Evaluación del grado de queratinización y el recuento de AgNORs
en citología exfoliativa de mucosa oral normal de individuos
fumadores y no fumadores

Alejandra Isabel Orellana Bustos⁽¹⁾, Iris Lucía Espinoza Santander⁽²⁾, María Eugenia Franco Martínez⁽³⁾,
Nelson Lobos Jaimes -Freyre⁽⁴⁾ , Ana Verónica Ortega Pinto⁽⁵⁾

(1) Cirujano Dentista
(2) Magister en Patología Oral. Facultad de Odontología
(3) Profesor Asistente, Facultad de Odontología
(4) Profesor Titular, Facultad de Odontología
(5) Magister en Patología Oral. Profesor Asistente. Facultad de Odontología. Universidad de Chile

Correspondencia:
Prof. Dra. Ana Ortega P.
Facultad de Odontología. Universidad de Chile
Casilla 1903. Fono-fax :(56) 02- 6781810 Santiago, Chile.
E-mail: aveortega@eudoramail.com

Recibido: 8-12-2002 Aceptado: 29-06-2003

 

RESUMEN

Objetivos. En individuos fumadores con mucosa oral clínicamente sana, se han observado cambios citológicos como una mayor queratinización, existiendo también reportes de un mayor grado de actividad nucleolar. En estos estudios, las células para frotis se han obtenido por medio de espátula de madera. Nuestro objetivo es evaluar la profundidad de muestras citológicas de mucosa oral obtenidas con cepillo para frotis (endobrush) y comparar el grado de queratinización y la actividad nucleolar en pacientes fumadores y no fumadores.
Diseño del estudio. Se obtuvieron frotis de mucosa oral de borde de lengua clínicamente normal de 30 individuos fumadores y 30 no fumadores, utilizando espátula de madera y endobrush. Las muestras fueron teñidas con Papanicolaou y con la tinción AgNORs.
Resultados. Con la espátula de madera se obtuvo un mayor porcentaje de células epiteliales superficiales anucleadas (P= 0.016) y con el endobrush se obtuvieron células más profundas (tipo intermedias) (P= 0.035). Los individuos fumadores presentaron un mayor porcentaje de células superficiales anucleadas con ambas técnicas, diferencia que fue estadísticamente significativa con la técnica endobrush (P=0.005). El promedio de AgNORs en las células nucleadas fue mayor en los individuos fumadores (3.83) que en los no fumadores (2.79) (P= 0.003).
Conclusiones. El endobrush permite obtener células de estratos más profundos. Los individuos fumadores con mucosa clínicamente normal presentan un mayor porcentaje de células queratinizadas y una mayor actividad nucleolar, sugiriendo que el consumo de cigarrillo influye en la actividad celular de la mucosa del borde de lengua.

Palabras claves: AgNORs, regiones organizadoras del nucleolo, citología exfoliativa, mucosa oral, consumo de cigarrillo.

INTRODUCCIÓN

Uno de los factores de riesgo más importantes del cáncer oral es el tabaco (1-5). Este riesgo aumenta a medida que se incrementa el número de cigarrillos consumidos y el tiempo de duración del hábito (2,6). En Chile, en una encuesta realizada a la población urbana entre 12 y 64 años en el año 2000, se observó que 48.7 personas de 100 consumieron tabaco (7). El sitio intraoral en que se ha reportado la mayor frecuencia de carcinoma espinocelular es la lengua, principalmente la superficie lateral posterior y ventral (8,9).

En células de la mucosa oral clínicamente sana de individuos fumadores se ha determinado un aumento del índice de proliferación en las células epiteliales (10), modificaciones en el núcleo y en el citoplasma (11-13) aumento de las células queratinizadas (14) y del número de AgNORs (Regiones Organizadoras del Nucleolo con afinidad por Plata) (15,16).

Los NORs o Regiones Organizadoras del Nucléolo son porciones de DNA ubicadas en los cromosomas 13-15 y 21 que codifican para la producción de RNA ribosomal (17,18). Asociadas a estos NORs encontramos proteínas acídicas no histónicas con afinidad por plata llamadas AgNORs. El número de AgNORs por núcleo se ha correlacionado con la tasa de transcripción del ARN ribosomal, proliferación celular y ploidía del ADN (19,20).

La tinción de AgNORs ha sido utilizada en citología de glándulas salivales y mesoteliales (21,22). Recientemente, de Castro Sampaio et al (15) y Cançado et al (16), utilizando espátula de madera para la obtención de las muestras, han estudiado el efecto del tabaco en individuos fumadores con mucosa oral clínicamente sana.

Desde hace algunos años se ha descrito la eficacia de utilizar un cepillo para la toma de frotis debido a la obtención de células más profundas, tanto de mucosa oral (23-26) como en ginecología (27).

Por lo expuesto anteriormente, es objetivo de este trabajo el comparar el porcentaje de células queratinizadas y la actividad nucleolar observados en la mucosa oral del borde de lengua de individuos fumadores y no fumadores, utilizando para la obtención de la muestra un cepillo para frotis y espátula de madera.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se tomaron frotis de borde de lengua a 30 individuos fumadores que tuvieran como condición consumir más de 10 cigarrillos al día por un mínimo de 10 años, y que no bebieran alcohol ni usaran enjuagatorios con alcohol en forma diaria. Como grupo control se seleccionaron 30 individuos con similares características, excepto el hábito de fumar. El primer grupo se encontraba en un rango de edad entre los 29 y 57 años, con un promedio de 39,5 años y el segundo grupo en un rango de edad entre los 30 y 58 años, con un promedio de 40.5 años. La relación hombre : mujer fue de 12 : 18 y de 11 : 19, respectivamente. A todos los individuos se les solicitó su consentimiento y se tomaron 3 muestras citológicas, una con espátula de madera y dos con endobrush. Las muestras fueron fijadas con fijador citológico Citofix^R spray‚ en base a alcohol.

Las muestras obtenidas con espátula de madera y una de las muestras obtenidas con endobrush recibieron tinción de Papanicolaou, para determinar el número de células superficiales anucleadas, células superficiales nucleadas y células intermedias (14), empleando un aumento de 400x. Las segundas muestras obtenidas con endobrush se tiñeron con la técnica de AgNORs. Esta consiste en un preparado fresco que contiene una parte con gelatina al 2% en una solución de ácido fórmico al 1% y dos partes de nitrato de plata al 50% (28). Las muestras fueron sumergidas en esta solución e incubadas en la oscuridad por un período de 25 min. a temperatura de 45° C, y posteriormente se contó el número de AgNORs por célula, según el Método de Howat (29). Las muestras fueron observadas en un microscopio Nikon Microphot-FXA, utilizando un aumento 1000x y aceite de inmersión. El examinador, que desconocía el origen de las muestras, contó en 100 células por frotis el número de puntos de tinción de AgNORs, excluyendo para el recuento las células superficiales anucleadas y las nucleadas con gránulos de queratohialina que podían llevar a errores en el recuento. Luego de contar el número de AgNORs por célula, se estableció el promedio para individuos fumadores y no fumadores. Los primeros diez frotis fueron contados en una manera no consecutiva tres veces para calibrar al examinador.

Las diferencias citológicas entre pacientes fumadores y no fumadores fueron evaluadas mediante la prueba de chi cuadrada (X²) y la prueba de t de Student con el software estadístico PRI-MER. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa al valor P≤0.05.

RESULTADOS

En el grupo de individuos fumadores la distribución total de células observadas fue: 16,8% de células superficiales anucleadas, 29,6% de superficiales nucleadas y 53,6% de intermedias. En los individuos no fumadores se obtuvo 9,3% de células superficiales anucleadas, 38,5% superficiales nucleadas y 52,2% células intermedias. Al comparar las técnicas para tomar las muestras de frotis, observamos que con la espátula de madera se obtuvo un mayor porcentaje de células superficiales anucleadas (P= 0.016), mientras que con la técnica endobrush se obtuvo un mayor porcentaje de células de estratos más profundos (tipo intermedias) (P= 0.035) (Tabla 1).

Al comparar entre los individuos fumadores y no fumadores, observamos un mayor porcentaje de células superficiales anucleadas en los individuos fumadores, diferencia que fue estadísticamente significativa con la técnica endobrush (P= 0.005) (Tabla 2).

Los individuos fumadores tenían un promedio de 3,83 AgNORs por núcleo (Desviación estándar de 0,68) y los individuos no fumadores presentaban un promedio de 2,79 AgNORs por núcleo (Desviación estándar 0,62) (Figura 1, A y B). Esta diferencia en el número de AgNORs por núcleo entre los individuos fumadores y no fumadores fue estadísticamente significativa (t= 3.488, P= 0,003). La diferencia entre ambos promedios fue -1,04 con un Intervalo de Confianza de un 95% que se encuentra entre -1,67 y -0,41.

DISCUSIÓN

Debido a que una de las limitaciones de la citología exfoliativa es la obtención de células superficiales, se está promoviendo el uso de cepillos para la toma de frotis de la mucosa oral (23-26). Nosotros observamos que efectivamente el endobrush permite obtener un mayor porcentaje de células de estratos más profundos, en este caso, células intermedias, mientras que con la espátula de madera se obtiene un mayor porcentaje de células superficiales anucleadas. Ogden et al (23) describieron que se obtenía un mayor grado de dispersión y una mayor cantidad de células con cepillos para frotis.

En la mucosa del borde de lengua, las células intermedias fueron las observadas con mayor frecuencia, tanto en individuos fumadores como en los no fumadores, alcanzando 55,5% y 60,4 %, respectivamente, lo que coincide con lo descrito por Varvaky et al. (14). Estos autores encontraron que el mayor porcentaje de células en zonas de borde de lengua y mucosa de mejilla eran de tipo intermedias (60% y 62% respectivamente), mientras que el mayor porcentaje de células obtenidas de frotis de labio correspondían a células superficiales anucleadas.

En los individuos no fumadores el porcentaje de células superficiales anucleadas del borde de lengua fue 9.3%, similar al 10% observado por Varvaky et al. (14), quienes en su estudio excluyeron a los fumadores. En cambio, en los individuos fumadores de nuestro estudio, el porcentaje de células superficiales anucleadas del borde de lengua fue más alto, 17%. Este aumento en el número de células superficiales anucleadas u ortoqueratinizadas en mucosa oral de individuos fumadores ha sido observado por numerosos autores (2,6,30-32); sin embargo, esta respuesta de la mucosa oral no parece ocurrir de igual forma en todos los sitios anatómicos de la cavidad oral, Drouilly (30) no observó diferencias significativas en los tipos de células epiteliales obtenidas de frotis de piso de boca de pacientes fumadores y no fumadores. Se postula que este aumento en la producción de células queratinizadas sería provocado por la exposición directa al calor del cigarrillo y por la acción química de los productos volátiles del tabaco, con el fin de protegerse de estos agentes injuriantes(2,6). La importancia de evaluar los cambios celulares en el borde de lengua se debe a la alta frecuencia del cáncer espino celular en esta ubicación en nuestro país (33).

La técnica de AgNORs, se desarrolló en los años 80's y rápidamente se comenzó a emplear en el estudio de biopsias de diferentes tumores, y sólo recientemente se ha aplicado en citología (15,16). En nuestro estudio, el valor promedio de AgNORs por núcleo, en individuos fumadores fue de 3.83 y en el grupo de individuos no fumadores alcanzó a 2.79, resultados que son similares a los descritos por de Castro Sampaio et al. (15) quienes observaron un promedio de 3.4 AgNORs por núcleo en individuos fumadores, y de 2.6 en no fumadores. Recientemente, Cançado et al.(16) también determinaron un mayor recuento de AgNORs en los individuos fumadores, pero sus valores fueron menores a los observados por de Castro Sampaio et al (15) y por nosotros, 1.94 en los frotis de borde de lengua y 2.07 en los frotis de piso de boca.

En relación a la técnica, los tiempos de aplicación de la solución de plata fueron de 30 minutos en el estudio de Castro Sampaio (15), 25 minutos en el nuestro y 20 minutos en el estudio de Cançado (16); sin embargo, nosotros al igual que este último autor, no creemos que esta variación en la técnica influya en el recuento de los AgNORs.

Estas diferencias en el recuento de AgNORs podrían deberse a los distintos rangos de edad de los individuos, que en el estudio de Cançado (15) fue entre 50 y 70 años, y en nuestro estudio entre 29 y 57 años. Se ha descrito que en la mucosa oral durante el envejecimiento se produce una menor actividad proliferativa y atrofia epitelial (34). Otra explicación de este mayor recuento de AgNORs es la diferencia en el elemento utilizado para la obtención de la muestra, pues probablemente las células que nosotros obtuvimos eran más profundas debido al uso del endobrush.

El recuento de AgNORs se ha descrito como un buen método para determinar ploidia, actividad proliferativa (19,20), y como indicador de actividad metabólica no asociada a proliferación celular (35). En citología de mucosa oral normal la mayoría de las células obtenidas son del estrato intermedio y no del estrato basal o parabasal, y por lo tanto este aumento del recuento de AgNORs lo asociamos a un aumento de la actividad metabólica o síntesis proteica en estas células.

La observación de los frotis puede ser a veces difícil, porque al parecer existiría una afinidad de la plata por el mucus y los residuos de alimentos(16), de tal forma que en la recolección de nuestras muestras pusimos énfasis en la realización de enjuagues con agua destilada, ya que observamos, previo a esta investigación en datos no mostrados, que sin estos enjuagues una gran cantidad de tinciones de fondo obstaculizaba el recuento.

Nuestros resultados sugieren que en la mucosa oral del borde de lengua clínicamente normal, el consumo de tabaco produce alteraciones celulares evidenciadas en la citología exfoliativa. Debido a que esta es una técnica no invasiva y un procedimiento fácil de realizar, el análisis de AgNORs puede ser un método auxiliar para monitorear individuos en grupos de riesgo para la prevención del cáncer oral.

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