ORIGINALES

 

Evaluación de la toxicidad ocular in vitro de los colirios fortificados antibióticos elaborados en los Servicios de Farmacia Hospitalaria

Evaluation of the in vitro ocular toxicity of the fortified antibiotic eye drops prepared at the Hospital Pharmacy Departments

 

 

Anxo Fernández-Ferreiro^1,2,3, Miguel González-Barcia^1,2, María Gil-Martínez^5,6, María Santiago-Varela⁵, María Pardo⁷, José Blanco-Méndez^3,4, Antonio Piñeiro-Ces⁵, María Jesús Lamas^1,2 y Francisco J. Otero-Espinar^3,4

¹Pharmacy Unit, Xerencia de Xestión Integrada of Santiago de Compostela, SERGAS, Santiago de Compostela.
²Clinical Pharmacology Group, Health Research Institute (IDIS-ISCIII), Santiago de Compostela.
³Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology. School of Pharmacy, Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela.
⁴Industrial Pharmacy Institute, Universidad de Santiago de Compostela (USC), Santiago de Compostela.
⁵Ophthalmology Unit, Xerencia de Xestión Integrada of Santiago de Compostela, Santiago de Compostela.
⁶Ophthalmological Institute Gómez-Ulla, Santiago de Compostela.
⁷Obesidomics Group, Health Research Institute (IDIS-ISCIII), SERGAS, Santiago de Compostela. Spain.

Dirección para correspondencia

 

 

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RESUMEN

El uso de reformulaciones de antibióticos parenterales en forma de colirios de composición o concentraciones no comercializadas, comúnmente denominados colirios antibióticos reforzados, es una práctica habitual en oftalmología a nivel hospitalario. El objetivo del presente trabajo ha consistido en evaluar la toxicidad ocular in vitro de los principales colirios antibióticos reforzados elaborados en los Servicios de Farmacia Hospitalaria. Hemos realizado un estudio experimental in vitro para evaluar la toxicidad de los colirios de gentamicina, amikacina, cefazolina, ceftazidima, vancomicina, colistimetato de sodio e imipe-nem-cilastatina en el que se ha evaluado su citotoxicidad y la irritación tisular aguda. Los ensayos celulares se realizan sobre queratocitos estromales humanos, mediante la utilización de un sistema biosensor de impedancia celular [(xCELLigence Real-Time System Cell Analyzer (RTCA)] y los ensayos de irritación ocular mediante el ensayo Hen's Egg Test.
Todos los colirios, excepto vancomicina e imipenem, han mostrado un efecto citotóxico de concentración y tiempo dependiente, siendo las concentraciones más altas y los tiempos más prolongados los que provocan un descenso más pronunciado en la población de queratocitos estromales. La vancomicina muestra un importante efecto citotóxico inicial que revierte con el transcurso del tiempo y el imipenem se muestra como un compuesto no tóxico para las células estromales. Los compuestos con mayor efecto irritante para la superficie ocular son la gentamicina y la vancomicina. Los colirios antiinfecciosos elaborados en los Servicios de Farmacia Hospitalaria estudiados se muestran como compuestos potencialmente citotóxicos para la superficie ocular, siendo esta toxicidad dependiente de la concentración utilizada.

Palabras clave: Citotoxicidad ocular; Queratitis bacterianas; Colirios antibióticos reforzados; Colirio colistina; Colirio vancomicina; Colirio gentamicina; Colirio amikacina; Colirio cefazolina; Colirio ceftazidima; Colirio imipenem.

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ABSTRACT

The use of parenteral antibiotic eye drop formulations with non-marketed compositions or concentrations, commonly called fortified antibiotic eye drops, is a common practice in Ophthalmology in the hospital setting. The aim of this study was to evaluate the in vitro ocular toxicity of the main fortified antibiotic eye drops prepared in the Hospital Pharmacy Departments. We have conducted an in vitro experimental study in order to test the toxicity of gentamicin, amikacin, cefazolin, ceftazidime, vancomycin, colistimethate sodium and imipenem-cilastatin eye drops; their cytotoxicity and acute tissue irritation have been evaluated. Cell-based assays were performed on human stromal keratocytes, using a cell-based impedance biosensor system [xCELLigence Real-Time System Cell Analyzer (RTCA)], and the Hen's Egg Test for the ocular irritation tests.
All the eye drops, except for vancomycin and imipenem, have shown a cytotoxic effect dependent on concentration and time; higher concentrations and longer exposure times will cause a steeper decline in the population of stromal keratocytes. Vancomycin showed a major initial cytotoxic effect, which was reverted over time; and imipenem appeared as a non-toxic compound for stromal cells. The eye drops with the highest irritating effect on the ocular surface were gentamicin and vancomycin. Those antibiotic eye drops prepared at the Hospital Pharmacy Departments included in this study were considered as compounds potentially cytotoxic for the ocular surface; this toxicity was dependent on the concentration used.

Key words: Ocular cytotoxicity; Bacterial keratitis; Fortified antibiotic eye drops; Colistin eye drops; Vancomycin eye drops; Gentamicin eye drops; Amikacin eye drops; Cefazolin eye drops; Ceftazidime eye drops; Imipenem eye drops.

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Aportación a la literatura científica

El actual trabajo supone el primer artículo publicado sobre la toxicidad ocular in vitro de los colirios antibióticos reforzados elaborados en Servicios de Farmacia Hospitalaria, utilizándose para ello novedosas técnicas de bioimpedancia y seguimiento en tiempo real del comportamiento de queratocitos estromales cuando estos se ponen en contacto con diferentes concentraciones de antibióticos, a la vez que una evaluación de la irritación ocular aguda mediante la realización del ensayo Het-Cam.

Los resultados obtenidos podrán servir como ayuda en la toma de decisiones clínicas y recomendaciones farmacéuticas en el momento de optar por la formulación y posterior utilización del colirio menos tóxico para la superficie ocular. Por otro lado, estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de realizar futuras investigaciones que permitan establecer concentraciones óptimas de antibióticos eficaces y no tóxicos para el tratamiento de queratitis infecciosas.

 

Introducción

Actualmente, existe un número importante de medicamentos oftálmicos de eficacia contrastada que no han sido comercializados por motivos económicos o por problemas de estabilidad, dejando a un número significativo de pacientes en situación delicada y obligando a los oftalmólogos a acudir a tratamientos alternativos^1,2. Con el fin de cubrir este vacío terapéutico se ha incrementado el uso de fórmulas magistrales o de medicamentos obtenidos mediante la manipulación, "reformulación" o adaptación a la vía ocular de formulaciones fabricadas para su administración por otras vías³. En hospitales terciarios, como el Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela, son las formulaciones estériles más frecuentes, rondando las 10.000 unidades anuales.

El epitelio corneal sano supone casi siempre una barrera infranqueable para cualquier microorganismo⁴. Sin embargo, un defecto epitelial puede ser sustrato para el desarrollo de una úlcera corneal infectada. Potencialmente las queratitis bacterianas son un proceso muy grave, que puede conducir a la pérdida de visión por cicatrización o perforación⁵. Para el tratamiento de las queratitis bacterianas graves no hay consenso en el manejo inicial, usándose en la actualidad diferentes esquemas terapéuticos que van desde la utilización fluorquinolonas en monoterapia, a la combinación de colirios antibióticos reforzados como la vancomicina y ceftazidima^6,7. El uso de reformulaciones de antibióticos parenterales en forma de colirios de composición o concentraciones no comercializadas, comúnmente denominados colirios antibióticos reforzados (CAR), es una práctica habitual en oftalmología a nivel hospitalario desde los años 70⁸. Se suele recurrir a estos productos cuando se sospecha un agente causal resistente a los colirios antibióticos comerciales (CAC), especialmente en el tratamiento de las queratitis bacterianas severas. Los objetivos de la terapia incluyen la erradicación de las bacterias causantes de la queratitis y la supresión rápida de la respuesta inflamatoria inducida por estos microorganismos, evitándose de este modo un daño estructural de la córnea⁹. Sin embargo, la utilización de los mismos también han causado importantes complicaciones en el tejido ocular, siendo responsable la toxicidad de los mismos¹⁰.

Para mejorar la seguridad de los pacientes que reciben terapia ocular tópica, resulta esencial estimar de la forma más rigurosamente posible, el potencial irritante de cualquier compuesto que pueda tener contacto con el ojo y sus estructuras adyacentes^11,12. El objetivo del presente trabajo ha consistido en evaluar la toxicidad ocular in vitro de los principales CAR elaborados en los Servicios de Farmacia Hospitalaria.

 

Material y método

Estudio experimental in vitro para evaluar la seguridad de las formulaciones magistrales oftálmicas antibióticas utilizadas para el tratamiento de las queratitis bacterianas. En la tabla 1, se muestran la composición y principales características de los colirios ensayados.

 

Obtención de cultivo primario de queratocitos estromales

Los fragmentos de córnea se incubaron durante 10 min en tripsina a 37^o C de acuerdo con el método modificado Ramke¹³, continuado por la eliminación mecánica de la endotelio y epitelio. El estroma corneal se cortó en secciones de 2 mm que se sumergieron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) / Ham F-12 suplementado con suero fetal bovino al 10%, con 2 mM L-glutamina, y antiinfeciosos (100 IU de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 50 mg / ml de gentamicina). Una vez que los queratocitos humanos (KCH) han proliferado a 37^oC y 5% de CO₂, se retiran las piezas de tejido. Todos los experimentos se llevaron a cabo entre los pases 4 y 10. Las células han sido obtenidas de los remanentes de las córneas humanas utilizadas para el trasplante corneal, de acuerdo con las normas éticas marcadas por la institución. El estudio ha sido autorizado por el Comité de Ética de investigación, dentro del estudio "Desarrollo de alternativas terapéuticas seguras y efectivas para su uso en el tratamiento de enfermedades de la superficie ocular".

Fundamento del ensayo de citotoxicidad celular

Los ensayos celulares, se llevaron a cabo utilizando un sistema biosensor de impedancia celular (xCELLigence Real-Time System Cell Analyzer (RTCA)¹⁴. Este es un sistema que utiliza microchips electrónicos que miden cambios en la impedancia entre los electrodos y la solución. Cuando la célula se adhiere al pocillo (E-placa de 16 Acea Bioscence), la resistencia aumenta y en consecuencia aumenta la impedancia. Los valores de impedancia se transforman mediante la utilización de un algoritmo matemático en un parámetro denominado índice celular (IC)¹⁵. Un IC bajo representa un menor número de células que se unen al microelectrodo, y un incremento de IC se puede atribuir al aumento del número de células¹⁶, detectándose de esta manera todos los cambios de manera continua y en tiempo real. Para el estudio de la citotoxicidad, los valores del IC se expresan como IC normalizado (ICN), donde IC_i(t) es en cualquier momento, e IC_{i(t de la dosis} es IC en el momento de añadir los medicamentos a estudio al medio de cultivo. Las concentraciones de CAR ensayadas parten inicialmente de la concentración de colirio utilizada en terapéutica, para realizar posteriormente diluciones del mismo. Los resultados obtenidos se reflejan en las gráficas que muestran los cambios dinámicos, representándose el ICN desde la adición de los compuestos a lo largo del tiempo para cada una de las concentraciones ensayadas. Las concentraciones de compuestos que hacen disminuir al 50 % del índice celular se calcularon (Software RTCA System^®) por interpolación en los gráficos mediante el que representan la actividad de respuesta normalizada (%), siendo este parámetro el denominado como IC50 y expresándose el mismo en unidades de concentración molar¹⁷.

Metodología ensayos citotoxicidad

La citotoxicidad celular ha sido evaluada utilizando el RTCA. Inicialmente se determina el número de células óptimo para lograr un IC en torno a 1.0 en fase de crecimiento logarítmico¹⁸; momento óptimo para incorporar los medicamentos y ver el comportamiento celular. Un volumen de 150 microlitros de una suspensión de 3000 células por pocillo (número de células óptimo determinado en estudios previos¹⁹), se incubó durante 24 horas hasta alcanzar un valor de IC cercano a uno. En este momento, se renueva el medio de cultivo, que ahora contiene los medicamentos en diferentes concentraciones. Después de la adición de los medicamentos, el comportamiento celular, medido como el ICN, es registrado ininterrumpidamente y automáticamente cada 15 min durante 24 horas.

Los resultados de citotoxicidad determinados con el RTCA se confirman mediante la realización del ensayo de actividad mitocondrial WST-1^® (Cell Proliferation Reagent WST-1 de Roche Applied Science) .La técnica de citotoxicidad mediante el reactivo WST-1 (sales de tetrazolium / formazan) se trata de un ensayo colorimétrico, de cuantificación espectrofotométrica (longitud de onda 220 nm) que se basa en la degradación de las sales de tetrazolium [2-(4-Iodophenyl)-3- (4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium] a sales de formazán, mediante la acción de las deshidrogenadas mitocondriales, que se producen de forma natural cuando las células son viables. Las mediciones se realizan a tiempos de contacto corto (30 min) con una concentración de antibióticos 1:10 con respecto al original.

Ensayo de irritación ocular "The Hen's Egg Test" (Het-Cam)

Para el desarrollo del ensayo HET-CAM se necesitan huevos de pollos broiler fecundados. Estos se introducen en una cámara climática hasta el desarrollo completo de la membrana corioalantoide (CAM) sobre la cual se pondrán en contacto los CAR, para determinar posteriormente el Indice de Irritación (IS) siguiendo la metodología descrita con detalle en trabajos previos. Si en el IS, se alcanzan puntuaciones entre 0 y 0,9 se considera la sustancia como no irritante, ente 1 y 4,9 como ligeramente irritante, entre 5 y 9,9 moderadamente irritante y de 10 a 21 como severamente irritante²⁰. Para cada una de las sustancias se ha ensayado la concentración original de CAR, utilizando un huevo diferente para cada uno y realizando cada uno de los ensayos de manera independiente y por triplicado. El cálculo se realiza como la media de la suma de las puntuaciones individuales de todos los puntos finales en cada uno de los replicados.

 

Resultados

Aminoglucósidos

La amikacina y gentamicina presentan cinéticas de toxicidad similares (Fig. 1), provocando una muerte gradual de las células en el tiempo y que puede llegar a eliminar la totalidad de la población de queratocitos con las concentraciones más altas ensayadas a tiempos prolongados. A tiempos iniciales de contacto, los queratocitos presentan una sensibilidad tóxica similar en ambos aminoglucosidos (superando la OCT dos veces la IC50 en ambos casos), sin embargo, se comprueba que a tiempos prolongados, la gentamicina se muestra mucho más tóxica que la amikacina. Esto puede deberse a que la disolución de gentamicina presenta una hipoosmolalidad que puede llegar a ser tóxica para los queratocitos estromales²¹. Por otro lado, en lo referente a IS determinada por HET-CAM, se ha visto que la amikacina se comporta como un compuesto no irritante (IS = 4,61 ± 2) mientras que la gentamicina como un compuesto severamente irritante (IS = 10,35 ± 1).

Betalactámicos

Los colirios betalactámicos (Cefazolina y Ceftazidima) muestran una evolución similar de la cinética celular. Inicialmente y casi de manera inmediata al adicionar el medicamento diluido en el medio de cultivo, se observa una bajada del IC con posterior recuperación, la cual es pasajera y decae de manera brusca a tiempos elevados (Fig. 2). En ocasiones, las células expuestas a citotóxicos pueden inducir un mayor índice celular transitorio, que normalmente se produce en etapas tempranas o tardías de la exposición a la sustancia tóxica. Este efecto puede deberse a que en ocasiones la toxicidad provoca agrupaciones celulares ("clusters") que inducen a un mayor contacto con el electrodo y por lo tanto a un aumento adicional del ICN¹⁸.Estos tipos de cinética celular ante la exposición de tóxicos, también lo han mostrado compuestos como el arsénico^22,18. En lo referente al índice irritante de estos colirios, se debe decir que ambos presentan un IS catalogado como ligeramente irritante, tomando un valor de 4,65 ± 1 la cefazolina, y de 4,56 ± 1 la ceftazidima.

Glucopéptidos

En el figura 3, se puede observar el efecto de la vancomicina en los queratocitos estromales. Ésta muestra una toxicidad gradual en el tiempo, alcanzándose IC muy bajos a tiempos de contacto cortos con las concentraciones más altas, no resultando tóxicas las concentraciones más bajas. Por otra parte el IS ha mostrado índices de irritación de 9,6 ± 2, catalogándose por tanto como una sustancia moderadamente irritante para el ojo.

Colirio de colistimetato de sodio

El colirio de colistina presenta una toxicidad a nivel celular muy importante a todas las concentraciones ensayadas. Dicha toxicidad probablemente sea debida al efecto tensioactivo de la misma, también responsable de su mecanismo de acción terapéutico, pues este es un antibiótico del grupo de las polimixinas que actúa uniéndose y alterando la permeabilidad de la membrana celular bacteriana produciendo con ello la muerte celular²³. En la figura 4, se puede observar cómo tras el contacto con la colistina disuelta en el medio de cultivo, el compuesto muestra un IC50 de 2.43 mg/ml (OCT supera 4.23 veces la IC50), haciéndose con el tiempo todavía más tóxico, alcanzando IC50 de 0.48 mg/ml a las 10 horas del contacto (OCT supera 20 veces la IC50). En todas las concentraciones ensayadas el compuesto se muestra extremadamente tóxico, sin embargo el índice de irritación de este colirio ha sido nulo en el ensayo HET-CAM.

Colirio de imipenem-cilastatina

En la figura 5 se puede observar como en ninguna de las concentraciones ensayadas con imipenem se observa una disminución del ICN, provocando aumentos en el mismo con respecto al control. El colirio de imipenem presenta un amplio espectro de acción antibacteriana y de los resultados observados se puede señalar que su utilización no resultaría tóxica para las células estromales, llegando incluso a actuar como factor proliferante de las mismas, por lo que supondría una alternativa segura de tratamiento. Por otra parte, el presente colirio ha mostrado valores nulos a nivel de irritación HET-CAM.

Ensayo de actividad mitocondrial WST-1

Con el fin de confirmar que los cambios en el ICN se deben a una disminución en la población de queratocitos, se ha realizado el ensayo WST-1. Como se puede apreciar en la figura 6, con respecto al resultado obtenido con el medio de cultivo (donde las células no están en contacto con antibióticos), existen cambios similares a los apreciados en las gráficas dinámicas de toxicidad. Así a tiempos iniciales se puede observar que los aminoglucosidos y especialmente la vancomicina, tienen una toxicidad importante. Por el contrario, las células en contacto con los betalactamicos presentan una viabilidad similar a las células control; esto probablemente se debe a que a tiempos de contacto cortos, las células se reorganicen en clusters para protegerse frente a los tóxicos, aumentando por tanto el ICN pero no el número celular. El imipenem por el contrario, parece mostrar un efecto positivo sobre la proliferación de queratocitos, efectos ya observados en el ensayo RTCA.

 

Discusión y conclusión

Diversos autores han centraron sus investigaciones en la mejora de la regeneración corneal tras una agresión a esta superficie^24,25 y en la sustitución de la córnea dañada por otra artificial²⁶, sin embargo, la investigación en este campo todavía no ha evolucionado lo suficiente como para trasladar resultados a la clínica. Por otro parte, es conocido que la falta de adherencia es una de las causas más importantes del fracaso terapéutico de los tratamientos farmacológicos tópicos oculares, siendo los principales factores involucrados el malestar ocular (irritación) y la toxicidad que provoca lesiones corneales^19,27,28. Por todo ello, es necesario identificar a los compuestos oculares más tóxicos, y adecuar en lo posible la concentración que resulte eficaz y no perjudicial para la superficie ocular²⁹.

Los agentes causantes más frecuentes de las queratitis bacterianas, son en general los que se encuentran en la flora normal, cocos Gram positivos (Estafilococos epidermidis, Estafilococos aureus, Estreptococo pneumonie) y Gram negativos (Pseudomonas y enterobacterias), que aunque son menos frecuentes, son muy agresivos y se presentan más en portadores de lentes de contacto e inmunodeprimidos⁴. Los valores de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) que establecen el punto de corte para cada microorganismo y antibiótico los establece el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST MIC breakpoints)³⁰. Estos puntos de corte in vitro han sido útiles en la predicción de eficacia clínica de los antibióticos cuando se administran sistémicamente, no siendo por tanto aplicables a la administración oftálmica, puesto que las concentraciones que se obtienen en los ojos son muy superiores a estas. Las concentraciones de los CAR se han establecido arbitrariamente desde el inicio de su utilización, sin realizar replanteamientos sobre si la misma, es la más adecuada.

El colirio de ceftazidima se utiliza principalmente para las infecciones por Pseudomonas aeruginosa, situándose el punto de corte de la misma en 8 μg/ml³¹. En el caso del imipenem, el punto de corte para esta bacteria es de 4 μg/ml y la concentración de principio activo utilizada en terapéutica es diez veces inferior a la del colirio de ceftazidima, superándose aun así en ambos casos, miles de veces el cociente inhibitorio necesario para alcanzar la eficacia antimicrobiana. En los resultados obtenidos en el presente trabajo se ha demostrado que el colirio de imipenem, es el que ha mostrado menor toxicidad para las células estromales, probablemente por ser el CAR que menos concentración de principio activo contiene, situándolo de este modo y desde el punto de vista de la seguridad, como uno de los CAR con mayor atractivo para su formulación y utilización en queratitis que requieran CAR y que engloben microorganismos dentro espectro de acción del mismo (Tabla 2). Otros colirios potencialmente utilizables en el tratamiento de la queratitis por Pseudomona aureginosa, son los aminoglucosidos y la colistina, sin embargo, estos muestran una toxicidad in vitro importante que podría llegar a limitar su utilización. Por otra parte la utilización de vancomicina en el tratamiento de queratitis por sospecha de Gram positivos, podría remplazarse por la utilización de colirios como la cefazolina 50 mg/ml, una alternativa menos tóxica a tiempos de contacto cortos^32,33,34.

Debe tenerse en cuenta que, en la actualidad, conocer la eficacia de los diferentes CAR y pautas de administración de los mismos, es una tarea complicada, y de momento sin resolver debido a que existen pocos estudios controlados con los mismos. En la actualidad, no se encuentran datos concluyentes que nos permitan considerar a un CAR más eficaz que otro^35,36, y por tanto el presente estudio podrían orientar hacia la utilización de los menos tóxicos. Una de las líneas de investigación por explorar es poder conseguir plataformas de administración que contengan las mínimas concentraciones de antibiótico eficaces durante el mayor tiempo posible en la superficie ocular³⁷, o incluir excipientes como ciclodextrinas que logren disminuir la toxicidad de ciertos principios activos^38,39, y de este modo optimizar la terapéutica en el campo de la patología infecciosa ocular.

Por otro lado, debe tenerse en cuenta que cada uno de los compuestos estudiados presenta unas características cinéticas de toxicidad que dependen de la concentración, tiempo de exposición y probablemente del mecanismo de acción tóxico de cada compuesto, quedando este último punto abierto para futuras investigaciones. También sería necesario contemplar que otros tipos de condicionantes galénicos como el paso del principio activo a través de la córnea, la influencia de conservantes en la toxicidad ocular, el grado de ionización del fármaco o la fijación del fármaco a las proteínas de las lágrimas^12,40. Se plantea por tanto, un nuevo escenario multidiscidisciplinar por explorar, tanto a nivel galénico, con la colaboración de universidades e institutos de investigación sanitaria en donde se profundice en la formulación de colirios antiinfecciosos con alta permanencia corneal que puedan incorporar concentraciones no tóxicas de medicamentos, como a nivel de investigación preclínica y clínica en la que se pueda estudiar la eficacia de los mismos mediante la futura realización de estudios multicéntricos.

Hasta que no se avance más en el establecimiento de dosis efectivas de antibióticos a nivel tópico corneal que permitan disminuir las concentraciones de los CAR elaborados en los Servicios de Farmacia, debemos priorizar la utilización de los más seguros teniendo en cuenta que todos los CAR ensayados, excepto la vancomicina e imipenem, han mostrado citotoxicidad con efecto concentración y tiempo dependiente, siendo las concentraciones más altas y los tiempos más prolongados, los que provocan un descenso más pronunciado en la población de queratocitos. La vancomicina muestra un importante efecto citotóxico inicial que revierte con el transcurso del tiempo y el imipenem se muestra como un compuesto no tóxico para las células estromales.

 

Conflicto de intereses

No existe conflicto de intereses por parte de los autores del presente trabajo.

 

Agradecimientos

Fundación Española de Farmacia Hospitalaria y Fundación Mutua Madrileña.

 

 

Dirección para correspondencia:
Correo electrónico: anxordes@gmail.com
(Anxo Fernández-Ferreiro).
Correo electrónico: maria.jesus.lamas.diaz@sergas.es
(María Jesús Lamas Díaz).
Correo electrónico: francisco.otero@usc.es
(Francisco J. Otero Espinar).

Recibido el 30 de noviembre de 2015;
aceptado el 30 de mayo de 2016.

 

 

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