ORIGINALES

 

Influencia de los polimorfismos genéticos en UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9 sobre la farmacocinética de irinotecán, SN-38 y SN-38G

Influence of genetic polymorphisms in UGT1A1, UGT1A7 and UGT1A9 on the pharmacokynetics of irinotecan, SN-38 and SN-38G

 

 

B. Valenzuela Jiménez¹, M. González Sales², V. Escudero Ortiz¹, E. Martínez Navarro¹, C. Pérez Ruixo², J. Rebollo Liceaga¹, R. González Manzano¹ y J. J. Pérez Ruixo³

¹Plataforma de Oncología, Hospital Quirón, Torrevieja, Alicante.
²Consulting Projects for Research, SL. Puzol, Valencia.
³Translational Sciences, AMGEN, Inc, EE.UU.

Parte de los resultados de este trabajo fueron presentados en las IV Jornadas de Modelización y Simulación en Biomedicina, celebradas en Alicante del 23 al 25 de Noviembre de 2011.

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

Objetivo: Evaluar la influencia de los polimorfismos genéticos en UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9 sobre la farmacocinética poblacional de irinotecán y sus metabolitos, SN-38 y SN-38G.
Metodología: Las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G determinadas en 72 pacientes se utilizaron para desarrollar un modelo farmacocinético poblacional en el programa NONMEM VII. Se empleó el método M3 para incluir en el análisis las concentraciones por debajo del límite de cuantificación de la técnica analítica. Se evaluó el efecto de la edad, sexo, superficie corporal, bilirrubina total, medicación concomitante, tipo de tumor y polimorfismos genéticos en UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9 sobre los parámetros farmacocineticos del modelo. La validación interna del modelo farmacocinético se realizó mediante normalized visual predictive check (NVPC) y normalized predictive distribution error (NPDE).
Resultados: El valor medio (variabilidad interpaciente, %) del aclaramiento de irinotecán, SN-38 y SN-38G ha sido 42,9 (56,4%), 1340 (76,8%) y 188 L/h (70,1%), respectivamente. La presencia de alelos con baja actividad enzimática (UGT1A1*28, UGT1A7*3 y UGT1A9*22) redujo el aclaramiento de SN-38 entre un 20 y un 36%. La validación interna ha confirmado que el modelo farmacocinético poblacional resulta adecuado para describir la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G y su variabilidad en pacientes oncológicos.
Conclusión: La inclusión de información farmacocinética-farmacogenética puede añadir valor a la personalización de la dosificación de irinotecán por cuanto que permitirá manejar cuantitativamente las reducciones de dosis en pacientes con toxicidad iatrogénica debido a los polimorfismos genéticos en UGT1A1.

Palabras clave: Irinotecán; Farmacocinética; Genotipo; Isoforma; Polimorfismo; NONMEM; Oncología.

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ABSTRACT

Objective: To evaluate the Influence of genetic polymorphism in UGT1A1, UGT1A7 and UGT1A9 on the population pharmacokinetics of irinotecan and its metabolites, SN-38 and SN-38G.
Methods: Plasma concentrations of irinotecan, SN-38 and SN-38G from 72 patients were pooled to develop a population pharmacokinetic model using NONMEM VII. M3 method was used to account for plasma concentrations below the limit quantification. The effect of age, sex, body surface area, total bilirubin, comedication, tumor type, and UGT1A1, UGT1A7 and UGT1A9 genotypes on the model parameters was evaluated. The model was internally validated using normalized visual predictive check (NVPC) and normalized predictive distribution errors (NPDE).
Results: The typical values (between-subject variability; %) of the irinotecan, SN-38 and SN-38G clearances were 42,9 L/h (56,4%), 1340 L/h (76,8%) and 188 L/h (70,1%), respectively. The presence of UGT1A1*28, UGT1A7*3, UGT1A9*22 genotypes decreases SN-38 clearance between 20 and 36%. Internal validation confirms the population pharmacokinetic model describe the time course of irinotecan, SN-38 and SN-38G plasma concentration and their associated variability in cancer patients.
Conclusion: The inclusion of pharmacokinetic-pharmacogenomic information can add value to the individualized dose adjustment of irinotecan, because it will let quantitatively handle dose reductions in patients with iatrogenic toxicity due to UGTIAVs genetic polymorphisms.

Key words: Irinotecan; Pharmacokinetics; Genotype; Isoform; Polymorphism; NONMEM; Oncology.

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Introducción

Irinotecán es un agente antineoplásico que inhibe la ADN topoisomerasa I, enzima que estabiliza la estructura topográfica del ADN durante su replicación y transcripción¹. La inhibición de la topoisomerasa I produce fragmentos de hebras simples de ADN que conducen a la detención de la división celular y a la muerte de las células en proceso de división. El mecanismo de acción de irinotecán le confiere actividad farmacológica en diversos tipos de tumores sólidos como el cáncer de pulmón, ovario, estómago, páncreas o gliomas^2,3 y está indicado como tratamiento de primera línea en carcinoma colorrectal metastático⁴ en combinación con 5-fluorouracilo (5-Fu) y ácido folínico cada dos semanas, con o sin bevacizumab⁵, cetuximab⁶ o panitumumab⁷; y también en segunda línea después del tratamiento con 5-Fu u oxaliplatino, tanto en monoterapia como en combinación. Se administra en perfusión intravenosa de entre 60 y 90 minutos de duración y la dosis inicial recomendada en monoterapia es de 125 mg/m² en administración semanal o 350 mg/m² cada tres semanas⁸.

A las dosis habitualmente utilizadas en la práctica clínica, irinotecán presenta una farmacocinética lineal. Tras su administración intravenosa, el volumen de distribución en estado estacionario (V_ss), 263 L, refleja su amplia distribución a fluidos y tejidos biológicos⁹. Su unión a proteínas plasmáticas, principalmente a la albúmina, es moderada (30-68%)¹⁰. La evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de irinotecán presenta un perfil multiexponencial, con un aclaramiento plasmático de 32 L/h y una semivida de eliminación en fase terminal entre 11 y 13 horas^9,11,12. Las principales vías de eliminación de irinotecán son el metabolismo hepático y la excreción biliar y urinaria. Las carboxilesterasas presentes en los hepatocitos originan el SN-38^13,14, metabolito entre 100 y 1000 veces más activo que irinotecán y principal responsable de su toxicidad hematológica e intestinal^9,15. La fracción de irinotecán transformada a SN-38 oscila entre 12 y 15%¹⁶. El metabolismo oxidativo, mediante las enzimas del citocromo P450 3A4, provoca la apertura del anillo piperidínico del irinotecán y la formación de dos metabolitos de escasa o nula actividad citotóxica, uno de ellos es un derivado del ácido aminopentanoico (APC) y el otro es un derivado de su amina primaria (NPC)³. Aproximadamente entre el 3 y 22% del irinotecán administrado se excreta por bilis y sufre ciclo enterohepático. El porcentaje de irinotecán inalterado excretado en orina oscila entre el 10 y 20%¹⁷.

Al igual que irinotecán, SN-38 presenta una farmacocinética lineal. Las concentraciones plasmáticas máximas de SN-38 se observan aproximadamente una hora después del final de la perfusión intravenosa de irinotecán y disminuyen en función del tiempo de forma biexponencial. El V_ss aparente de SN-38 es 72000 L y alrededor del 95% se une a proteínas plasmáticas, fundamentalmente, albúmina. Sufre metabolismo hepático por glucuronidación, mediada por UDP-glucurosiltransferasas (UGT), que origina el metabolito inactivo SN-38G¹⁵. El SN-38G se acumula en bilis y se libera al lumen intestinal donde, reconvertido a SN-38 por la acción de las beta-glucuronidasas, puede ser reabsorbido. El aclaramiento plasmático aparente de SN-38 y SN-38G es 712 y 67 L/h, respectivamente, y condiciona concentraciones plasmáticas de SN-38G más elevadas que las concentraciones plasmáticas de SN-38⁹. La isoforma UGT1A1 es la principal enzima encargada de la formación de SN-38G aunque otras isoformas, como 1A7 y 1A9, también son capaces de glucuronizar el SN-38¹⁸. Las isoformas funcionales del enzima UGT1A están codificadas por el gen UGT1A, localizado en el cromosoma 2q37. En los pacientes homocigóticos en UGT1A1*28/*28¹³ hay una menor glucuronidación del SN-38 que condiciona una mayor exposición y un mayor riesgo de toxicidad hematológica y/o intestinal, especialmente tras la administración de dosis de irinotecán superiores a 150 mg/m^{2 19-21}. Además, pacientes caucasianos con el polimorfismo genético UGT1A7*3/*3 presentan una glucuronidación del SN-38 comparable a la obtenida en pacientes homocigóticos en UGT1A1*28/*28²². Asimismo, la glucuronidación del SN-38 en pacientes coreanos con UGT1A9-118(dT)_g/g es menor que en pacientes con el polimorfismo genético UGT1A9-118(dT)_10/10 y se asocia a una mayor incidencia de toxicidad¹³. Hasta el momento, en población caucásica no se ha determinado la implicación de polimorfismos genéticos de UGT1A9 en la farmacocinética y farmacodinamia de irinotecán.

La farmacocinética de irinotecán se ha caracterizado con modelos bi-¹⁶, o tri-^9,11,15,17 compartimentales, mientras que la farmacocinética de SN-38 ha sido descrita mediante modelos de uno,^11,15,16 o dos^9,11,15,16compartimentos. Para SN-38G, la literatura recoge su modelización a través del modelo bicompartimental⁹. La mayoría los modelos farmacocinéticos poblacionales publicados de irinotecán, SN-38 y SN-38G describen la evolución temporal de los tres compuestos de forma secuencial. Tan solo Poujol et al.¹² realizaron el análisis simultáneo de irinotecán y SN-38, pero no incluyeron los datos de SN-38G. Hasta el momento, ningún modelo farmacocinético poblacional de la literatura ha cuantificado el efecto de los polimorfismos genéticos en UGT1A1, UGT1A7y UGT1A9 sobre el aclaramiento aparente de SN-38 a través del análisis conjunto de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G de pacientes caucasianos. Por tanto, el objetivo del presente estudio es evaluar la influencia de los polimorfismos genéticos UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9 en la farmacocinética de irinotecán, SN-38 y SN-38G de pacientes caucasianos con tumores sólidos de distinta etiología.

 

Materiales y métodos

Criterios de selección y características de los pacientes. Se incluyeron en el estudio pacientes oncológicos, adultos, de origen caucasiano, subsidiarios de recibir tratamiento con irinotecán, y con una expectativa de vida superior a tres meses. Además, los pacientes debían presentar normalidad en su función medular (recuento de neutrófilos > 1,5 x 10⁹/L, recuento de plaquetas > 150 x 10⁹/L y hemoglobina > 12,0 g/dL,), renal (creatinina sérica < 1,5 mg/dL) y hepática (bilirrubina < 1,2 mg/dL, aspartato aminotransferasa (AST) < 40 U/L y alanina aminotransferasa (ALT) < 40 UI/L). Se excluyeron del estudio las mujeres lactantes o en periodo gestacional y aquellos pacientes que presentasen alguna de las siguientes situaciones: escala ECOG > 2 (o escala Karnofsky < 60%), radioterapia extensa previa, trastornos psiquiátricos o de cualquier otro tipo que comprometiese la participación en el estudio, cualquier circunstancia que impidiese que el tratamiento y su seguimiento se realizase según el protocolo establecido y participación en un estudio clínico al menos 30 días antes. En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado del paciente tras una entrevista personal, donde se le informó verbalmente y por escrito de los potenciales riesgos y beneficios del tratamiento y del estudio.

El presente estudio se realizó con un total de 72 pacientes oncológicos, cuyo tumor primario fue carcinoma colorrectal (n = 21), pulmonar microcítico (n = 18) y no microcítico (n = 11), gástrico (n = 6), de ovario (n = 5), y de otros orígenes (n = 11). Los pacientes recibieron tratamiento con irinotecán intravenoso en un régimen de administración bisemanal, con una dosis media de 151 mg/m² (rango de 65350 mg/m²) administrada en perfusión de 60 a 90 minutos. Según el tipo de tumor primario a tratar, irinotecán se administró en terapia combinada con otros antineoplásicos como cisplatino (32%), 5-Fu (29%), doxorrubicina (24%), oxaliplatino (20%) y otros (10%). La tabla 1 resume otras características de la muestra al inicio del estudio.

 

Toma de muestras sanguíneas y técnica analítica de irinotecán y metabolitos. De cada paciente se extrajeron muestras sanguíneas del brazo contralateral al que se administró el primer ciclo de quimioterapia y se recogieron en tubos de plástico con heparina de litio como anticoagulante (Sarstedt^®) a las 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 6; 24 y 48 horas después del inicio de la perfusión intravenosa de irinotecán. Posteriormente, éstas muestras se centrifugaron a 3500 r.p.m durante 10 minutos y el plasma se congeló a -80^oC hasta su valoración.

La determinación de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G se realizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) acoplada a un detector de fluorescencia de múltiple longitud de onda según una técnica analítica previamente publicada²³. Como fase estacionaria se seleccionó una columna Kromasil C₁₈ (5 μm; 4,6 mm x 150 mm) y como fase móvil se empleó una mezcla de dihidrogenofosfato potásico 0,01 M a pH 4,2 y acetonitrilo en proporción 73:27 (v/v). Se utilizó camptotecina como patrón interno a una concentración de 25 μg/L. Antes de su análisis, las muestras se desproteinizaron con acetonitrilo con un rendimiento superior al 93%. La longitud de onda de excitación seleccionada fue 250 nm y la longitud de onda de emisión fue de 433 nm. En estas condiciones, los tiempos de retención obtenidos para irinotecán, SN-38 y camptotecina (patrón interno) fueron de 3,8; 6,9 y 8,7 minutos, respectivamente. La cuantificación de SN-38G se realizó de forma indirecta a través de la diferencia entre el SN-38 cuantificado en las muestras tras su incubación con 1000 unidades de β-glucuronidasa a 37^oC durante 2 horas y el SN-38 cuantificado en las muestras sin ser sometidas al proceso de incubación con β-glucuronidasa²³. La técnica analítica se validó según las directrices de validación de métodos analíticos de la FDA²⁴ y la EMA²⁵ para un ámbito de concentraciones de irinotecán de 5 a 200 ng/mL y de 2 a 400 ng/mL para SN-38. Esta técnica analítica presentó un adecuada exactitud (error relativo < 11,7% para irinotecán y < 8,5% para SN-38) y precisión (coeficiente de variación (CV) < 6,7% para irinotecán, CV < 11,1% para SN-38). La exactitud y precisión en el límite de cuantificación (LC) de irinotecán (5 ng/mL) y SN-38 (2 ng/mL) fueron inferiores al 0,4% y 3,4%, y al 0,8% y 0,2%, respectivamente.

Genotipado de UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9. La determinación de los genotipos en 59 (82%) de los pacientes incluidos en este estudio se realizó a partir de la extracción de ADN de sangre total mediante Proteinasa K a 56^oC y Tissue and Cell Lysis Buffer (EPICENTRE^®). Los polimorfismos genéticos evaluados se determinaron mediante secuenciación directa de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Así, la repetición polimórfica en UGT1A1(TA)_n (n = 6-7) se evaluó con la amplificación de un fragmento del gen con los primers UGT1A1F (5'-GATTTGAGTATGAAATTCCAGCCAG-3') y 211686varR (5'-TTTGGTGAAGGCAGTTGA3'). La reacción de secuenciación se realizó con los primers UGT1A1F y UGT1A1R (5'-CCAGTGGCTGCCATCCACT-3'). Los alelos de UGT1A7 se definieron mediante la combinación de seis SNPs (342G>A, 386A>G, 387T>G, 391C>A, 392G>A, 417G>C y 622T>C) que alteran los aminoácidos codificados G115S, N129R, N129K, R131K, E139D y W208R, respectivamente²⁶. Los primeros utilizados para la amplificación de estos polimorfismos fueron #18 (5'-CGCTGG ACGGCACCATTG-3') y #17 (5'-GCTAAAGGGGAGATA ACTTACC-3'). Los polimorfismos genéticos en UGT1A9 también se evaluaron mediante secuenciación directa de un amplicón que abarcó los sitios polimórficos de interés, incluida la repetición -118(dT)_n (n = 9 o 10), C3Y (8G>a) y M33T (98T>C) entre otras²⁷. Para ello se utilizaron los primers #38 (5'-GTCAAAAATGTCATTGTATGAACC-3') y F273 (5'-AAACTTAACATTGCAGCACAGGGC-3').

Las condiciones de amplificación para cada fragmento fueron 35 ciclos a 95^oC durante 45 segundos, 63^oC de temperatura de anillado para UGT1A7 y UGT1A9 y 60^oC para UGT1A1 , durante 45 segundos en los tres casos. La extensión se realizó a 72^oC durante 90 segundos con una extensión final durante 7 minutos a la misma temperatura. La reacción de PCR contenía 0,125 u Taq DNA Polymerasa (BIOTAQ DNA polimerasa, BIOLINE), 200 μM dNTP y 25 pmol de cada primer. Los productos de PCR se purificaron con el kit QUIAquick DNA Purification Kit (QIAGEN). Se realizó una reacción de secuenciación sense y antisense de los fragmentos amplificados por PCR mediante ABI BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Posteriormente, se realizó una electroforesis capilar de ambas cadenas en secuenciador automático ABI3100xl. Las variantes se determinaron mediante el software SeqScape (Applied Biosystems) con las secuencias de referencia de GenBank (NM_000463 para UGT1A1, AY435142 para UGT1A7 y AY39551 5 para UGT1A9). La codificación para los pacientes heterocigotos y homocigotos con alelos asociados con actividad enzimática reducida fue la siguiente: UGT1A1*1/*28, UGT1A7*1I*3 y UGT1A9*1/*22 para los heterocigotos y UGT1A1*28I*28, UGT1A7*3I*3 y UGT1A9*22I*22 para los homocigotos.

Estudio de haplotipos y desequilibrio de ligamiento. Como los haplotipos a evaluar son una combinación bialélica de diferentes loci de un mismo cromosoma, fue necesario comprobar que la distribución de los polimorfismos genéticos evaluados no se desviaba de manera significativa del equilibrio de Hardy-Weinberg (p >0,05) y, además, evaluar la presencia de desequilibrio del ligamiento (DL) como medida de la desviación respecto de una asociación al azar para dos alelos en loci distintos. El DL se evaluó a partir de la probabilidad observada en el polimorfismo y la esperada en presencia de equilibrio. Estas probabilidades permitieron calcular el desequilibrio escalado (D´), el coeficiente de correlación (r²) y el logaritmo de la likelihood odds ratio (LOD) mediante el software Haploview²⁷. Un valor de D' o r² igual a 1 (o LOD > 2) indicó que la dependencia era fuerte, incluso podría ser completa, mientras que un valor <0 (o LOD<2) indicó una débil dependencia, o incluso independencia, en la transmisión de los polimorfismos. Tan sólo se evaluaron aquellos polimorfismos genéticos que en la muestra de pacientes estudiada se encontraron presentes en, al menos, dos de los pacientes incluidos. Finalmente, para establecer la presencia de un bloque haplotípico, definido como una combinación específica de alelos, se utilizó el método de Gabriel et al.²⁸ implementado en Haploview.

Análisis farmacocinético - farmacogenético

Programas informáticos. El análisis farmacocinético se realizó con el programa informático NONMEM VII (ICON Development Solutions, Ellicott City, MD) compilado con el programa DIGITAL Visual Fortran versión 6.6C. Se utilizó la subrutina ADVAN5 con la aproximación de primer orden condicional con interacción (FOCEI) para el análisis preliminar de los datos. Los parámetros del modelo final se estimaron con el algoritmo Stochastic Approximation Expectation Maximization (SAEM). El análisis gráfico y el análisis exploratorio de las covariables se realizó con el programa S-Plus^® Professional Edition para Windows (Insightful, Seattle, WA, USA).

Modelo farmacoestadístico. Tras el análisis exploratorio gráfico de los datos y la evaluación de la literatura científica, se seleccionó un modelo farmacocinético tricompartimental para irinotecán y bicompartimental para SN-38 y SN-38G, todos ellos con procesos cinéticos de distribución y eliminación de primer orden. El esquema del modelo farmacocinético utilizado para el análisis simultáneo de las concentraciones plasmáticas de iriniotecan, SN-38 y SN-38G se muestra en la figura 1. El modelo se parametrizó en términos de aclaramiento de irinotecán (CL_CPPT-11´ L/h), volumen de distribución central de irinotecán (V₁, L), flujo entre el compartimento central y periférico liviano de irinotecan (Q₂, L/h), volumen del compartimento periférico liviano de irinotecán (V₂, L), flujo entre el compartimento central y el periférico profundo de irinotecán (Q₃, L/h) y volumen del compartimento periférico profundo de irinotecán (V₃, L). Para SN-38, la parametrización se realizó en términos de aclaramiento de SN-38 (CL_SN-38´ L/h), volumen de distribución central de SN-38 (V₄, L), flujo entre el compartimento central y el periférico de SN-38 (Q₅ L/h) y volumen del compartimento periférico SN-38 (V₅ L). Para SN-38G, la parametrización empleada fue aclaramiento de SN-38G (CL_SN-38´ L/h), volumen de distribución central de SN-38G (V_6´ L), flujo entre el compartimento central y el periférico de SN-38G (Q₇, L/h) y volumen del compartimento periférico de SN-38G (V₇, L). Se asumió que todo el irinotecán se transformó en SN-38 y, a su vez, todo el SN-38 fue glucuronizado, y por tanto, los parámetros farmacocinéticos de SN-38 y SN-38G se estimaron de forma aparente, dada la imposibilidad de determinar la fracción metabolizada de irinotecán a SN-38 y de SN-38 a SN-38G a partir de los datos disponibles. Las ecuaciones diferenciales que describen la evolución temporal de las cantidades de irinotecán y sus metabolitos en los compartimentos centrales y periféricos son:

donde k₀ (mg/h) es la velocidad de perfusión de orden cero, T es la duración de la perfusión intravenosa, y A₁, A₂ y A₃ son las cantidades de irinotecán en el compartimento central, periférico liviano y periférico profundo, respectivamente. A₄ y A₅ son las cantidades de SN-38 en el compartimento central y en periférico. A su vez, A₆ y A₇ son las cantidades de SN-38G en el compartimento central y en periférico.

Se asumió que la variabilidad interindividual en los parámetros farmacocinéticos seguía una distribución log-normal según la ecuación:

donde P_j es el parámetro individual del modelo para el paciente j-ésimo, P* es el valor típico poblacional del parámetro del modelo, η_pj es una variable aleatoria independiente que sigue una distribución normal de media cero y varianza ω_p², y cuantifica la diferencia entre el valor típico poblacional y el valor individual. Las magnitudes de las variabilidades interindividuales se expresaron, aproximadamente, como CV. Por otra parte, la variabilidad residual se evaluó con un modelo de error aditivo después de la transformación logarítmica de la concentración plasmática de irinotecán, SN-38 o SN-38G de acuerdo a la siguiente ecuación:

donde C_obs es la concentración plasmática observada de irinotecán, SN-38 o SN-38G, C_pre es la correspondiente predicción del modelo y e es una variable aleatoria independiente, con distribución normal de media cero y varianza σ², distinta para irinotecán, SN-38 y SN-38G, y que describe la diferencia entre el logaritmo de la concentración plasmática observada y el logaritmo de la predicción del modelo, es decir, el valor residual. Además, dada la presencia de concentraciones de irinotecán, SN-38 y SN-38G por debajo del LC, el modelo farmacoestadístico se adaptó para el análisis según el método M3, que considera las concentraciones plasmáticas por debajo del LC como datos censurados y maximiza la probabilidad de tener concentraciones plasmáticas por debajo del LC en función de los parámetros del modelo²⁹.

Criterios de selección de modelos. Durante el análisis de los datos, se evaluaron distintos modelos farmacocinéticos compartimentales con el fin de identificar el mejor modelo capaz de describir la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G. Se seleccionó el modelo farmacocinético que tenía convergencia satisfactoria, adecuada precisión y plausibilidad fisiológica de los parámetros farmacocinéticos estimados. Las comparaciones entre modelos anidados, incluido el análisis de covariables descrito posteriormente, se efectuaron mediante la prueba de razón de verosimilitud (LRT, acrónimo del inglés Likelihood Ratio Test). Esta prueba está basada en el cambio de la función mínimo objetivo (ΔFMO) generada por NONMEM entre los modelos anidados, y es un estadístico que sigue una distribución asintótica, aproximadamente similar a una distribución χ² con n grados de libertad, donde n es la diferencia en el número de parámetros entre los dos modelos anidados. Se requirió un ΔFMO de 3,84 puntos para considerar estadísticamente significativa (p < 0,05) la inclusión (o exclusión) de un efecto fijo adicional. Además se evaluó la regresión a la media (en inglés, shrinkage), las correlaciones de los efectos aleatorios interindividuales³⁰, y los correspondientes gráficos de bondad de ajuste.

Análisis de covariables. Las covariables incluidas en el análisis fueron la edad, el sexo, superficie corporal, la bilirrubina total, la medicación concomitante, el tipo de tumor primario y el polimorfismo genético en UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9. Para cada una de las tres isoformas del enzima UGT, el análisis de los genotipos se realizó bajo dos categorizaciones distintas: por una parte, se consideró a los pacientes heterocigotos y homocigotos con alelos asociados con actividad enzimática reducida en categorías independientes respecto a los pacientes homocigotos con genotipo salvaje, y por otra, se analizó a los pacientes heterocigotos y homocigotos con alelos asociados con actividad enzimática reducida en una categoría conjunta, respecto a los pacientes homocigotos con genotipo salvaje.

El análisis de las covariables se realizó en dos etapas. En primer lugar, se realizó un análisis exploratorio gráfico donde se representaron los valores individuales de los parámetros farmacocinéticos obtenidos frente a los valores de las distintas covariables evaluadas. Además, se realizó un análisis de regresión lineal entre cada parámetro farmacocinético y cada una de las covariables evaluadas, se calculó su coeficiente de determinación (r²) y su valor p. Las variables cuya correlación fue superior a 0,15 y el valor p inferior a 0,05 se consideraron para un posterior análisis en el contexto del modelo de efectos mixtos. Estas variables, se analizaron en NONMEM mediante la metodología de inclusión y exclusión secuencial, de forma que se incorporaron una a una en el modelo farmacoestadístico hasta obtener el modelo completo, en el cual la inclusión de cualquier covariable adicional ya no mejoraba la FMO (χ²: 7,88, grados de libertad (g.l.): 1, p< 0,005). A partir del modelo completo, se evaluó la significación estadística de la exclusión secuencial de las covariables. Así, si la exclusión de la covariable provocaba un AFMO menor a 10,83 (g.l.:1, p< 0,001), dicha covariable era excluida del modelo completo³¹. Este proceso secuencial estricto permitió conservar únicamente las covariables que presentaban una contribución significativa y clínicamente relevante en la estimación final de los parámetros de efecto fijo evaluados.

Validación del modelo final. La validación interna del modelo se realizó mediante dos técnicas diferentes y complementarias como son el normalized visual predictive check (NVPC) y el normalized predictive distribution error (NPDE)³². El NVPC comparó las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G normalizadas con la media y el intervalo de predicción (IP) del 90% de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G normalizadas obtenidas a partir de los parámetros de efecto fijo y aleatorio estimados por el modelo final. La normalización se realizó por la dosis de irinotecán dada la linealidad del sistema. Se evaluó si la distribución de NPDE seguía una distribución normal estandarizada de media 0 y variancia 1, característica necesaria pero no suficiente para validar modelos no lineales de efectos mixtos³².

Efecto del polimorfismo genético en UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9 en el ratio de glucuronidación(RG) y el índice biliar (IB). El área bajo la curva de concentración plasmática frente tiempo (AUC) de cada paciente fue obtenida a partir de la integración numérica de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G desde tiempo 0 hasta tiempo 100 horas. A partir de estos valores, se obtuvo el RG y el IB mediante las siguientes ecuaciones³³:

Tanto el AUC_SN-38, como el RG y el IB se compararon entre los distintos genotipos con la prueba estadística no paramétrica U de Mann-Whitney.

 

Resultados

El modelo farmacocinético poblacional se desarrolló con un total de 1512 concentraciones plasmáticas (531 de irinotecán, 458 de SN-38 y 523 de SN-38G). El 1,69%, 7,64% y 0,76% de las concentraciones plasmáticas disponibles para irinotecán, SN-38 y SN-38G, respectivamente, se encontraron por debajo del LC de la técnica analítica y así se consideraron en la modelización farmacocinética con el método M3.

Los parámetros fármacocinéticos poblacionales del modelo, junto con sus variabilidades interindividuales y residuales se presentan en la tabla 2. Los parámetros de efecto fijo se estimaron con una moderada precisión (CV <45%) excepto V₄ y V₆. La variabilidad interindividual fue superior al 50% en todos los parámetros del modelo y los valores de regresión a la media fueron siempre menores de 0,3. La incorporación en el modelo de las correlaciones entre los parámetros Cl_CPT-11, V₁, V₂, V₄, Cl_SN-38, Cl_SN38G y V₆ disminuyó la FMO en 195,8 puntos. La mayor correlación se determinó entre Cl_CPT11 y V₂ (r² = 0,81) mientras que el resto de correlaciones fueron moderadas y su r² estuvo comprendido entre 0,54 y 0,71. Simplificaciones del modelo que comprendieron la utilización del modelo bicompartimental en lugar del tricompartimental para irinotecán (ΔFMO = 18,6, g.l. = 2, p <0,0001) ó del modelo monocompartimental en lugar del bicompartimental para SN-38 (ΔFMO = 80,2, g.l. = 2, p<0,0001) y SN-38G (ΔFMO = 219,9, g.l. = 2, p<0,0001) empeoraron significativamente la bondad del ajuste de los datos obtenida respecto al modelo propuesto.

El análisis formal de covariables evidenció que el sexo, la superficie corporal y la bilirrubina total no afectaron de forma estadísticamente significativa a ninguno de los parámetros farmacocinéticos del modelo (figura 2). La heterogeneidad en la quimioterapia concomitante y el tipo de tumor primario tampoco se asoció con los parámetros farmacocinéticos de irinotecán, SN-38 o SN-38G (datos no mostrados). La edad evidenció una posible correlación con el Cl_SN-38 y el Cl_SN-38G. Dada la correlación entre estos dos parámetros del modelo, el análisis combinado del efecto de la edad sobre Cl_SN-38 y el Cl_SN-38G en NONMEM indicó que su influencia en el aclaramiento de los metabolitos no era estadísticamente significativa (ΔFMO = 5,44, g.l. = 2, p = 0,07), aunque existía cierta tendencia de forma que conforme aumentaba la edad, los aclaramientos de ambos metabolitos se reducían.

En la muestra analizada no se encontró en ningún paciente los polimorfismos genéticos 342G>A (G115S), ni 417G>C (E139D), y por tanto, estos polimorfismos genéticos no se incluyeron en el estudio de haplotipos. Ninguno de los polimorfismos genéticos analizados se desvió significativamente del equilibrio de Hardy-Weinberg (p > 0,50). El análisis del DL se presenta en figura 3, donde la línea blanca horizontal de la parte superior de la figura representa la ubicación espacial de los polimorfismos genéticos UGT1A9, UGT1A7 y UGT1A1 de izquierda a derecha, y las líneas que aparecen debajo son simplemente un indicador hacia las ubicaciones de las distintas variantes desde la posición que cada polimorfismo detectado en la población de estudio ocupa en el gráfico. Entre los pares de variantes genéticas evaluadas, el parámetro D fue 1 en todos los casos, y el valor de r² se muestra en la figura 3, donde los cuadrados sombreados en oscuro indican que existe fuerte dependencia en la transmisión de los polimorfismos (LOD > 2) mientras que los cuadrados sombreados en claro indican una dependencia más débil (LOD<2). También fue posible definir la presencia de un bloque haplotípico que corresponde a 8 de las 10 variantes genéticas evaluadas y que en la figura 3 está limitado por la línea negra continua y discontinua. La presencia de este bloque haplotípico implica que los polimorfismos no sinónimos (es decir, aquellos que producen un cambio de aminoácido) de UGT1A7 y UGT1A9 comprenden una región con muy escasa recombinación y con un fuerte DL. Estos resultados evidencian la existencia de DL significativo entre las variantes UGT1A1 y UGT1A7 y entre las distintas variantes de UGT1A7 y UGT1A9, y explican la correlación existente entre los genotipos de las distintas isoformas. Esta colinealidad impide el análisis multivariante del efecto de los polimorfismos en UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9 sobre el aclaramiento de SN-38 y justifican su análisis univariante. De hecho, 79% de pacientes con la variante alélica UGT1A7*3 también presentaron la variante UGT1A1*28 que confiere baja actividad enzimática, mientras que el 100% de pacientes con la variante alélica UGT1A7*3, presentó la variante UGT1A9*22.

El análisis del efecto de los polimorfismos genéticos UGT1A1, UGT1A7, y UGT1A9 en el aclaramiento de SN-38 indicó que la presencia de, al menos, un alelo asociado con baja actividad enzimática se asociaba con una reducción del aclaramiento de SN-38, independientemente de la isoforma analizada. Este efecto fue significativamente mayor en los individuos homocigotos con variante alélica UGT1A1*28 (tabla 3). Las diferencias en las reducciones del aclaramiento de SN-38 entre individuos heterocigotos y homocigotos con alelos asociados con una actividad enzimática reducida resultó ser similar e inferior al 20% para cada una de las tres isoformas. Así, los individuos heterocigotos u homocigotos con alelos asociados con baja actividad enzimática UGT1A1 presentaron una reducción media del aclaramiento de SN-38 del 36% (IC95%: 7% - 65%). La misma tendencia, aunque de menor magnitud, se observó con los genes UGT1A7 y UGT1A9, donde no se alcanzó la significación estadística. Por ello, el modelo final seleccionado únicamente incluyó el efecto del genotipo UGT1A1 en el aclaramiento de SN-38.

Las figuras 4a, 4b y 4c muestran los gráficos de bondad de ajuste del modelo final para irinotecán, SN-38 y SN-38G, respectivamente. Los círculos se corresponden con las concentraciones plasmáticas de los pacientes homocigoto salvaje mientras que los puntos negros representan los pacientes que presentan alelos asociados con baja actividad enzimática. En los gráficos de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G frente a su predicción poblacional e individual se observa que los datos se agrupan de manera normal alrededor de la línea identidad, circunstancia que determina la ausencia de sesgos significativos en el modelo. Tampoco se observan tendencias marcadas en la distribución a lo largo de la línea de identidad en los gráficos de residuales condicionales ponderados frente a las predicciones poblacionales y el tiempo tanto para irinotecán como para SN-38G. El sesgo aparente que se evidencia en los gráficos de los residuales condicionales ponderados de SN-38 a concentraciones plasmáticas inferiores a 5 ug/L y/o tiempos superiores a 10 h se debe a la ausencia de las concentraciones por debajo del LC en los gráficos. A estos tiempos de muestreo, el porcentaje de concentraciones de SN-38 por debajo del LC resultó ser un 48,1%, muy superior al obtenido para irinotecán (7,62%) y SN-38G (2,75%). Finalmente, los NPDE frente a la predicción poblacional y el tiempo evidenciaron que las observaciones se distribuían de forma aleatoria alrededor del valor 0, desde aproximadamente -3 hasta 3, tanto para irinotecán, como para SN-38G. La media de NPDE fue -0,028 (Intervalo de confianza (IC) 95%: de -0,078 a 0,021) mientras que el valor de la desviación estándar fue 0,975 (IC 95%: de 0,937 a 1,012) y, por tanto, no fueron estadísticamente diferentes de 0 y 1, respectivamente. En el caso de SN-38, de nuevo se evidenció el sesgo aparente debido a que a tiempos mayores de 10 h el porcentaje de observaciones por debajo del LC era elevado y no está representado en el gráfico, al contrario de lo que sucede en la figura 5, donde se presentan los resultados del NVPC de la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G respectivamente, estratificados en individuos homocigotos salvajes (paneles de la izquierda) y en individuos que presentan alelos asociados con baja actividad enzimática (paneles de la derecha). Las líneas continuas representan los percentiles 5, 50, y 95 de las concentraciones plasmáticas simuladas, y por tanto, el área sombreada representa el IP del 90%. Los círculos representan las observaciones por encima del LC, mientras que los triángulos representan los valores por debajo del LC. De izquierda a derecha y de arriba abajo, el 90,2; 95,5; 88,7; 88,0; 94,7 y 93,3% de las observaciones caen dentro del IP del 90%, y, en consecuencia, confirman que el modelo describe adecuadamente los datos observados tanto de irinotecán, como de SN-38 y SN-38G.

Con el modelo final se procedió a evaluar el RG y el IB estratificado por la ausencia o presencia de alelos asociados con baja actividad enzimática en UGT1A1 , UGT1A7 y UGT1A9 (tabla 4). La presencia de polimorfismos genéticos en UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9 aumenta significativamente el AUC_SN-38, y es acorde a la reducción del aclaramiento de SN-38 estimada por el modelo. Además, estos cambios se tradujeron en que la reducción en el recuento absoluto de neutrófilos tras el primer ciclo de tratamiento fue un 37,9% (IC 95%: 14,3-61,5) superior en los pacientes con alelos asociados a baja actividad enzimática con respecto a los pacientes con alelos salvajes. El IB resultó ser similar para todos los pacientes homocigotos salvajes y aumentó entre un 27% y un 44% en pacientes que presentaban algún alelo (heterocigoto u homocigoto) asociado con baja actividad enzimática en cualquiera de las isoformas analizadas. Consecuentemente, estos pacientes también presentaron el menor RG, especialmente aquellos con alelos asociados con baja actividad de UGT1A1.

 

Discusión

El objetivo de este trabajo fue desarrollar un modelo farmacocinético poblacional para caracterizar conjuntamente la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G en pacientes oncológicos y estudiar el efecto de los polimorfismo genéticos de UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9 en los parámetros farmacocinéticos de irinotecan y sus metabolitos. La modelización farmacocinética conjunta del fármaco y sus metabolitos se han aplicado con éxito en diversas situaciones y permite obtener simultáneamente la información relativa a la tendencia central y variabilidad de los parámetros farmacocinéticos de cada fármaco y sus metabolitos³⁴. Así, la farmacocinética de irinotecán se describió adecuadamente con un modelo tricompartimental lineal, mientras que la farmacocinética de sus metabolitos se describió mediante modelos bicompartimentales lineales, tal como ha sido evidenciado con anterioridad en la literatura⁹.

El valor típico del volumen de distribución en compartimento central de irinotecán fue de 99,7 L mientras que los volúmenes de distribución aparentes en compartimento central de SN-38 y SN-38G, fueron de 72,4 y 46,3 L, respectivamente. Los correspondientes V_ss fueron de 425, 9702 y 359 L. El V_ss para irinotecán claramente excedió el volumen de agua corporal total y refleja la elevada distribución a los tejidos periféricos. Esta misma conclusión se puede inferir para SN-38. Asumiendo que un 15% de la dosis de irinotecan se transforma a SN-38, el V_ss de SN-ss 38 sería de 1455 L, mientras que para SN-38G sería 54 L si se considera que el 100% de SN-38 se transforma a SN-38G. La diferencia entre el V_ss y el volumen estimado en compartimento central informa sobre el alto grado de distribución no específica de SN-38, y en menor medida de SN-38G. El CL_CPT-11, CL_SN-38 y CL_SN-38G fue de 43, 1340 y 188 L/h, respectivamente. El valor del CL_CPT-11 es comparable con valores previamente publicados^9,15 mientras que los valores del CL_SN-38 y CL_SN-38G fueron superiores a los previamente publicados por otros autores, hecho que podría explicarse por la incorporación al análisis de las concentraciones plasmáticas inferiores al LC de la técnica analítica y, en menor medida, por el análisis simultáneo de los tres compuestos. Destacar que el aclaramiento de SN-38 fue aproximadamente 7 veces mayor que el aclaramiento de SN-38G, circunstancia que determina que las concentraciones de SN-38 sean sistemáticamente inferiores a las alcanzadas con SN-38G, tal y como se ha publicado en la literatura. El análisis de las covariables evidenció que la edad, el sexo, la superficie corporal, la bilirrubina total, la medicación administrada de forma concomitante y el tipo de tumor tratado no presentaron correlación alguna con los parámetros farmacocinéticos del modelo. Estos resultados concuerdan con la ausencia de efectos clínicamente relevantes de las covariables analizadas sobre los parámetros farmacocinéticos de irinotecán, SN-38 y SN-38G previamente publicados^9,15.

Cualquier estudio de polimorfismos genéticos debe evaluar la independencia de alelos en un locus entre cromosomas homólogos (equilibrio Hardy-Weinberg) y la asociación entre alelos de diferentes loci en uno de los cromosomas homólogos (desequilibrio de ligamiento). Es necesario verificar que los polimorfismos de un solo nucleótido se encuentran en equilibrio Hardy-Weinberg ya que desviaciones de este equilibrio indicarían la existencia de factores distintos al factor de estudio que podrían afectar las frecuencias alélicas o bien errores de genotipado. Este no ha sido el caso del estudio que se presenta por cuanto las variantes genéticas analizadas no se desviaron significativamente del equilibrio de Hardy-Weinberg (p >0,50). Por otra parte, la presencia de DL indica que la asociación entre alelos no es aleatoria y que los polimorfismos de un solo nucleótido en un alelo condicionarán aquellos en el alelo próximo. En este sentido, el análisis del DL respecto a UGT1A evidenció una alta correlación entre las distintas variantes genéticas que está en consonancia con los resultados previamente publicados por Cecchin et al. en pacientes con cáncer colorrectal metastático²². Estos resultados también confirman que la correlación entre UGT1A7 y UGT1A9 es más fuerte entre ellos que con respecto a UGT1A1, probablemente debido a la mayor proximidad de estos genes. La elevada correlación existente entre los distintos polimorfismos evaluados impidió realizar un análisis multivariante de las tres isoformas de UGT sobre el Cl_SN-38; sin embargo, el análisis univariante estableció una reducción del 36% en el aclaramiento de SN-38 en pacientes con polimorfismo genético en UGT1A1*28, tal y como ampliamente se había referenciado en la literatura científica³⁵. Aunque los polimorfismos en UGT1A1*60 y UGT1A1*93 también se asocian con efectos adversos hematológicos que podrían ser debidos a una mayor exposición al fármaco, este estudio se ha centrado en UGT1A1*28 porque es el principal marcador genético relacionado con toxicidad tras tratamiento con irinotecan. La validación interna del modelo farmacocinético seleccionado confirmó que el modelo predice adecuadamente la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G y su variabilidad, tanto en pacientes nativos como en pacientes que presentan algún alelo asociado con baja actividad enzimática en UGT1A1, UGT1A7 y UGT1A9. Por tanto, este modelo farmacocinético podria utilizarse de forma exacta y precisa como base de un algoritmo bayesiano para optimizar las pautas posológicas de irinotecan en pacientes oncológicos.

La reducción del aclaramiento en los pacientes con alelos asociados a baja actividad enzimática, concuerda con el aumento del AUC_SN-38 y el IB, y la reducción de RG, tal y como previamente se refirió en la literatura^17,22. En este sentido, la disminución del valor del recuento absoluto de neutrófilos en pacientes con alelos asociados a baja actividad enzimática incrementa la probabilidad de desarrollar neutropenia severa. Lamentablemente es difícil comparar el efecto neutropénico del irinotecan entre diferentes estudios dadas las diferencias en cuanto a la dosis, tiempo de perfusión, intervalo posológico, frecuencia de monitorización de los neutrófilos y tratamientos concomitantes, entre otras diferencias^35. Además, aunque podría parecer que evitar el desarrollo de neutropenia grado 2 y 3 es positivo, resultados clínicos en pacientes con cáncer colorrectal metastático han demostrado que los pacientes que desarrollan neutropenia moderada o severa también presentan mayor superviviencia global³⁶. Por tanto, obtener un equilibrio entre toxicidad asumible y beneficio clínico continua siendo un reto para los profesionales sanitarios encargados de la atención integral del paciente oncológico en tratamiento con irinotecan; no obstante, la identificación de covariables predictoras de toxicidad, como es la exposición a irinotecan y sus metabolitos, que a su vez está condicionada con la presencia de polimorfismo genéticos en UGT1A1 , es una herramienta que podría contribuir a la mejora de la calidad asistencial que reciben estos pacientes. En este sentido, es necesario realizar más estudios que evalúen la relación coste-beneficio del genotipado de UGT1A1 y la personalización posológica de irinotecan en pacientes oncológicos.

En conclusión, el modelo farmacocinético-farmacogenético poblacional desarrollado caracteriza simultáneamente la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de irinotecán, SN-38 y SN-38G y su variabilidad, tanto en pacientes nativos como en pacientes que presentan algún alelo asociado con baja actividad enzimática en UGT1A1. El efecto del genotipo UGT1A1 en la exposición sistémica de SN-38 justifica su determinación de forma rutinaria en pacientes subsidiarios de recibir tratamiento con irinotecán. La inclusión de información farmacocinética-farmacogenética puede añadir valor a la personalización de la dosificación de irinotecán por cuanto que permitirá manejar cuantitativamente las reducciones de dosis en pacientes con toxicidad iatrogénica debido a los polimorfismos genéticos en UGT1A1.

 

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Dirección para correspondencia:
Correo electrónico: belen.valenzuela@quiron.es
(B. V. Jiménez)

Recibido: 20 de julio de 2012.
Aceptado: 23 de enero de 2013.