REVISIÓN

 

Respuesta Th17 y autofagia: principales vías implicadas en enfermedad inflamatoria intestinal por los estudios de asociación de genoma completo. Nuevos factores implicados en la susceptibilidad a enfermedad inflamatoria intestinal

Th17 response and autophagy - main pathways implicated in the development of inflammatory bowel disease by genome-wide association studies: New factors involved in inflammatory bowel disease susceptibility

 

 

Roberto Díaz Peña¹, Eliana Valdés², Cecilia Cofré² y Patricia Castro-Santos¹

¹Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Autónoma de Chile. Talca, Chile.
²Departamento de Gastroenterología. Hospital de Talca. Talca, Chile

Proyecto interno de la Universidad Autónoma de Chile n.^o 36. Proyecto FONDECYT n.^o 11130198.

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una entidad que engloba principalmente a la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Las mejoras sanitarias, cambios en la alimentación y una mayor industrialización se han asociado con mayor prevalencia de EII lo que demuestra la gran importancia de diferentes factores ambientales en la etiopatogenia de esta patología. Sin embargo, la EII presenta al mismo tiempo un importante componente genético según demuestra su alta heredabilidad. Los estudios genéticos clásicos mostraron asociaciones con genes implicados en la respuesta inmune, consecuentes con las teorías expuestas sobre el desarrollo de la enfermedad en las que el contacto del sistema inmune del sistema digestivo con gran número de antígenos inocuos de la flora y de la dieta debe originar tolerancia, manteniendo al mismo tiempo la respuesta frente a los patógenos. Un desequilibrio en este sistema originaría la respuesta inflamatoria típica de la EII. Recientemente, estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han confirmado esta implicación del sistema inmune, particularmente de la respuesta inmune Th17, relacionada también con otras patologías autoinmunes. Otro proceso fuertemente implicado por estos estudios es el de la autofagia. En este artículo se revisan los mecanismos involucrados en estas dos vías y su posible relación con la patogenia de la EII.

Palabras clave: Enfermedad inflamatoria intestinal. Enfermedad de Crohn. Colitis ulcerativa. Th17. Autofagia. Estudios de asociación de genoma completo.

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ABSTRACT

Inflammatory bowel disease (IBD) is an entity that mainly includes ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD). Improved health care, diet changes, and higher industrialization are associated with an increase in IBD prevalence. This supports the central role of environmental factors in the pathology of this disease. However, IBD also shows a relevant genetic component as shown by high heritability. Classic genetic studies showed relevant associations between IBD susceptibility and genes involved in the immune response. This is consistent with prior theories about IBD development. According to these, contact of the immune system with a high number of harmless antigens from the diet and the bacterial flora should originate tolerance while preserving response against pathogens. Failure to achieve this balance may originate the typical inflammatory response associated with IBD. Recently, genome-wide association studies (GWASs) have confirmed the implication of the immune system, particularly the Th17 immune response, previously associated to other autoimmune diseases, and of autophagy. In this paper, the mechanisms involved in these two relevant pathways and their potential role in the pathogenesis of IBD are reviewed.

Key words: Inflammatory bowel disease. Crohn's disease. Ulcerative colitis. Th17. Autophagy. Genome-wide association studies.

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Introducción

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un proceso inflamatorio crónico que afecta principalmente al tracto gastrointestinal y que incluye tanto la colitis ulcerosa (CU) como la enfermedad de Crohn (EC) y entidades intermedias denominadas colitis indeterminadas que presentan rasgos de ambas. La CU se caracteriza por la inflamación y ulceración de la mucosa y submucosa del intestino grueso con distorsión de las criptas y depleción de células caliciformes mientras que la EC causa inflamación transmural con agregados linfocíticos y frecuentemente granulomas no caseosos que puede afectar a cualquier parte del intestino (1).

La prevalencia de esta enfermedad en países occidentales es de 30 a 200 afectados por cada 100.000 habitantes. Durante un tiempo se ha considerado una enfermedad típica de países occidentales. Sin embargo, la incidencia en otros países está incrementándose rápidamente al mismo tiempo que se produce un mayor desarrollo en los mismos (2). Este aumento de la prevalencia por ello parece tener que ver no tanto con causas genéticas como con causas de origen ambiental (3).

Sin embargo, la implicación de la genética en esta enfermedad es clara (Fig. 1). La EII es considerada una enfermedad poligénica, siendo familiar en un 5-10% de los individuos y esporádica en el resto (4). La concordancia en gemelos monocigóticos es del 50-75% en pacientes de EC y el riego de desarrollar esta enfermedad entre parientes de enfermos es 800 veces mayor comparado con la población general (4). Sin embargo, en CU la concordancia fenotípica en gemelos monocigóticos es menor (10-20%), lo cual sugiere que la heredabilidad es menos importante (4). Los estudios genéticos de genes candidatos, mapeo por desequilibrio de ligamiento y, particularmente los estudios de asociación de genoma completo (GWAS), han aumentado significativamente nuestro conocimiento acerca de la importancia de la susceptibilidad genética en la EII (5). Concretamente, veremos la gran importancia que los últimos estudios genéticos han dado a la implicación de la respuesta inmune en la etiopatogenia de la enfermedad, especialmente la respuesta Th17, así como también a los procesos de autofagia.

 

 

Factores genéticos

La EII engloba en realidad al menos dos patologías diferenciadas: EC y CU y una serie de formas intermedias, denominadas colitis indeterminadas, con características patológicas propias de ambas. Estas diferencias se ven reflejadas también en diferencias en la heredabilidad y en el incremento del riesgo de padecer alguna de ellas entre los parientes de enfermos, tal como ha sido mencionado previamente. Esto mismo es aplicable a los genes implicados históricamente en la susceptibilidad a una u otra forma de la enfermedad. De modo general, es sabido que en los pacientes de EII existen niveles alterados de citoquinas en relación a la población normal, por lo que se han buscado asociaciones entre polimorfismos en genes de citoquinas y una mayor susceptibilidad a padecer la enfermedad (6). Sin embargo, CU y EC muestran perfiles de citocinas muy diferenciados y las asociaciones genéticas encontradas en una no son aplicables en ocasiones a la otra. Entre las asociaciones más importantes, la de polimorfismos en el promotor de TNFα e IL-10 con la susceptibilidad a EII (7,8) son las más clásicas. Otras asociaciones importantes fueron las de polimorfismos de la IL-1 y su receptor (9) o más recientemente, el receptor de la IL-6 o de la IL-23 (10). También se han estudiado como genes candidatos los receptores de moléculas bacterianas, encontrándose asociaciones con varios receptores TLR (10) y, concretamente, en EC la asociación génica de este tipo más fuerte de las encontradas hasta ahora es la que se da con el gen del receptor intracelular de peptidoglicano, CARD15 (11). En condiciones normales, la interacción de CARD15 con antígenos bacterianos activaría la secreción de TNFα, y con ello la destrucción y aclaramiento de los microorganismos dañinos. Cuando CARD15 está mutado, este aclaramiento no se produce y la reacción inflamatoria frente al microorganismo se perpetúa (12). Estos polimorfismos se han asociado también con determinadas características clínicas como la localización ileal, la estenosis, el comienzo temprano o la necesidad de cirugía (13,11).

Los GWAS se consideran una de las principales herramientas para determinar la influencia genética en una enfermedad. Se han realizado numerosos estudios de este tipo, con más de 900 estudios primarios a gran escala desarrollados en los últimos 5 años. En cada uno de estos estudios se genotipan al menos 100.000 polimorfismos de una sola base (SNP) en cohortes de más de 1.000 sujetos en la mayor parte de las ocasiones. Por ello, los GWAS aportan una visión objetiva de la totalidad del genoma y una mayor probabilidad de detectar una asociación con un marcador Para cada una de estas asociaciones, se necesita una gran cantidad de trabajo para identificar el cambio genético que probablemente causa la asociación. Por ello, es importante llevar a cabo un análisis de mapeado fino antes de comenzar estudios funcionales intensivos.

En los últimos años, los GWAS han aportado mucha información sobre los factores genéticos asociados a la EII. Los metaanálisis de GWAS llevados a cabo hasta ahora han identificado alrededor de 163 loci genéticos de riesgo (14), incluyendo 23 específicos de CU, 30 específicos de EC y 110 compartidos por EC y CU, sugiriendo una contribución genética similar a la predisposición en ambas enfermedades, y vías patofisiológicas comunes. Muchos de los polimorfismos de nucleótido único (SNP) asociados corresponden a variaciones no codificantes, tal y como ha sido descrito previamente en otras enfermedades complejas (15). Aproximadamente un 40% de los SNP se encuentran en zonas reguladoras de la expresión de genes. Muchos (70%) de estos SNP asociados a EII se han relacionado también con otras enfermedades complejas, y se encuentran particularmente relacionados con la respuesta inmune. De especial relevancia, por su asociación con la enfermedad, son los genes relacionados con la regulación de la producción de citocinas, la activación de linfocitos y la respuesta a moléculas bacterianas, particularmente, la respuesta a micobacterias. Estos estudios ponen el foco de nuevo en vías previamente identificadas en estudios inmunológicos como, por ejemplo, la IL-23 y los linfocitos T helper (Th) 17 (16,17).

Es importante resaltar que el aporte genético no proviene tan sólo de nuestro genoma eucariota, sino que debemos tomar en consideración también nuestro microbiota, el conjunto de microorganismos que colonizan nuestro organismo. Como en otras patologías, cambios en la microbiota (disbiosis) se han asociado con el inicio de la enfermedad (18). Estos cambios se deben a diferentes factores: antibióticos, polución, algunas infecciones o el propio tratamiento de la enfermedad (18). La importancia del microbiota queda reflejada en el hecho de que por cada célula eucariota de nuestro organismo existen 10 células bacterianas en nuestro microbiota y por cada uno de nuestros genes portamos 150 genes bacterianos en nuestro microbioma, el genoma de nuestro microbiota. La microbiota se encarga de protegernos de los enteropatógenos, participa en la obtención de energía y nutrientes de la dieta y su interacción con la mucosa intestinal es clave para activar y regular la respuesta del sistema inmune. En el caso de la EII, la respuesta exagerada a determinados microorganismos o la colonización excesiva por parte de otros puede estar detrás del origen de la enfermedad (19). De hecho, la derivación del flujo excrementicio induce la remisión de la enfermedad mientras que la infusión del contenido fecal la reactiva. Lo mismo ocurre con el tratamiento con antibióticos en la CU, probando el importante papel de los microorganismos en la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, no todos los microorganismos tienen el mismo efecto, especies como Lactobacillus, Bifidobacterium y Faecalibacterium han mostrado un efecto protector sobre la inflamación de la mucosa (19). Por tanto, mientras algunos microorganismos causan una reacción inflamatoria, otros inhiben esta respuesta a través, por ejemplo, de la activación de la producción de IL-10 o de la actividad de las células T reguladoras (20). Por ello, es la predominancia de microorganismos proinflamatorios con respecto a los reguladores lo que parece tener que ver con el desarrollo de la EII. Al comparar el microbioma de pacientes de CU o de EC con el de individuos sanos no se ha encontrado ninguna especie directamente asociada con el desarrollo de la enfermedad (20), pero sí una disminución de la diversidad y una sobreexpresión de determinadas especies, como Ruminococcus o especies de la familia Enterobacteriaceae.

 

Respuesta Th17

El metaanálisis de los GWAS realizados hasta la fecha en EII apunta claramente hacia la respuesta Th17, la IL-23 y su receptor (IL23R), como uno de los mecanismos más claramente involucrados en la susceptibilidad a EII (14). El tracto gastrointestinal se caracteriza por el alto número de antígenos no dañinos presentes en él, provenientes de la dieta y de la flora intestinal. Por ello, es un lugar donde el sistema inmune debe generar un alto grado de tolerancia, manteniendo al mismo tiempo una adecuada respuesta a los patógenos. Por ello, un desequilibrio en este sistema tan inestable podría causar una respuesta inflamatoria desproporcionada frente a antígenos no dañinos o, por el contrario, una ausencia de respuesta a un patógeno, lo que podría ser la base etiopatogénica de la EII.

La presentación de antígenos a células naïve precursoras de células T en la periferia conduce a la generación de células T efectoras o células T reguladoras. Este proceso se encuentra fuertemente influenciado por las señales procedentes del ambiente que se encuentren presentes en el momento de la activación. La predominancia de unas u otras señales conduce a su diferenciación hacia determinados linajes efectores, mientras impiden la adquisición de otros fenotipos y remodela la expresión génica de forma dramática. El resultado de esta cascada es una célula T totalmente especializada funcionalmente. Las primeras subpoblaciones de células T helper descritas fueron la Th1 (respuesta celular, proinflamatoria) y la Th2 (respuesta humoral, producción de anticuerpos). Sin embargo, desde el descubrimiento de las células reguladoras, los investigadores han asumido que las respuestas inmunes son mucho más complejas (Fig. 2). Estas células participan en el mantenimiento de la auto-tolerancia eliminando los linfocitos autorreactivos mediante mecanismos de contacto célula-célula y la producción de citocinas, como el "transforming growth factor" (TGF)-beta o la IL-10 (21). Defectos en su número o función se han asociado con diferentes enfermedades autoimmunes.

 

 

Más recientemente se ha descrito una nueva población de células T: las Th17. Estas células son de tipo efector y promueven la respuesta inflamatoria, la patología autoinmune y el rechazo a trasplantes. Las proporciones de células Th17 y células reguladoras están claramente asociadas de forma inversa, ya que aumentos de las células Th17 generalmente implican descensos de las células reguladoras. Estas células se caracterizan fenotípicamente por la expresión del receptor nuclear RORγt, IL-17, IL-22 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). La diferenciación hacia Th17 requiere en su inicio señalización por IL-6 junto a expresión de TGF-β. La concentración de TGFbeta es crucial en la regulación del desarrollo de células Treg versus Th17. A continuación, se produce una subdiferenciación de estas células en la que es crucial IL-23. Las vías de señalización iniciadas por IL-6, IL-21, e IL-23 activan todas a STAT3, haciéndolo indispensable para la diferenciación hacia células Th17 (22).

De hecho, la mutación de STAT3 origina la ausencia de estas células (23). La activación de STAT3 regula la expresión de RORγt, IL-17 e IL-23R. Sin embargo, estas células Th17 IL23R+RORγt+ no son claramente proinflamatorias, es necesaria una exposición a IL23 para que se disparen sus funciones inflamatorias como se ha comprobado en el modelo murino de encefalitis experimental autoinmune (EAE) (24). El efecto de TGFβ es el contrario, ya que aunque participa en la diferenciación de Th17, inhibe la expresión de IL23R (25). De este modo se ha descrito una población Th17(β), no implicada en autoinmunidad, y una población Th17(23) sí implicada (26). Mientras que las Th17(β) se caracterizan por la producción de IL-17A, IL-17F e IL-10, citocina inmunomoduladora, las Th17(23) producen IL-17A, IL-17F, IL-22 e IFNγ.

Las células Th17 ejercen sus efectos a través de la secreción de IL-17. La IL-17 muestra actividades pleiotrópicas, incluyendo la inducción de la expresión de citocinas proinflamatorias y quimiocinas, las cuales causan la infiltración del tejido y su destrucción. En realidad, la IL-17 es una familia de citocinas que juega un importante papel tanto en la respuesta inmune innata como en la adaptativa, y que incluye seis miembros (IL-17A-F), y cinco receptores (IL-17RA-RE). Existe otra población de células Th17, denominadas células Th17 naturales, que emergen como tales directamente del timo, en lugar de diferenciarse en la periferia como las demás efectoras. Estas células, como las restantes células naturales, expresan TCR con alta afinidad por HLA unido a péptidos propios, por lo tanto han escapado a los mecanismos de selección negativa. Son células efectoras con un fenotipo de células activadas y de memoria aun no habiendo tenido contacto con su antígeno (24).

El papel fisiológico de las células Th17 es combatir las bacterias extracelulares y los hongos a través de la secreción de IL-17A, IL-17 F e IL-22. Sin embargo, las respuestas Th17 desreguladas, caracterizadas por la sobreproducción de IL-17A e IL-17F, se reconocen de gran importancia como factor causal o como un factor adicional en enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple y la EII (27). Su papel en la etiopatogenia parece claro al tratarse de una citocina proinflamatoria que induce la secreción de otras citocinas proinflamatorias y de quimiocinas como CCL20 y metaloproteinasas (MMP). Por ello, no resulta sorprendente la asociación de polimorfismos en genes implicados en esta vía con la susceptibilidad a EII. Concretamente, se ha descrito en modelos murinos de colitis que la IL-17A cumple un papel protector, ya que entre sus funciones se encuentra la de inhibir la respuesta Th1, pero la IL-23 aumenta la severidad de la colitis murina a través de la generación de células Th17 productoras de IFNγ, Th17(23) (28,29). Esto probaría de nuevo la dicotomía entre células Th17(β) y Th17(23). Otras respuestas que podrían estar implicadas son la Th9 y la Th22, ambas recientemente descritas (30), y de las que todavía no existen datos de asociación.

 

Autofagia

Otro gran grupo de genes que los GWAS han desvelado como importantes en la EII es el involucrado en la regulación de la autofagia (31). Este proceso consiste principalmente en la degradación por los lisosomas de orgánulos dañados o proteínas mal plegadas y se activa en respuesta a la privación de nutrientes, cuando es necesario un remodelado estructural o cuando existen desechos en el citoplasma consecuencia de una infección o de un proceso de estrés (32). La autofagia consta de tres tipos: microautofagia, que consiste en la endocitosis de materiales citosólicos por el lisosoma; mediada por chaperonas, que destruye proteínas anómalas recuperando los aminoácidos de los que están compuestas, y macroautofagia, caracterizada por el desarrollo de autofagosomas, grandes vesículas de doble membrana que engloban el material a destruir (Fig. 3). Es un proceso que se encuentra relacionado con la inflamación y que se activa en respuesta a distintos tipos de estrés (33). El proceso se encuentra regulado por los niveles de mTORC1. Su desactivación en respuesta a la inanición u otras formas de estrés origina la activación del proceso de autofagia. En primer lugar se forma el fagóforo, una membrana que será el precursor del autofagosoma. Es crucial el reclutamiento de PI(3)P a la membrana. Intervienen entonces las proteínas Atg madurando el autofagosoma, que finalmente se fusiona con endosomas y lisosomas que destruyen el material que está en su interior.

 

 

Los estudios GWAS han asociado la susceptibilidad a EC principalmente con 3 genes implicados en la autofagia: ATG16L1, IRGM, y PTPN2 (34). ATG16L1 (autophagy-related protein 16-1) participa en la elongación de la membrana del autofagosoma (35). Se ha comprobado que los fibroblastos deficientes en ATG16L1 no presentan formación de autofagosomas en respuesta a la inanición. Las mutaciones en este gen se han asociado también con anormalidades en las células de Paneth, similares a las observadas en pacientes de EC. Además, pacientes de EC con ATG16L1 mutado muestran gran cantidad de autofagosomas en el citoplasma de sus células de Paneth, debido probablemente a un defecto en su fusión con los lisosomas, lo que le impide ser destruidos (35). Esta presencia de mutaciones en ATG16L1 origina también una activación del inflamosoma, una estructura formada por varias proteínas e implicada en el proceso de muerte celular programada por piroptosis (32). Por su parte, IRGM (immunity-related GTPase family M protein) dirige la autofagia de los patógenos intracelulares, tanto virus como bacterias. Se encuentra implicado además en la presentación antigénica de los péptidos resultantes de la degradación de estos microorganismos tanto a través de HLA de clase I como de clase II participando por tanto en el origen la respuesta inmune adaptativa (36). Las mutaciones en este gen podrían conllevar por ello una peor eliminación de patógenos en la mucosa intestinal en EII. Particularmente, se ha destacado el papel de E. coli adherente-invasiva debido a que se encuentra aumentada en el intestino de pacientes de EC y su eliminación depende de la autofagia mediada por IRGM (37). Además, miR-196, microRNA que se une al alelo normal de irgm, se encuentra aumentado en pacientes de EC. El papel de este microRNA no está claro en este proceso pero parece relacionarse con el control de la expresión de IRGM y con ello del proceso de autofagia (36). PTPN2 (protein tyrosine phosphate non-receptor type 2) es un importante inhibidor de la respuesta a citocinas proinflamatorias como IFN-γ o IL-6, debido a su capacidad de defosforilar STAT1 y STAT3. Ratones knock-out para el gen ptpn2 desarrollan una inflamación sistémica y niveles elevados del mensajero de esta proteína se han encontrado en la mucosa inflamada de pacientes de EC (38). Se ha comprobado que cumple también un importante papel en el control de la autofagia ya que el silenciamiento de este gen causa anomalías en la formación de los autofagosomas y una autofagia disfuncional (39) y la inactivación de este gen con siRNA en la línea celular T84 incrementa la fosforilación de mTOR y la expresión de beclina 1 pero al mismo tiempo inhibe la activación de Atg5 y Atg7 por parte de IFN-γ y TNF-α (31). Concretamente en CD, en cultivos de fibroblastos de la lámina propia de pacientes se observó que la estimulación de estos con IFN-γ y TNF-α incrementaba la formación de autofagosomas en pacientes wild-type pero no en los que presentaban la mutación en PTPN2 que se ha asociado con mayor susceptibilidad a EC (39). Es, por lo tanto, una proteína implicada en la conexión entre la respuesta inflamatoria y la autofagia y que podría estar también implicada en el mantenimiento de la integridad del epitelio (31).

Existe además una clara asociación entre el receptor NOD2 y el proceso de autofagia ya que este receptor, en condiciones normales, es capaz de activar la formación de vacuolas autofágicas en células dendríticas y epiteliales. Las variantes mutadas de NOD2 asociadas con EC no pueden desencadenar esta respuesta (40).

Estrechamente relacionada con el proceso de autofagia se encuentra la respuesta a proteínas mal plegadas inducida por el estrés del retículo endoplasmático. En este proceso se encuentra implicado el gen XBP1, asociado también con un incremento de la susceptibilidad a EII (41). La inactivación de esta proteína en células del epitelio intestinal causa estrés en el retículo endoplasmático, disfunción de las células de Paneth y enteritis (41) y defectos en este gen junto a defectos en Atg16 originan una ileítis transmural severa similar a la EC en modelos animales (42).

 

Conclusión

Los estudios GWAS realizados en EII han mostrado como particularmente relevantes genes participantes en la respuesta inmune, especialmente la respuesta Th17, y los procesos de autofagia. Esto confirma estudios previos que ya relacionaban estas dos vías con la etiopatogenia de esta enfermedad y abre el camino a un mayor conocimiento de esta patología, una mejor clasificación y nuevas expectativas de futuros tratamientos.

 

 

Dirección para correspondencia:
Patricia Castro-Santos.
Facultad de Ciencias de la Salud.
Universidad Autónoma de Chile.
5 Poniente n.^o 1670 Talca, Chile.
e-mail: pcastros@uautonoma.cl

Recibido: 09-01-2015
Aceptado: 24-02-2015

 

 

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