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Revista Española de Enfermedades Digestivas

versión impresa ISSN 1130-0108

Rev. esp. enferm. dig. vol.107 no.11 Madrid nov. 2015

 

TRABAJOS ORIGINALES

 

La neomicina y bacitracina disminuyen la permeabilidad intestinal en ratones e incrementan la expresión de algunas proteínas de unión estrecha

Neomycin and bacitracin reduce the intestinal permeability in mice and increase the expression of some tight-junction proteins

 

 

Rebeca Nevado1, Raquel Forcén1, Elena Layunta1, María Divina Murillo1,2 y Laura Grasa1,2,3

1 Departamento de Farmacología y Fisiología. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza.
2 Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón (IIS).
3 Instituto Agroalimentario de Aragón (IA2) (Universidad de Zaragoza-CITA). Zaragoza

Trabajo financiado por el Gobierno de Aragón (B61/2014) y la Universidad de Zaragoza (JIUZ-2013-BIO-08), España.

Dirección para correspondencia

 

 


RESUMEN

Antecedentes: las proteínas de unión estrecha (UE) regulan la permeabilidad paracelular. La permeabilidad intestinal puede estar modulada por la microbiota comensal. Las manipulaciones de la microbiota intestinal con antibióticos como la bacitracina y neomicina han resultado ser útiles para el tratamiento de la diarrea inducida por Clostridium difficile o los fármacos quimioterápicos.
Objetivos: evaluar los efectos de la depleción de la microbiota mediante la administración oral de bacitracina y neomicina sobre la permeabilidad intestinal y la expresión de las proteínas de UE en ratón.
Métodos: los ratones recibieron por vía oral la combinación de neomicina y bacitracina durante 7 días. La permeabilidad intestinal se cuantificó con el método del dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano). La expresión de las proteínas de UE en el intestino se determinó mediante PCR a tiempo real.
Resultados: los niveles de FITC-dextrano en suero se redujeron a la mitad en los ratones tratados con antibióticos, indicando una reducción de la permeabilidad intestinal. Los antibióticos incrementaron la expresión de zónula occludens 1 (ZO-1), molécula de adhesión de unión A (JAM-A) y ocludina en íleon y de ZO-1, claudina-3 y claudina-4 en colon.
Conclusiones: la combinación de neomicina y bacitracina reduce la permeabilidad intestinal e incrementa la expresión de ZO-1, JAM-A y ocludina en íleon y ZO-1, claudina-3 y claudina-4 en colon.

Palabras clave: Antibióticos. Microbiota. Proteínas de unión estrecha. Permeabilidad intestinal.


ABSTRACT

Background: Tight-junction (TJ) proteins regulate paracellular permeability. Gut permeability can be modulated by commensal microbiota. Manipulation of the gut microbiota with antibiotics like bacitracin and neomycin turned out to be useful for the treatment of diarrhoea induced by Clostridium difficile or chemotherapy drugs.
Aim: To evaluate the effects of the microbiota depletion evoked by the oral administration of neomycin and bacitracin on the intestinal permeability and expression of TJ proteins in mice.
Methods: Mice received neomycin and bacitracin orally for 7 days. Intestinal permeability was measured by the fluorescein-isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) method. The gene expression of TJ proteins in the intestine was determined by real time-PCR.
Results: FITC-dextran levels in serum were reduced by half in antibiotic-treated mice, indicating a reduction of intestinal permeability. Antibiotics increased the expression of zonula occludens 1 (ZO-1), junctional adhesion molecule A (JAM-A, and occludin in the ileum and ZO-1, claudin-3, and claudin-4 in the colon.
Conclusion: The combination of neomycin and bacitracin reduce intestinal permeability and increase the gene expression of ZO-1, junctional adhesion molecule A (JAM-A), and occludin in the ileum and ZO-1, claudin-3, and claudin-4 in the colon.

Key words: Antibiotics. Microbiota. Tight-junction proteins. Intestinal permeability.


 

Introducción

El epitelio intestinal constituye una barrera permeable y selectiva, gracias a la presencia de estructuras intercelulares de unión estrecha (UE), que regulan la permeabilidad paracelular. Las proteínas de UE son proteínas transmembrana y proteínas adaptadoras intracelulares. Se han identificado cuatro proteínas transmembrana: ocludina, claudinas (24 miembros), molécula de adhesión de unión (JAM) y tricelulina. Estas proteínas transmembrana interaccionan con las proteínas adaptadoras citosólicas, como la zonula occludens (ZO) (1).

Las células epiteliales del intestino están en continua interacción con una extensa microbiota intestinal, la cual puede modular la permeabilidad intestinal directamente, mediante la liberación de toxinas, componentes celulares o metabolitos, o indirectamente, a través de sus efectos sobre las células inmunológicas del hospedador (2).

La ingesta de antibióticos para el tratamiento de diversas patologías de origen bacteriano produce obviamente una alteración de la microbiota intestinal. Esta alteración de la microbiota intestinal puede tener efectos beneficiosos y contribuir al restablecimiento de la homeostasis intestinal. Así, la bacitracina oral se ha utilizado para el tratamiento de las diarreas asociadas a Clostridium difficile y colitis (3,4). La neomicina oral está indicada para la supresión de la flora bacteriana en pacientes que van a someterse a una cirugía colorrectal (5,6) o padecen una encefalopatía hepática (7). Además, la combinación de neomicina y bacitracina previene la diarrea inducida por las drogas quimioterápicas utilizadas contra el cáncer colorrectal (8). Sin embargo, el uso prolongado de antibióticos también se ha descrito como un factor que, al alterar la microbiota intestinal, puede contribuir al desarrollo y/o mantenimiento de patologías intestinales crónicas como la enfermedad inflamatoria intestinal o el síndrome de intestino irritable, patologías en las que la permeabilidad intestinal se encuentra alterada (9).

El objetivo del presente estudio es evaluar los efectos de la depleción de la microbiota intestinal producida por la administración oral de neomicina y bacitracina sobre la permeabilidad intestinal de ratones y la expresión de las proteínas de UE.

 

Metodología

Animales y tratamiento con antibióticos

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza (PI36/12).

Ratones hembras C57BL/10 (5 a 7 semanas de edad) recibieron por sonda oral (0,2 mL) una combinación de antibióticos no absorbibles (neomicina 20 mg y bacitracina 20 mg por ratón, AppliChem, Barcelona, España) durante 7 días. La bacitracina y la neomicina se disolvieron en agua destilada estéril y el pH de la disolución se ajustó a 4,0 para evitar la inactivación de la bacitracina. Para evitar la contaminación por hongos, se añadió el antifúngico pimaricina (5 µg por ratón) a la solución de antibióticos. Los ratones control recibieron agua destilada estéril (0,2 mL). Previamente,nuestro grupo ha demostrado que la administración oral de estos antibióticos produce en ratones una gran depleción de su microbiota intestinal (10).

Se utilizaron 2 grupos de 8 ratones (control y tratados) para evaluar la permeabilidad intestinal in vivo y 2 grupos de 8 ratones (control y tratados) para estudiar la expresión de las UE.

Permeabilidad intestinal in vivo

Tras un ayuno de 14 horas, se suministró a cada ratón por sonda oral 60 mg de dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano, FD4, 3.000-5.000 kD, Sigma-Aldrich, Madrid, España) por cada 100 g de peso corporal, en un volumen de 0,2 mL. Se obtuvieron muestras de sangre por punción cardiaca a las 4 h de la administración del FITC-dextrano, ya que se ha descrito que los niveles de dextrano en suero son máximos en este punto (11). La sangre se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente para extraer el suero. Se midió la intensidad de la fluorescencia de cada muestra de suero (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter, CA, Estados Unidos) y las concentraciones de FITC-dextrano se determinaron a partir de curvas estándar generadas a partir de diluciones seriadas de FITC-dextrano. Los resultados se expresaron como ng FITC-dextrano mL-1 suero por 100 g de peso corporal (pc).

Estudio de la expresión del ARNm de las UE

La expresión de ARNm de ZO-1, JAM-A, ocludina, y claudinas-3, -4 y -7 se determinó mediante PCR a tiempo real. Se tomaron muestras de íleon (6 cm últimos de intestino delgado) y de colon proximal de ratones control y tratados con antibióticos y se mantuvieron en solución RNAlater (Ambion, Life Technologies, Madrid, Spain) a 4 oC durante toda la noche. Posteriormente, las muestras se mantuvieron a -80 oC hasta la extracción del ARN mediante el RNeasy mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN complementario (ADNc) se sintetizó por transcripción reversa utilizando el AffinityScript Multiple Temperature cDNA synthesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos) y se utilizó para determinar los niveles de expresión de ARNm de las UEs. Las amplificaciones se realizaron con el sistema StepOnePlus Real-Time PCR (Life Technologies, Carlsband, CA, Estados Unidos). La mezcla de la reacción (10 μL) contenía 4,5 μL de FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, Mannheim, Alemania), 0,5 μL de cada cebador 30 μM (Tabla I), 2,5 μL de agua destilada estéril y 2 μL de ADNc (100 ng μL-1). Cada muestra se evaluó por triplicado y se calculó la media de los Ct obtenidos. La expresión relativa de ARNm de las UE de cada condición experimental (control o tratados) se expresó como ΔCt=Ct UE-Ct calibrador. La expresión del gen GAPDH se utilizó como calibrador tras verificar su estabilidad bajo nuestras condiciones experimentales. Luego, la expresión relativa de ARNm de las UE se calculó como ΔΔCt=ΔCt tratados-ΔCt control. Finalmente, los niveles de expresión relativa de los genes se convirtieron y se expresaron como cambio relativo al control (=2-ΔΔCt).

 

 

Análisis de datos y estadística

Los resultados se expresaron como la media ± E.E.M. con n indicando el número de animales utilizados. Los datos se compararon con el test de Mann-Whitney U y diferencias con valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

 

Resultados

Efecto de la neomicina y bacitracina sobre la permeabilidad intestinal

Como se observa en la figura 1, los ratones tratados con agua mostraron unos niveles de FITC-dextrano en suero de 2009 ± 473,5 ng mL-1 de suero por 100 g de peso corporal. Los ratones tratados con antibióticos mostraron unos niveles de FITC-dextrano reducidos a la mitad aproximadamente (973,4 ± 172,8 ng mL-1 de suero por 100 g de peso corporal) respecto a los controles.

 

 

Efecto de la neomicina y bacitracina sobre la expresión de ARNm de las UE

La figura 2 muestra los niveles de expresión de ARNm de ZO-1, JAM-A, ocludina y claudinas 3, 4 y 7 en íleon (Fig. 2A) y colon (Fig. 2B) de los ratones tratados con los antibióticos respecto a los controles. El tratamiento con antibióticos incrementó significativamente la expresión de ZO-1, JAM-A y ocludina en íleon y de ZO-1, claudina-3 y claudina-4 en colon.

 

 

Discusión

Resultados previos de nuestro grupo han demostrado que la administración oral de neomicina y bacitracina en ratones produce una gran depleción de su microbiota intestinal, una ligera inflamación intestinal, así como una reducción de las deposiciones fecales, un enlentecimiento del tránsito intestinal y una reducción de la contractilidad en el íleon y colon in vitro (10). En el presente trabajo evaluamos en estos mismos ratones tratados con antibióticos la permeabilidad del intestino delgado y colon al FITC- dextrano tras 4 horas de su administración. Otros autores han demostrado que el dextrano marcado con FITC puede llegar al colon a las 3 h (12) y alcanzar concentraciones máximas en el suero a las 4 h de su administración por vía oral (11). Nuestros resultados revelan que los ratones tratados con neomicina y bacitracina muestran en estas condiciones una permeabilidad intestinal reducida al FITC-dextrano. Sin embargo, otros autores han demostrado que la bacitracina incrementa la absorción paracelular del FITC-dextrano (4.000 kD) en células epiteliales de carcinoma de colon humano (Caco-2) (13). Por otra parte, la neomicina incrementa la absorción de azúcares, a la vez que tiene efectos directos sobre la morfología del epitelio intestinal en rata. Sin embargo, la neomicina no produce estos efectos en hámster, indicando que existen diferencias específicas entre las especies en cuanto a la susceptibilidad del epitelio a la neomicina (14).El hecho de que el tránsito intestinal esté enlentecido en los ratones tratados con neomicina y bacitracina podría explicar una menor llegada de FITC-dextrano a las células epiteliales intestinales del íleon y colon, y por lo tanto, un menor paso paracelular de este.

Por otra parte, existen varios ejemplos en los que el tratamiento con antibióticos ha resultado ser eficaz en elrestablecimiento de la permeabilidad intestinal normal. Así, la ciprofloxacina y el metronidazol mejoran la función de barrera de la mucosa dañada en ratones con fibrosis quística (15). La rifaximina oral previene el daño de la función de barrera intestinal producido por estrés de evitación al agua en ratas (16).

Entre los mecanismos que pueden modificar la permeabilidad intestinal se encuentran las alteraciones en la expresión, localización y función de las proteínas de unión estrecha (2). En nuestro estudio, evaluamos el efecto directo de la combinación de neomicina y bacitracina sobre la expresión génica de algunas de las proteínas que forman parte de las UE. Todos los segmentos de intestino delgado e intestino grueso de ratón muestran altos niveles de expresión de ZO-1, JAM-A, ocludina y claudinas -3, -4 y -7 (17). En nuestro estudio, la depleción de la microbiota mediante la administración de los antibióticos neomicina y bacitracina indujo un incremento en la expresión génica de ZO-1, JAM-A y ocludina en íleon y de ZO-1, claudina-3 y claudina-4 en colon. Estos resultados indican que la microbiota intestinal podría modular la transcripción de estas proteínas y, a su vez, regular la permeabilidad intestinal. Sin embargo, hay que tener en cuenta que cambios en la expresión génica no siempre implican un cambio en los niveles de proteína funcional y, por lo tanto, un cambio en la funcionalidad de las uniones estrechas.

Nuestro estudio demuestra que la microbiotapodría regular la expresión génica de las proteínas de unión estrecha de diferente manera en íleon y colon. Así, el incremento de expresión de las proteínas ZO-1, JAM-A y ocludina podría contribuir a la permeabilidad reducida al FITC-dextrano observada en el íleon. Se ha descrito que las proteínas ZO podrían tener un papel importante en la regulación del ensamblaje de las uniones estrechas (1). Estudios in vivo e in vitro han demostrado que JAM-A participa en la regulación y mantenimiento de la barrera formada por las uniones estrechas (1). Ratones con carencia del gen JAM-A muestran una mayor permeabilidad al dextrano en el colon comparado con los ratones normales (18). Estudios en células Caco-2 e intestino de ratón han demostrado que la disminución en la expresión de ocludina induce un incremento en la permeabilidad paracelular a las macromoléculas (19).

Por el contrario, el incremento de expresión de las proteínas ZO-1, claudina-3 y claudina-4 podría contribuir a la permeabilidad reducida al FITC-dextrano observada en el colon. Así, la claudina-3 y la claudina-4 están implicadas en la formación de barrera y disminuyen la permeabilidad paracelular (1). Sin embargo, la claudina-7, cuyo nivel de expresión génica no se altera ni en íleon ni en colon, está implicada en la formación de poros e incrementa la permeabilidad paracelular (1), lo que apoya nuestros resultados.

Por último, se ha demostrado que otros antibióticos pueden modificar la expresión de estas proteínas de UE. La oligomicina evita la redistribución de la ZO-1 y ocludina observadas en la disfunción de la barrera intestinal inducida por IFN-γ y TNF-α (20). La minociclina ejerce un efecto antiinflamatorio y atenúa la reactivación de la colitis incrementando la expresión de ZO-1 (21).

En conclusión, la depleción de la microbiota con neomicina y bacitracina reduce la permeabilidad intestinal e incrementa la expresión de ZO-1, JAM-A y ocludina en íleon y ZO-1, claudina-3 y claudina-4 en colon.

 

 

Dirección para correspondencia:
Laura Grasa.
Departamento de Farmacología y Fisiología.
Facultad de Veterinaria.
Universidad de Zaragoza.
Miguel Servet, 177.
50013 Zaragoza
e-mail: lgralo@unizar.es

Recibido: 27-05-2015
Aceptado: 25-07-2015

 

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