Microarrays de DNA en el cáncer oral

Eva Otero Rey ⁽¹⁾, Abel García García ⁽²⁾, Francisco Barros Angueira ⁽³⁾, María Torres Español ⁽³⁾, 
José Manuel Gándara Rey ⁽⁴⁾, Manuel Somoza Martín ⁽⁵⁾

(1) Odontológa. Alumna del Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e Implantología de la Facultad de Odontología de la 
Universidad de Santiago de Compostela
(2) Jefe de Sección, Departamento de Cirugía Maxilofacial, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago. 
Profesor Titular de Cirugía Oral y Maxilofacial de la Facultad de Odontología de la Universidad de Santiago de Compostela
(3) Investigador. Unidad de Medicina Molecular – INGO. Universidad de Santiago de Compostela
(4) Catedrático de Medicina Oral y Maxilofacial. Universidad de Santiago de Compostela
(5) Odontólogo. Profesor Colaborador del Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e Implantología de la 
Facultad de Odontología de la Universidad de Santiago de Compostela. España

Correspondencia:
Dr. Abel García García
Facultad de Odontología Calle Entrerríos s/n, 15705- Santiago de Compostela, España
Tlfno: 981563100 – Ext.12357
Fax. 981562226
E-mail: ciabelgg@usc.es

Recibido: 15-09-2003 Aceptado: 31-01-2004

Otero-Rey E , García-García A , Barros-Angueira F , Torres-Español M , Gándara-Rey JM , Somoza-Martín M. Microarrays de DNA en el cáncer oral. Med Oral 2004;9:288-92. © Medicina Oral S. L. C.I.F. B 96689336 - ISSN 1137 - 2834

 

RESUMEN

Uno de los principales objetivos en la investigación sobre el cáncer en la actualidad es el estudio de marcadores que puedan predecir el pronóstico o la respuesta al tratamiento de forma individual. El número de genes implicados en los distintos pasos de la carcinogénesis oral aumenta a medida que se investiga sobre el tema. Los microarrays de DNA permiten el análisis simultáneo de la expresión de cientos de genes de un tejido en un solo experimento. El formato paralelo del ensayo permite el estudio de diferencias en la expresión genética entre células normales y enfermas, puesto que la actividad de cada gen en el microarray puede ser comparada en dos poblaciones celulares distintas. El objetivo de este trabajo es hacer una breve revisión de los estudios realizados por diversos autores que han intentado identificar genes relacionados con el cáncer oral, así como clasificarlo en subgrupos según los patrones de expresión genética; lo que permitirá una precoz detección, mejor diagnóstico y pronóstico del cáncer oral.

Palabras clave: Microarrays de DNA, cáncer oral, expresión genética

INTRODUCCION

El carcinoma epidermoide es la neoplasia maligna más frecuente de la cavidad oral, constituyendo un problema considerable de salud pública. Es la sexta neoplasia maligna diagnosticada con mayor frecuencia en el mundo, aumentando su incidencia desde el año 1970 (1). A pesar de los considerables avances en las técnicas quirúrgicas junto con otras modalidades de tratamiento adyuvante añadidas, no ha mejorado el pronóstico global de los pacientes que sufren esta enfermedad en las últimas dos décadas (2). Se espera que un mejor conocimiento de los determinantes moleculares de la carcinogénesis oral mejore el diagnóstico, tratamiento y control de la enfermedad (3).

Su etiología es multifactorial, siendo los factores de riesgo más prevalentes el consumo de tabaco y alcohol. Ambos factores actúan sinérgicamente, aunque cada uno de ellos posee potenciales carcinogenéticos independientes (4). La asociación de tabaco y alcohol está íntimamente relacionada no sólo con el desarrollo del cáncer oral, sino también con el curso de la enfermedad, estando ligada a un pobre pronóstico (5).

La aparición de tumores de la cavidad oral en pacientes jóvenes y en pacientes no fumadores sugiere el papel de la predisposición genética. En estos casos se han detectado mutaciones en genes supresores de tumores como p53.

Actualmente se acepta que la mayoría de los tumores sólidos resultan de un proceso de múltiples pasos de acumulación de alteraciones genéticas que implican la activación de varios oncogenes y la pérdida de dos o más genes supresores de cáncer (6,7). El número de genes implicados en los distintos pasos de la transformación neoplásica aumenta a medida que se investiga sobre el tema. Recientes estudios sobre la transformación experimental de células humanas indican que la alteración de un limitado número de vías reguladoras celulares es suficiente para que una amplia variedad de células normales adquieran un fenotipo tumoral (8).

Los resultados de la secuencia del genoma humano completada recientemente predicen que el número de genes es mucho menor de lo que se pensaba (aproximadamente 33.000 genes) (9). Esto implica que la gran complejidad de los mecanismos biológicos en los seres humanos reside en los efectos sinérgicos entre varios genes. Por tanto, para descifrar los secretos de la vida y encontrar la curación a muchas enfermedades humanas, los biólogos deben tratar con múltiples genes y su transcripción interactiva simultáneamente (10). Las biotecnologías de alto impacto, incluyendo los alcances de los arrays de DNA, jugarán un papel muy importante en estos estudios (11).

Los microarrays son pequeñas placas de cristal o membranas de nylon a las que se adhieren secuencias específicas de cientos de genes. Se utilizan dos tipos diferentes de secuencias de DNA diana: secuencias de DNA complementario (cDNA), preparadas mediante transcripción inversa de la secuencia de RNA mensajeros (mRNA) de los genes diana, o secuencias de oligonucleótidos que representan segmentos pequeños pero altamente específicos de los genes diana. Como muestras se utilizan cDNA o RNA complementario (cRNA) preparado a partir de RNA derivado del tejido tumoral y del control tisular apropiado. La hibridación simultánea de muestras del tumor y del control que se asocian a moléculas fluorescentes de color diferente da lugar a una coloración particular de cada “spot” representativo de un gen. Para cada gen la intensidad relativa de cada uno de los dos colores representa el nivel de expresión de los RNA procedentes del tumor y del control (12). (Fig 1).

La tecnología microarray proporciona una expresión diferencial simultánea para más de mil genes, pudiendo rastrear decenas de miles de reacciones a la vez en un solo experimento (13). Esto contrasta con los métodos basados en la secuenciación, que requieren una colección seriada de datos para el análisis de la expresión (14). Entre las múltiples aplicaciones de los microarrays destacamos el diagnóstico precoz de la transformación de lesiones premalignas, la identificación de malignidad en una muestra de tejido tomada mediante biopsia, la subclasificación de tumores idénticos histológicamente, la identificación de biomarcadores y el descubrimiento de nuevos fármacos (3).

Existen diversas formas de utilizar los datos procedentes de los microarrays de DNA. En primer lugar, se pueden estudiar los genes individuales que pueden estar relacionados con el pronóstico o que pueden ser útiles como dianas terapéuticas. En segundo lugar, se puede estudiar la batería completa de genes expresados para clasificar tumores, esto es, se puede utilizar el microarray para estudiar el perfil de expresión genética. Estos perfiles de expresión genética pueden ser utilizados para clasificar tumores histológicamente similares en subtipos específicos (15). Alizadeh et al. (16) mostraron que dentro de los linfomas de células gigantes tipo B morfológicamente homogéneos, existen dos subtipos que pueden ser definidos por distintos patrones de expresión genética. Perou et al. (17) proponen que los tumores de mama podrían ser clasificados en distintos subtipos según los perfiles de expresión genética.

Además, el pensamiento actual se basa en que el comportamiento del tumor es dictado por la expresión de miles de genes, y que el análisis con microarrays permitiría que el comportamiento y las consecuencias clínicas fueran predecibles (18).

Van de Vijver et al. (19) han seleccionado 70 genes mediante microarrays determinando un perfil pronóstico en un grupo de mujeres con cáncer de mama, demostrando que constituye un factor predictivo del pronóstico de la enfermedad más potente que los sistemas estándar basados en criterios clínicos e histológicos. De forma similar, van´t Veer et al. (20) descubrieron que el perfil genético predijo eficazmente el pronóstico en las mujeres con cáncer de mama.

Puesto que el microarray proporciona una foto instantánea de la actividad genética para miles de genes, se pueden comparar los datos de muchos experimentos y así, agrupar genes que tengan patrones de actividad consecuentes. De esta forma, los genes que caracterizan un estado celular particular, como la malignidad, pueden ser identificados proporcionando así nueva información sobre la biología del estado celular (18).

ANALISIS DE LA EXPRESION GENETICA DEL CANCER ORAL MEDIANTE MICRO-ARRAYS DE DNA

Se ha intentado caracterizar y predecir la conducta tumoral de los carcinomas epidermoides de la cavidad oral poniendo gran énfasis en el estudio de pérdida de heterocigosidad o inestabilidad de microsatélites en una serie de loci genéticos que se cree están asociados con genes supresores de tumores. Así, existen modelos preliminares de progresión molecular de la carcinogénesis oral: alteraciones estructurales cromosómicas se han asociado con displasia, carcinoma in situ y carcinoma invasivo (21). A pesar de ello, los mecanismos moleculares más precisos siguen aún sin clarificarse (22).

Diversos autores han intentado identificar genes relacionados con el carcinoma epidermoide de cabeza y cuello mediante la tecnología microarray de DNA. (23-25). Villaret et al. (23) han encontrado 13 genes independientes que aparecen sobre-expresados en el carcinoma epidermoide de cabeza y cuello en comparación con tejido normal. De ellos, 9 se conocían previamente y 4 no habían sido previamente identificados. Estos genes se desarrollarán como marcadores tumorales y candidatos de vacuna. Leethanakul (24), comparando el patrón de expresión de los genes relacionados con el carcinoma epidermoide de cabeza y cuello y los correspondientes genes en el tejido normal de los mismos pacientes, ha encontrado 59 genes con una expresión diferencial en cáncer en relación con el tejido normal. Al Moustafa et al. (25) han encontrado cambios significativos en la expresión de 213 genes, con 91 genes sobre-regulados y 122 infra-regulados. Esta lista de genes incluye genes asociados con señales de transducción (factores de crecimiento), estructura celular, ciclo celular, transcripción, apoptosis y adhesión célula-célula.

Belbin et al. (26) han sugerido que los patrones globales de expresión genética pueden ser utilizados para clasificar en subgrupos los pacientes con cáncer. Utilizando un microarray de cDNA en el que se identifican 375 genes, dividen a los pacientes con carcinoma epidermoide de cabeza y cuello en dos subgrupos clínicamente distintos basados en los patrones de expresión genética. Los resultados demuestran que el perfil de expresión genética puede ser usado como un factor predictivo del pronóstico de la enfermedad.

Hasta la fecha, se han publicado pocos estudios relevantes acerca de microarrays y su aplicación en el cáncer oral (27). Kuo et al. (28) hablan de la posibilidad de clasificar el carcinoma epidermoide de la cavidad oral según los patrones de expresión genética. Utilizando un microarray que analiza 4.324 genes han conseguido una lista de 210 genes posibles candidatos a estar relacionados con el cáncer oral. Los resultados han identificado diversos genes con una expresión alterada que no han sido previamente relacionados con el carcinoma epidermoide de la cavidad oral, pero sí se han relacionado a otros tipos de cáncer, tales como: CKS1, TSPY, CBK, TLE4 y BCHE. También han elaborado una lista de genes cuya expresión se correlacionaba con factores clásicos de pronóstico como p53, MST1, HLA-DQB1 y UBA52.

Méndez et al. (29) han encontrado 314 genes con expresión diferencial en el carcinoma epidermoide de la cavidad oral. De ellos, 239 estaban sobre-expresados y 75 eran infra-regulados en el carcinoma. Los carcinomas epidermoides de la cavidad oral son distinguibles del tejido oral normal basándose en los patrones de expresión transcripcional del genoma, sin embargo, no han encontrado diferencias de expresión genética entre estadios incipientes y estadios avanzados o entre tumores con metástasis y sin metástasis en carcinomas epidermoides de la cavidad oral.

Alevizos et al. (30) examinaron cinco casos de cáncer oral y los analizaron utilizando tres herramientas bioinformáticas distintas (software GeneChip, algoritmo GeneCluster y análisis Matlab). Colectivamente, las herramientas bioinformáticas revelaron que aproximadamente 600 genes están asociados con el cáncer oral. Estos genes incluyen oncogenes, genes supresores tumorales, factores de tanscripción, enzimas xenobióticas, proteínas metastásicas, marcadores diferenciales y genes que no se habían implicado previamente con el cáncer oral. Los datos encontrados proporcionan un perfil global verificable de la expresión genética en la carcinogénesis oral, revelando el papel potencial de genes conocidos así como genes que no se habían implicado previamente.

A pesar de que actualmente la relación entre el perfil de expresión genética y el comportamiento celular humano es motivo de especulación, consideramos que la “huella dactilar molecular” es una promesa clínica de gran relevancia para el diagnóstico y terapeútica del cáncer oral.

En el futuro, seremos capaces de usar la información genética para obtener una única huella dactilar de cada tumor (31). Esto permitirá una precoz detección, mejor diagnóstico y pronóstico del cáncer, así como tratamientos individualizados en cada caso y desarrollo de novedosas intervenciones.

Proyecto financiado por la Xunta de Galicia, España, PGIDT01PX120804PR.

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