático (hepatitis fulminante, síndrome "small-for-size", insuficiencia hepática aguda sobre crónica, insuficiencia hepática post-hepatectomía) (150-152). En dichas situaciones se desarrolla un cuadro de colestasis progresiva, coagulopatía, encefalopatía, sepsis y fallo multiorgánico; que algunos autores han relacionado con una respuesta inmune insuficiente. Otros autores han sugerido que un estímulo "mitogénico" excesivo, generaría el fenómeno conocido como "respuesta al estrés hiperproliferativo", que induce la apoptosis celular (153-155).

En 1994 Polly Matzinger formuló la teoría denominada "Danger", por la que el sistema natural inmune, además de reconocer los gérmenes patógenos y los componentes de la pared bacteriana, reconoce y responde a ligandos endógenos derivados del daño celular y de la necrosis, lo que se ha llamado "respuesta inflamatoria estéril" (54,55,59,156-158).

En la necrosis, el paso de moléculas intracelulares -DAMP- al espacio extracelular, estimula a los receptores de dichos patrones (RRP). Entre dichos receptores se encuentran el sistema del complemento y los receptores tipo Toll (RTT; del inglés "toll-like receptors") que se expresan en las membranas y en el citosol de los macrófagos, las células endoteliales, las células dendríticas, células NK y de los hepatocitos (159-163) (Fig. 6).

 

 

Los DAMP también son reconocidos por una subfamilia de receptores citoplásmáticos del daño y del estrés celular, denominados NLRP y pertenecientes a los receptores tipo-NOD (NLRs, NOD-like receptors) que una vez estimulados forman el complejo denominado "inflamosoma" y activan la liberación de interleucina-1β (IL-β) y de la interleucina-18 (IL-18), con efectos inflamatorios y promitóticos. El papel del receptor NLRP en la inflamación y en los mecanismos de supervivencia, ha despertado un interés extraordinario en los últimos años (164-166).

Desde la formulación de la teoría Danger por Matzinger, se han identificado DAMP relacionados con el daño celular: proteína de alta movilidad del grupo caja 1 (HMGB1), proteínas del choque térmico (Hsp, Hsp60, Hsp70), ácido úrico, DNA genómico, ATP, adenosina, heparan sulfato, oligosacáridos, fragmentos de degradación del ácido hialurónico, péptidos N-formilados mitocondriales, y que se han denominado con el nombre genérico de "alarminas" (59,63,167-169).

Es significativo que las proteínas de reconocimiento del sistema innato sean filogenéticamente anteriores a la separación entre animales y vegetales (hace mil millones de años) y a la adquisición del sistema inmunitario adaptativo. Desde la descripción de los receptores RTT en la Drosophila y en el ser humano, y de la teoría DANGER, se ha descrito el paradigma de la respuesta inmune innata en la reparación y regeneración tisular (170-176).

La unión de los receptores tipo Toll con sus ligandos, estimula varias cascadas de señalización que culminan con la expresión de IL-6, TNF-α e IL-β, y la activación de factores de transcripción citosólicos -NF-kβ, STAT-3, AP-1- que se traslocan al núcleo y ejercen efectos proliferativos (62). Los RTT participan en la regeneración mediante señales de pro-supervivencia e inhibición de la apoptosis en la mucosa intestinal en el colon, pulmón, piel y en la regeneración hepática tras la hepatectomía (63,170,177-179).

La RH también se ha relacionado con ligandos endógenos presentes en la circulación enterohepática: ácidos biliares (Abs), xenobióticos, LPS y con componentes de la matriz extracelular -fibronectina, heparan sulfato, fibrinógeno, oligosacáridos del ácido hialurónico- derivados de la lesión tisular (maniobras quirúrgicas) y diferentes tipos de estrés (180-185).

Las células mesenquimales, especialmente los macrófagos, una vez activadas por los DAMP, sintetizan citocinas proinflamatorias como la IL-1β; el TNF-α, la IL-6, el interferón-gamma (IFN-γ), prostaglandinas y el factor activador de las plaquetas (PAF) con funciones proliferativas y antiapoptóticas (63,167,186-188).

Las citocinas TNF-α e IL-6 inician la fase de preparación o "cebado" de los hepatocitos (transición G0-G1 del ciclo celular). Dichas citocinas señalizan a través de receptores para TNF (TNF-RI, TNF-RII) y para IL-6 (IL-6R/gp130). Son receptores tirosina-quinasas similares a los de los factores de crecimiento, que activan cascadas enzimáticas como las quinasas activadas por mitógenos (MAPK, mitogen activated protein kinases). A este grupo de quinasas pertenece la quinasa Janus, conocida como JAK, que una vez activada fosforila el factor de transcripción preformado STAT-3 (activador de la transcripción y transductor de la señal 3) (señalización JAK/STAT). La proteína STAT-3 se une al DNA promoviendo la expresión de los genes de respuesta precoz inmediata (IEGs): c-fos, c-jun y c-myc (llamados oncogenes), responsables del inicio del ciclo celular (Fig. 6). Se han descrito más de 180 de dichos genes que sintetizan las proteínas necesarias para abandonar el estado basal G0 (1,4,5,42,44,72,118,188-191).

Esta fase de preparación o "cebado" se inicia en los primeros 30 min y perdura durante las primeras 4 horas post-hepatectomía. Además del factor STAT-3, otros factores de transcripción preformados son el factor nuclear Kappa-β (NF-kβ) y la proteína activadora 1 (AP-1); necesarios para la síntesis "de novo" de las proteínas reguladoras de la transición G0-G1 y G1/S. Con técnicas de manipulación genética en animales knock-out y knock-down se ha confirmado la participación de STAT-3, NF-kβ y AP-1 en la regeneración hepática (192-195).

Animales con mutaciones en los receptores de TNF-α (TNF-R1), expresaban una inhibición de la transcripción de NF-kβ y una alteración severa de la regeneración, confirmando que la transducción de NF-kβ en las células de Kupffer es crucial en la respuesta a las citocinas. Ratones KO para los receptores gp130 de la IL-6 mostraban defectos menores en la proliferación celular. En animales KO para IL-6 (IL6 -/-) y su receptor (gp130), la administración de LPS tras una hepatectomía redujo la supervivencia, evidenciando el papel protector y estimulador de la IL-6 en la regeneración. La deleción hepato-específica de STAT-3 y de AP-1 disminuye la expresión de las ciclinas, cruciales para la transición de G0-G1 y G1-S del ciclo celular. Por el contrario, en animales en los que se indujo un aumento del factor NF-kβ -mediante el bloqueo de su inhibidor citoplasmático IkbKβ- se observó una respuesta inflamatoria y proliferativa más intensa (72,196).

Además de los mediadores inflamatorios -TNF-α, IL-6, C3a, C3b, LPS-, los factores de crecimiento como el HGF, PDGF y EGF también estimulan el paso G0-G1. El HGF señaliza a través de su receptor c-met, activa a STAT-3 e induce la expresión de genes de respuesta precoz inmediata. Ratones con una mutación condicional en el receptor Met, expresan un defecto en la regeneración (6,197,198).

Como veremos en la fase de proliferación, el HGF también regula la expresión de genes relacionados con otras fases del ciclo celular y tiene efectos de "pro-supervivencia" mediante la inhibición de la apoptosis (4).

Sistema del complemento y regeneración hepática

En modelos murinos de daño hepático -Cl4C, hepatectomía parcial- y en pacientes sometidos a una hepatectomía, se ha descrito un aumento de las fracciones activadas del complemento C3a y C5a en las primeras 24 horas (131,132,149). En ratones deficientes (KO) en la fracción C3 (C3 -/-) y en la fracción C5 (C5 -/-), se observó una alteración en la regeneración tras una hepatectomía del 70 %. En dichos animales se observó una reducción en los niveles de TNF-α y del ARNm de IL-6, y una disminución en los factores de transcripción NF-kβ y STAT-3 (172-174). La administración de un antagonista del receptor de C5a (C5a R) tuvo efectos similares con un aumento de la mortalidad; confirmando el papel del complemento en la fase inicial de cebado de los hepatocitos (199).

Los animales KO, C3 -/- y C5 -/-, desarrollaron lesiones hepáticas más severas que los animales control tras el daño inducido por la infusión de Cl4C y tras una hepatectomía parcial. En dichos animales los defectos en la regeneración y en el daño hepatocelular revirtieron tras la reconstitución con C3a y C5a. El mismo fenómeno y más intenso se observó en animales con la doble mutación (C3/C5 -/-) así como la recuperación de la regeneración con la administración de C3 y C5.

El grupo de Lambris (170) ha descrito que la fracción C3a induce la síntesis de IL-4 por las NKT en las primeras 24 horas de la hepatectomía y estimula la síntesis de las proteínas del complemento y de la IL-6 por los macrófagos en la fase de cebado de los hepatocitos. Las funciones reparadoras y tróficas del sistema del complemento han suscitado gran interés en la regeneración tisular. El sistema del complemento, además de su acción frente a bacterias, virus, hongos y células tumorales, es el componente humoral más rápido para reconocer el daño tisular a través de los DAMP e iniciar la respuesta de reparación tisular (170,199).

Plaquetas y regeneración hepática

Además de las funciones hemostáticas, las plaquetas expresan receptores tipo Toll 2, 4 y 9 y participan en la respuesta inmune innata. Dichos receptores reconocen los PAMP y los DAMP, por lo que algunos autores las consideran como los "guardianes circulantes" del daño tisular y un vestigio de los hemocitos de los invertebrados (200,201).

Las plaquetas contienen, en sus gránulos, fibrinógeno, factor Von Willebrand, proteínas de adhesión, factores proangiogénicos con efectos mitógenos, hepatoprotectores (VEGF, PDGF, HGF, IGF, EGF-1 y TGFβ), y el ¡95 %! de la serotonina circulante. Aunque son células anucleadas tienen ARN y pueden sintetizar más de 300 proteínas diferentes entre las que destaca el TGFβ (202,203).

En 1996 Tomikawa y cols. (204) describieron que la trombocitosis secundaria a la esplenectomía, estimulaba la regeneración hepática en roedores. Estudios posteriores confirmaron dichos resultados y el efecto opuesto de la trombocitopenia. El mismo grupo describió un aumento de la supervivencia mediante la inducción de trombocitosis en un modelo de hepatectomía subletal (> 90 %). Otros grupos han relacionado las plaquetas con un efecto protector sobre la disfunción hepática post-hepatectomía, e incluso con la mortalidad operatoria cuando eran < 100.000 plaquetas/μl. Los autores relacionaron estos resultados con los factores de crecimiento citados y el factor de crecimiento insulínico (IGF-1) (205,206).

Lesurtel, describió en 2006 el efecto estimulador de la serotonina en la regeneración hepática "in vivo", aunque ya se conocían sus efectos "mitógenos" "in vitro" sobre fibroblastos y hepatocitos (207). El mismo grupo confirmó sus hallazgos en animales KO para la enzima precursora de la serotonina (triptófano hidrolasa 1) (TPM1 -/-) y han descrito un aumento de la supervivencia en un modelo murino de "small-for-size" con la administración de un agonista sintético de la serotonina; 5-HT2B. En los animales tratados observaron un aumento en las fenestraciones endoteliales de los injertos (208).

Estos autores han descrito la reversión de la "pseudocapilarización" de los sinusoides en animales "viejos" y un aumento de la supervivencia tras una hepatectomía con la administración del mismo agonista; sugiriendo que la apertura de las fenestraciones endotelio-sinusoidales facilitaría el contacto directo de las plaquetas, citocinas y de los factores de crecimiento con los hepatocitos (208). Otros autores han atribuido el efecto proliferativo de la serotonina con el estímulo en la síntesis de VEGF. Por el contrario, Matondo y cols. (209) en un modelo murino KO (TPH1 -/-) deficiente en el transportador de membrana de la serotonina no observó ningún efecto tras una hepatectomía del 70 %.

Citocinas, factores de crecimiento y hormonas

En 1967 Moolten y Bucher describieron que el plasma de ratas hepatectomizadas tenían efectos mitógenos sobre los hepatocitos en modelos "in vitro" e "in vivo". Desde entonces se han identificado citocinas, factores de crecimiento, hormonas y metabolitos relacionados con el ciclo celular de los hepatocitos y de las células mesenquimales (4,210-213).

Citocinas de la familia IL-6

La IL-6 es una interleucina tipo I, asociada con la respuesta inmune innata. Debido a sus efectos citoprotectores, proliferativos y antiapoptóticos es la más relacionada con la regeneración hepática. Posteriormente se aislaron otras 7 interleucinas muy similares a la IL-6, que comparten los receptores de membrana tirosina-quinasa gp80 y gp130 como vía de señalización y que se han englobado con el término "familia de IL-6": IL-6, interleucina 11, factor inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina (OSM), factor neurotrófico ciliar (CNTF), cadriotrofina (CT-1) y la IL-27 (186-188,214-217).

La IL-6 se libera precozmente por los macrófagos como respuesta al daño tisular. Tiene efectos locales sobre los hepatocitos y sistémicos -fiebre, somnolencia, secreción de ACTH y vasopresina- propios de la respuesta sistémica al estrés. Estimula la síntesis hepática de los reactantes de fase aguda (proteína C reactiva, amiloide A y además tiene efectos proinflamatorios similares al TNF-α e IL-1 (218-221).

La IL-6 se une a receptores de membrana gp130, provocando la dimerización de dos subunidades gp130 (222). Dichos receptores están unidos a las tirosina-quinasas que residen en el citoplasma, denominadas tipo Janus (JAK1, JAK2, JAK3 y TyK2). La dimerización de gp130 y su unión con el receptor correspondiente (IL-Rα) promueve la activación de las quinasas tipo JAK que fosforilan y activan los factores de transcripción como STAT-3. Las proteínas STAT (7 en el hombre), ubicadas en el citosol, migran al núcleo para unirse a promotores del DNA y estimular la transcripción génica de la proliferación celular, supervivencia y/o muerte celular (Fig. 6) (223,224).

El STAT-3 activado induce la transcripción de los genes de respuesta precoz inmediata c-jun, c-myc, c-fos y el de crecimiento precoz (Egr-1). Además, la vía IL-6 / JAK-STAT-3 participa en la síntesis de proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-x. La vía JAK-STAT es una de las vías de transducción de señales más directas de la membrana al núcleo. La deleción hepatoespecífica de STAT-3 provoca una disminución en la expresión de las ciclinas D1 y E1, necesarias para iniciar el ciclo celular (72,191,192).

Además de STAT-3 existen otras dos vías de transcripción mediadas por receptores tirosin-quinasa, el factor nuclear KB (NF-kβ) y la proteína activadora 1 (AP1). El factor NF-kβ se encuentra habitualmente inactivo en el citoplasma debido a la proteína inhibidora IkbKβ. La unión de una citocina con su receptor estimula la degradacion del inhibidor IkbKβ, liberando el factor NFkβ que se trasloca al núcleo y activa la transcripción de las proteínas de la fase aguda y los genes pro-proliferativos y antiapoptóticos mencionados. Tras una hepatectomía (70 %) o un daño hepático -isquemia, Cl4C, administración de LPS- se produce una rápida elevación de TNFα e IL-6. Ratones KO para IL-6 (IL-6 -/-) tras una hepatectomía desarrollaron un fallo hepático que revertía cuando previamente se administraba IL-6 (225). En los animales IL-6 -/- apenas se inducía la activación de STAT-3. En modelos KO condicionales para STAT-3 (ya que el STAT-3 -/- es letal en el periodo embrionario) se ha confirmado su efecto protector en lesiones inducidas por adenovirus (198). En modelos murinos de hepatotoxicidad, de isquemia-reperfusión y colestasis severa, se ha descrito el efecto citoprotector de la IL-6. Recientemente se ha confirmado el efecto antiapoptótico de la IL-6 en hepatectomías extremas (87 %) y la rápida regeneración de injertos "pequeños" (≤ 30 %) evitando el síndrome "small for size" (226-229). El factor de transcripción AP-1 promueve la expresión de los genes de respuesta precoz inmediata en las primeras 5 horas post-hepatectomía; especialmente la oncoproteína Jun que facilita la transición G0-G1 y G1-S (72).

Una de las citocinas de la familia IL-6 que ha suscitado gran interés es la cardiotrofina-1 (CT-1). El grupo de Prieto y cols. ha descrito su efecto protector en la apoptosis e inductor de la regeneración en modelos de isquemia-reperfusión, hepatectomía extensa (92 %) y de hepatitis fulminante (230-232).

Receptores de vías metabólicas y xenobióticas

Además de la capacidad de los hepatocitos para pasar del estado quiescente (G0) al de división celular, el hígado remanente debe realizar las funciones metabólicas específicas del hígado durante la regeneración (2,4,5,42,72). La expresión de los genes relacionados con el metabolismo son inicialmente suplantados por los genes relacionados con la formación del citoesqueleto, el ensamblado del huso mitótico y la mitosis. Estudios transcripcionales han mostrado que en las primeras horas se produce un silenciamiento de los genes metabólicos (primeras 40 horas tras la hepatectomía) y una recuperación al término de la mitosis (42,233).

Se ha confirmado que los mecanismos de transcripción dependientes del metabolismo de los ácidos biliares (Abs), de la detoxificación de drogas y de la regulación del metabolismo hidrocarbonado, participan en la fase inicial de preparación o "cebado". Es bien conocida la regulación hepática del "pool" de los ácidos biliares en la circulación enterohepática (234). En humanos este "pool" se mantiene entre 2 y 4 g, y recirculan unas 12 veces al día, y en ratones se mantiene en los 4 mg (235). Un aumento de los ácidos biliares daña las membranas celulares, provoca un daño mitocondrial y puede conducir a la apoptosis y necrosis celular (236,237).

La homeostasis de los ácidos biliares se debe a receptores nucleares, entre los que se encuentra el "Farnesoid X-Receptor" (FXR). La unión de los ácidos biliares libres y conjugados con el dominio de unión de FXR, estimulan la transcripción de factores involucrados en las fases precoces de la regeneración (G1-S), como el FoxM1b, y de genes proliferativos (Cdc25) (166,180).

Al realizar una hepatectomía del 70 %, se provoca un aumento brusco del flujo portal al hígado remanente (1/3 de la masa original) por lo que se triplica el aporte de nutrientes y ácidos biliares procedentes de la circulación esplácnica (2,3,4,180,238-240).

Ratones deficientes en el receptor FXR muestran un retraso en la regeneración hepática y un aumento en la mortalidad tras la hepatectomía parcial (180). Estos animales son incapaces de activar los genes de respuesta inmediata c-myc, c-fos y c-jun. Por el contrario, en ratones sometidos a una hepatectomía parcial, la administración de ácidos biliares estimulaba la RH, y la administración de colestiramina retardó dicho proceso.

Los ácidos biliares estimulan la secreción de citocinas proinflamatorias como el TNF-α y la IL-1β por las células de Kupffer, con los efectos de prosupervivencia, antiapoptóticos y proliferativos (240). Por lo tanto, los ácidos biliares y los xenobióticos podrían comportarse como moléculas DANGER estimulando el inicio de la fase de preparación, además de los efectos mitógenos ya comentados sobre los hepatocitos, especialmente los de naturaleza más hidrofóbica.

Se ha descrito que la administración de agonistas del receptor FXR estimula la regeneración en animales añosos. Estos hallazgos, junto con los efectos citoprotectores de dichas moléculas, han sugerido su posible aplicación clínica (241,242).

La relación de las vías metabólicas con la regeneración es compleja, puesto que las variaciones metabólicas descritas pueden ser un epifenómeno secundario al bloqueo precoz de los genes "metabólicos", sin representar un estímulo regenerativo per se. Por ejemplo, algunos autores han descrito que la hipoglucemia persistente en ratones tras una hepatectomía estimula la regeneración, mientras que la adición de glucosa tras una hepatectomía parcial inhibe la regeneración (42,243). Dichos hallazgos parecen contradictorios con lo reseñado por Fisette y cols. (244,245); la infusión previa de glucosa e insulina en pacientes sometidos a una hepatectomía mayor, mejoraba la disfunción hepática y la regeneración.

La capacidad del hígado para responder a estímulos endógenos -ácidos biliares- y exógenos -xenobióticos-, al margen de los estímulos mitogénicos de las citocinas y factores de crecimiento, es exclusivo del hígado y puede explicar su potencial casi ilimitado de respuesta "robusta" a estímulos tan diversos como una hepatectomía, isquemia o una sobrecarga de ácidos biliares (4,42,240).

 

Fase de progresión

Transducción de señal mitogénica

Aunque no existe un límite nítido entre las fases de la RH, la fase de progresión comprende desde la fase G1 hasta la división celular (2,4,5,9). En este periodo, además de la cromatina, se deben duplicar los orgánulos citoplasmáticos -mitocondrias, aparato de Golgi, lisosomas, retículo endoplásmico- necesarios para preservar la función hepática y mantener una relación constante entre el tamaño del citoplasma y del núcleo (69,73,109,110).

La fase de progresión está regulada por los factores de crecimiento ya mecionados, el HGF, EGF, VEGF y TGF-α, que además de efectos mitógenos, tienen efectos tróficos y de pro-supervivencia (antiapoptóticos). La función primordial de los factores de crecimiento es activar los complejos ciclina-Cdks que inician y promueven los cambios del ciclo celular: duplicación del huso mitótico y la replicación del DNA en la fase S.

De forma similar a las citocinas, la mayoría de los factores de crecimiento también transmiten la señal mitógena al núcleo a través de los receptores de membrana y citoplasmáticos con actividad tirosina-quinasa (RTK) que promueven la cascada de las quinasas. La cascada MAP-quinasa induce la expresión de los "genes de respuesta precoz inmediata propoliferativos" (c-fos, c-jun, c-myc) cuya expresión es el primer evento transcripcional (dos horas tras una hepatectomía). Entre los factores codificados por estos genes promitóticos destacan los factores FosM1b y Myc (1-6,42,43,246).

El factor FosM1b aumenta durante la primera hora post-hepatectomía y facilita el ensamblado y activación del factor de transcripción AP-1, que estimula la expresión de los "genes de respuesta tardía" (dos días post-hepatectomía). Estos genes también codifican las ciclinas de la fase G1 (D1, D2, D3) necesarias para el inicio del ciclo (42).

Los ratones KO para c-jun, fallecen el 50 % tras una hepatectomía. El déficit en la regeneración se asocia a un incremento en la muerte celular y a un acúmulo de lípidos en los hepatocitos. A nivel molecular se observa un aumento de la proteína inhibidora de la transición G1-S.

El factor FosM1b promueve la expresión de los genes de respuesta tardía (al segundo día post-hepatectomía) y la transición G2-M. Estudios en ratones KO hepato-específicos para FosM1b, han confirmado el papel de dicho factor para la entrada en la mitosis y segregación cromosómica (247). Se ha observado que hepatocitos que sobreexpresaban FosM1b "reconstituían" los hígados de ratón previamente dañados, más eficientemente que hepatocitos de animales control. Este efecto se confirmó incluso en hepatocitos "añosos", albergando la posibilidad terapéutica en pacientes mayores con hepatopatías crónicas (248).

El factor Myc permanece elevado durante todo el ciclo e induce la transición por el punto de control "R" y de los genes relacionados con el tamaño celular y el metabolismo (108). Los niveles de ciclina D también permanecen elevados durante todo el ciclo mientras el mitógeno esté presente, sugiriendo que la expresión de la ciclina D responde al estímulo mitogénico con independencia de la fase del ciclo (108).

En las células quiescentes -fase G0- los escasos complejos ciclina D-CdK están inhibidos mediante la fosforilación de la ciclina D lo que genera su exportación fuera del núcleo y su destrucción en el citoplasma. Dicha función está catalizada por la quinasa glucógeno sintetasa (GSK3β), muy activa en los hepatocitos en reposo. La GSK3β también inhibe otros factores que promueven la proliferación celular, como la expresión génica de la ciclina D1, del factor AP-1, de Myc, y la expresión de la ciclina D2 y Cdk4. La GSK3β fosforila y destruye la b-catenina citoplasmática, bloqueando su traslación al núcleo e inhibiendo su estímulo proliferativo (108).

Los factores de crecimiento y hormonas como la insulina que señalizan a través de la cascada de las quinasas Ras -MAP- fosforilan e inhiben la GSK3β, permitiendo la síntesis de glucógeno y la activación de los factores preformados AP-1 y Myc que estimulan la proliferación celular.

Hassanain y cols. (244,245) han descrito el efecto beneficioso de la infusión de insulina y dextrosa en pacientes sometidos a una hepatectomía mayor. Dichos autores observaron un aumento del glucógeno hepático y una mejora de la función hepática postoperatoria. Además del efecto protector del glucógeno como fuente de energía para la división celular, la inhibición de la GSK3β facilitaría la expresión génica necesaria para la respuesta regenerativa. El efecto trófico de las hormonas pancreáticas sobre el parénquima hepático y la regeneración ya fue descrito por Starzl y cols. (249-252) en 1967.

Factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF)

El HGF se aisló en 1984 al identificar el factor sérico de ratas hepatectomizadas que estimulaba la proliferación de hepatocitos in vitro, por lo que también se denominó "hepatopoyetina" (253). Debido a su efecto mitógeno in vivo e in vitro, es el factor de crecimiento que ha suscitado mayor interés. Además de los efectos mitógenos tiene efectos motógenos, tróficos, antiapoptóticos, angiogénicos y morfogénicos en el desarrollo del hígado, cerebro, placenta, pulmones, intestino, miocardio y sistema reproductivo (211,253,254).

El HGF se sintetiza por las células mesenquimales y se almacena como forma precursora pro-HGF en la matriz extracelular (ME). El HGF es una glicoproteína muy similar a los factores de coagulación y de la fibrinolisis (plasminógeno). La activación del pro-HGF se debe al efecto proteolítico del activador del plasminógeno tipo uroquinasa (μ-PA) (2,4,69,255-261).

Tras una lesión hepática aguda se produce un aumento brusco -10 a 20 veces- del HGF plasmático. Dicha elevación se debe a la liberación del HGF almacenado en la ME y a la síntesis de HGF por los macrófagos estimulados por la IL-6 y TNF-α. Además, el HGF se sintetiza por células mesenquimales de otros órganos -pulmón, riñón, bazo- lo que confirma su efecto endocrino (2,4,259,260,262-265). El HGF señaliza a través de un receptor tirosina quinasa -C-met- cuya fosforilación se observa entre 1 y 15 minutos tras la hepatectomía, hasta los 60 min. En humanos, se ha descrito una elevación más prolongada del HGF; hasta dos semanas post-hepatectomía. Los niveles más elevados se han descrito en la hepatitis fulminante, hallazgo que cuestionó su posible eficacia terapéutica en dicha situación. Este fenómeno paradójico -incapacidad para estimular la proliferación de hepatocitos y prevenir su muerte celular, con niveles muy elevados de HGF- se ha atribuido al "bloqueo del receptor C-met" ante el aumento simultáneo -inhibición competitiva- de otras moléculas de señalización como IL-6 y TGF-β1 en el plasma, o bien al fenómeno ya descrito como "respuesta el estrés hiperproliferativo", por el que un estímulo mitogénico excesivo provoca apoptosis celular mediante la activación del p53 (61,266-270).

La infusión sistémica e intraportal de HGF en roedores, aumenta la síntesis de DNA en los hepatocitos de la zona 1, y la infusión intraportal de HGF "humano" en ratones, provoca la proliferación de los hepatocitos y hepatomegalia (2,4).

La transfección del gen humano -HGF- mediante inyección hidrodinámica del plásmido DNA en el ratón induce hepatomegalia por la activación de la vía β-catenina; y la infusión de cantidades elevadas de HGF aumenta el tamaño del hígado, asociado con el estímulo de las mitogénesis. La retirada de HGF generó una apoptosis marcada y una reinstauración del DNA hepático a los niveles basales (2,4,255,271).

El "pretratamiento" con colagenasa en ratas que posteriormente recibieron HGF, potenció el efecto de HGF. Asimismo, se observó que los hepatocitos aislados mediante la digestión del parénquima con colagenasa, expresaban precozmente marcadores de inicio del ciclo celular. Dicho efecto "preproliferativo" es compatible con el fenómeno de adquisición de competencia -fase muy inicial de G1- descrito por Pardee en 1989, por el que los hepatocitos "competentes" responden más rápidamente a un estímulo regenerativo posterior (1,4,73).

Se ha sugerido que la remodelación de la matriz extracelular -liberación de metaloproteinasas- sería una fase inicial de la regeneración, sensibilizando los hepatocitos al HGF almacenado en el hígado. Probablemente la remodelación de la matriz extracelular, mediada por uroquinasa y metalo-proteinasas, generan la liberación de DAMP -derivados del daño tisular-, capaces de generar una respuesta inflamatoria estéril mediante la activación de los receptores tipo Toll y consecuentemente la activación de los factores de transcripción NF-Kβ, AP-1 y STAT-3 relacionados con el inicio del ciclo celular (54,55,59).

El receptor de membrana con actividad tirosina-quinasa "C-met" está presente en las células epiteliales y mesenquimales. La activación corriente abajo del receptor C-met promueve la cascada de las quinasas activadas por mitógenos (MAP quinasas) y esta estimula los factores de transcripción citosólicos (AP-1) relacionados con la proliferación y la supervivencia celular. Además, el HGF señaliza a través de la quinasa tipo Janus que activa los factores de transcripción STAT-3, el factor nuclear NF-Kβ y la b-catenina. La unión del HGF con el receptor C-met fosforila la β-catenina, facilita su traslocación al núcleo y la expresión de ciclina D necesaria para la transición G0-G1 del ciclo celular (2,4,188,264,267,268).

En modelos murinos transgénicos se ha confirmado la importancia del HGF y su receptor C-met en la respuesta regenerativa del hígado. Ratones deficientes (null mice) en HGF y en su receptor C-met, fallecen durante la gestación y expresan una disminución del tamaño hepático y de las células parenquimatosas (270). Dos grupos independientes han estudiado la regeneración en ratones KO para C-met en el hígado (KO condicional). En dichos ratones, tras una hepatectomía, se observó una disminución de la síntesis de DNA y una ausencia de señalización de las quinasas activadas por mitógenos (MAP quinasas). En dichos animales la administración de Cl4C generó una alteración en la regeneración y cambios inflamatorios más intensos (197,271).

Factor de crecimiento epidérmico (EGF)

Lo componen una familia de 7 factores entre los que destacan: el factor de crecimiento epidérmico (EGF), la amfiregulina (AR), el factor semejante al EGF ligado a la heparina (HB-EGF) y el factor de crecimiento fibroblástico α (TGF α). Dichos factores se sobreexpresan con una lesión hepática. Señalizan a través de receptores de membrana tirosina-quinasa (RTK): EGFR/ErbB1, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 y HER4/ErbB4, y culminan con la activación corriente debajo de la cascada activada por mitógenos (MAPK quinasa) (4,73,272).

Los ratones carentes de receptores de EGF fallecen entre la mitad de la gestación y los primeros 20 días post-natales con defectos en la placenta, cerebro, piel y pulmón (273). En animales en los que se inhibió los receptores del EGF, tras una hepatectomía, fallecían 1/3 y los que sobrevivían mostraban un retraso en la división de los hepatocitos (274). Sin embargo, finalmente tenía lugar la regeneración completa del hígado, sugiriendo que la señalización del receptor EGF es importante pero no esencial para la RH (61,274).

El resto de los factores de la familia EGF también se sintetizan como pro-factores que permanecen fijados a la membrana de los hepatocitos de la que son liberados mediante una proteolisis. Tras una hepatectomía se elevan los niveles plasmáticos de EGF aumentando el cociente EGF/EGFR, confirmando que el EGFR ejerce un papel mitógeno en la fase inicial de la regeneración (4).

El papel del factor HB-EGF se ha estudiado en modelos KO y en animales transgénicos. En el primer caso se objetivó un retraso en la proliferación de los hepatocitos y, en el segundo, se estimulaba la proliferación y se aceleraba la regeneración. Animales carentes de amfiregulina mostraron una alteración de la respuesta regenerativa tras una hepatectomía (275,276).

El TFG-α se sintetiza por los propios hepatocitos -efecto autocrino- y tiene efectos paracrinos sobre las células endoteliales y del epitelio biliar. Tras una hepatectomía, los niveles de TFG-α aumentan entre las 24 y 48 horas. Se ha observado que in vitro e in vivo estimula la síntesis de DNA y, que la adición de TFG-α en cultivos de hepatocitos, estimula la transición a través del punto de control "R" (277,278).

Sin embargo, ratones homozigotos con una deleción en el gen TFG-α expresan una regeneración normal, indicando que el TFG-α es "dispensable" en la regeneración, reforzando su carácter "robusto". En un modelo murino, con sobre-expresión de TFG-α humano, se objetivó un aumento de la proliferación y hepatomegalia (279,280,281).

 

Cese de la regeneración y regulación del tamaño hepático

La regeneración termina con la restauración de la masa hepática inical necesaria para realizar las funciones hepáticas (índice hepático ~ 2,5 %). La regulación estricta de dicho índice es una de las propiedades más sorprendentes ya que representa un control estricto del cese del ciclo celular y una remodelación del tejido "neoformado" (2,4,5,42,61,72,73).

El cese de la regeneración se ha relacionado con citocinas antiinflamatorias, proapoptóticas y con factores "hepatostáticos" como la IL-10, las proteínas supresoras de señalización de citocinas (SOCS-3), el inhibidor del activador del plasminógeno PAI-1 y especialmente el TGF-β (5,6,61,282).

Estudios con microarrays en roedores y en el cerdo, han confirmado que a la sobreexpresión inicial de genes pro-mitóticos le sucede una suplantación por genes metabólicos y posteriormente por los relacionados con el cese de la proliferación y el retorno al estadio previo quiescente (34,41,61,72,73).

El TGF-β comprende una familia de citocinas (TGF-β1-3) relacionadas con el desarrollo y la cicatrización. Señalizan a través de dos receptores (tipos I y II) que activan a los reguladores de la transcripción, conocidos como proteínas SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic), que se translocan al núcleo. En la mayoría de los tejidos, el TGF-β inhibe la proliferación en la fase G1 del ciclo (283-285).

Se ha descrito que tras una hepatectomía, el ARNm de TGF-β aumenta precozmente, aunque se produce una resistencia transitoria de los hepatocitos al TGF-β por una disminución en la expresión de sus receptores y una sobreexpresión de sus inhibidores. Dicha resistencia remite tras la síntesis de DNA, recuperando la sensibilidad al TGF-β que inhibe la proliferación celular e induce el cese de la regeneración (en la rata a los 5-7 días, y tres semanas en el cerdo) (286-288).

En modelos trangénicos y en animales a los que se infundía directamente TGF-β en diferentes fases de la regeneración, se han confirmado sus efectos antiproliferativos, aunque debido al carácter pleiotrópico de la regeneración, no se observaron cambios relevantes. Ratones transgénicos con sobreexpresión de los receptores de TGF-β, sólo sufrían un retraso en la proliferación celular (61,289,290).

Más significativo es que ratones KO para el receptor II de TGF-β (TGFR2 -/-) muestran una síntesis precoz e incrementada de DNA -primeras 120 horas tras hepatectomía- pero tampoco expresaban diferencias en el cese de la regeneración respecto a los animales control, quizá por la existencia de otras vías inhibitorias de la síntesis de DNA (291).

Otros miembros de la superfamilia TGF-β son las activinas, siendo la más frecuente la activina A. Se identificó en 1993 como un factor proapoptótico de los hepatocitos in vitro. La activina A induce la activación intracelular de SMAD de forma similar a TGF-β, por lo que se considera que ejercen funciones complementarias. La inyección de follistatina, un antagonista del receptor de la activina A tras una hepatectomía, provocó un aumento de la proliferación hepatocitaria y del peso hepático, confirmando que la activina A inhibe la proliferación y un posible regulador del final de la regeneración (5,61,73,292).

En hepatocitos en cultivo, y en modelos "bioartificiales", se ha resaltado el papel de la matriz extracelular en la diferenciación y proliferación de los hepatocitos (60,61,73). A pesar de ser el 0,5 % del peso hepático, la ME tiene un papel activo en la respuesta al daño tisular y en la regeneración. La ME, además de albergar factores de crecimiento -PDGF, TGF-β, VEGF, HGF-, contiene citocinas, metaloproteinasas -colagenasa, gelatinasa- y macromoléculas como fibronectina, laminina y colágena (tipos I, III y VI), muy reactivas cuando se altera la barrera endotelio-sinusoidal (184,185,293-298). Tras una lesión hepática -trauma quirúrgico, isquemia, tóxico, etc.- se libera el activador del plasminógeno tipo uroquinasa (μ-PA) y las metaloproteinasas, que liberan los factores de crecimiento de sus formas precursoras (pro-HGF → HGF) y degradan macromoléculas (fibrinógeno, fibronectina, laminina) con la liberación de moléculas -DAMP- que inducen la respuesta inflamatoria estéril (teoría DANGER) e iniciando la fase de purgado de los hepatocitos (60,156,157,185).

Se ha descrito que la proliferación inicial tras una hepatectomía se asocia a una degradación de la matriz extracelular; dando lugar a acúmulos de hepatocitos neoformados, con un acceso limitado a los factores endocrinos y paracrinos que, en condiciones basales, inhiben la división celular. Los acúmulos hipertróficos requieren una remodelación tisular posterior hasta alcanzar el índice hepático inicial (72).

El grupo de Michalopoulos ha confirmado los efectos in vitro de una proteína inhibidora de la proliferación de los hepatocitos (integrina ligada a una quinasa, ILK) y han descrito que animales KO hepato-específicos para dicha proteína desarrollan un aumento de la proliferación y hepatomegalia (42,299). La ablación hepato-específica de dicha integrina altera el cese de la regeneración. A los 14 días de una hepatectomía, el hígado de los ratones deficientes en ILK alcanza un peso superior al 58 % del peso inicial. En dichos ratones se objetivó un aumento en la expresión de HGF y su receptor C-met, así como una disminución del inhibidor del ciclo celular p27 (299-302).

Debido al gran interés en el desarrollo de "hígados bioartificiales" mediante la "reconstitución" de las matrices de hígados previamente descelularizados con hepatocitos y/o células pluripotenciales, se ha impulsado su desarrollo ante la demanda creciente de injertos para trasplante tanto en el hígado, como riñón, pulmón y corazón (293-298,303,304).

p53 y control de la regeneración

En los organismos pluricelulares existen mecanismos de control del ciclo celular ante situaciones de estrés -falta de nutrientes, hipoxia, lesión del DNA- que detienen el ciclo o inducen la apoptosis celular (305,306).

El sistema más común es la familia de la proteína p53, conocido como "el guardián del genoma" ya que responde al daño del DNA y a otras situaciones de estrés (307-311) Aunque el p53 se conoce como un factor "oncosupresor" (se han referido más de 25.000 mutaciones de p53 en tumores humanos), recientemente ha suscitado interés por su papel en el control y cese de la RH (312).

Kurina y cols. han descrito que el gen p53 es necesario para revertir el alto grado de ploidía y aneuploidía observadas en situaciones basales y en la RH. La ausencia de p53 (ratones p53 -/-) se asoció con un grado muy superior de ploidía (8n y 16n) debido a fallos en la fase final del ciclo o en la citocinesis. Dichos autores han descrito, por primera vez, que p53 regula la expresión de los genes involucrados en las tres fases de la división celular, inicio-progresión, división y regreso al estado G0 tras la hepatectomía (117).

Es bien conocido que la activación de p53 detiene el ciclo celular e induce la apoptosis en situaciones de estrés celular, como la hipoxia severa, acidosis o ante un estímulo mitogénico excesivo. Este último mecanismo es conocido como "respuesta al estrés hiperproliferativo" (307,308) (Fig. 7). El aumento de la actividad de p53 incrementa la expresión del inhibidor p21 del ciclo celular y de las proteínas proapoptóticas (caspasas), causando una parada permanente del ciclo celular e incluso la muerte celular (307).

 

 

La actividad proliferativa de proteínas mitogénicas como Myc y Ras -"oncoproteínas"- solamente es posible en la ausencia de p53. La respuesta celular al estrés hiperproliferativo es el correlato in vivo del descrito in vitro como senescencia replicativa. Las células en cultivo, tras varias divisiones, sufren la detención estable del ciclo celular -senescencia replicativa- por el incremento de p53. La senescencia se ha atribuido al estrés hiperproliferativo -Myc y Ras hiperactivos- o a las condiciones poco fisiológicas in vitro: ausencia de los componentes de la matriz extracelular o niveles de oxígeno inadecuados. Por el contrario, células carentes de p53 proliferan indefinidamente en cultivos y se les ha denominado "inmortales" (313-317).

Aunque la respuesta al estrés hiperproliferativo se ha relacionado con mecanismos de protección frente al cáncer, dicha respuesta fisiológica podría producirse en situaciones con un estímulo mitogénico excesivo como el "síndrome de hígado pequeño", el fallo hepático fulminante, la insuficiencia hepática post-hepatectomía o la insuficiencia hepática sobre crónica. En dichas situaciones se produce un gran estímulo mitogénico derivado del daño endotelial -"estrés de rozamiento"-, la necrosis, hemorragia parenquimatosa, vasoespasmo arterial e hipoperfusión (150,151,318-320).

Hoy día se desconoce el porqué en unos casos el hígado regenera, y en otros, fracasa, desarrollando una insuficiencia hepática irreversible; y tampoco existe un criterio nítido sobre la cantidad mínima exigida de hígado remanente en una resección hepática o en el trasplante entre vivos (10,151,321-324). A pesar de la multitud de trabajos sobre la regeneración hepática, sus mecanismos de regulación continúan siendo un misterio (2,4-6,9).

 

Conclusiones y perspectivas futuras

La regeneración hepática es uno de los fenómenos biológicos más enigmáticos y extraordinarios de adaptación y respuesta para mantener la homeostasis interna. En las últimas décadas ha sido motivo de una investigación intensa debido a sus implicaciones terapéuticas. Se trata de un fenómeno muy complejo y estrictamente regulado que obedece al patrón de respuesta al daño tisular, con una fase inicial de preparación o "cebado" que corresponde a la transición G0-G1 del ciclo celular de los hepatocitos, y una fase posterior de proliferación -fases S y M- que termina con el restablecimiento de la masa hepática. Dicho proceso se ha relacionado con hormonas (insulina/glucagon), citocinas (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10), factores de crecimientos (HGF, EGF, VEGF) y, en la última década, con células madre hematopoyéticas mesenquimales (CD133⁺, CD) y células ovales.

La generación reciente de estructuras con fenotipo "hepatoide" en roedores a partir de células madre pluripotenciales inducidas (iPS), ha generado grandes expectativas como posible alternativa al trasplante hepático; aunque debido a la extraordinaria complejidad del hígado deben ser vistas con cautela (325,326).

En la RH se cumplen rigurosamente las características de los sistemas biológicos más regulados (robustness) -pleiomorfismo, redundancia y mecanismo de retroalimentación- como el ciclo celular, la respuesta inmune natural o el ritmo circadiano, y que explica la dificultad de su manipulación con fines terapéuticos.

Debido a la complejidad del hígado, los intentos de suplir sus funciones de forma temporal y definitiva han sido fallidos, salvo el trasplante ortotópico de hígado. Quizá el desarrollo de la terapia celular y el conocimiento de las bases moleculares y fisiológicas de la regeneración, podrán conseguir el sueño anhelado de utilizar la capacidad regenerativa del hígado en el tratamiento de hepatopatías, cuya única alternativa actual es el trasplante hepático.

La frase de Santiago Ramón y Cajal: "en general puede afirmarse que no hay cuestiones agotadas, sino hombres agotados en las cuestiones" es muy oportuna en el intento de desvelar el misterio de la regeneración hepática (327).

 

Agradecimientos

Los autores agradecen a Lydia Munárriz el excelente trabajo en la edición y transcripción del manuscrito; y a Fabiola de Goñi y Beatriz Urbelz por su colaboración en la transcripción bibliográfica. Los autores expresan el reconocimiento a los investigadores del Área de Hepatología del Centro de Investigación Médica Aplicada por sus valiosas sugerencias y aportaciones. Rogamos nos disculpen aquellos colegas cuyos trabajos no hemos citado por limitaciones de espacio.

 

 

Correspondence:
Javier A.-Cienfuegos.
Departamento de Cirugía General.
Clínica Universidad de Navarra.
Avda. Pío XII, n.^o 36.
31008 Pamplona
e-mail: fjacien@unav.es

Received: 19-07-2013
Accepted: 12-11-2013

 

 

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