Expresión proteica de p53 y proliferación celular en leucoplasias orales

Antonio Santos García ⁽¹⁾, M. Mar Abad Hernández ⁽²⁾, Emilio Fonseca Sánchez ⁽³⁾, 
Juan Jesús Cruz Hernández ⁽⁴⁾, Agustín Bullón Sopelana ⁽⁵⁾

(1) Doctor en Medicina. Médico Estomatólogo. Ejercicio Privado de la profesión
(2) Profesora Titular del Dpto. de Biología Celular y Patología. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca
(3) Profesor Asociado del Dpto. Medicina. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca
(4) Catedrático de Oncología. Dpto. de Medicina. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca
(5) Catedrático de Anatomía Patológica. Dpto. de Biología Celular y Patología. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca

Dirección para la correspondencia:
Antonio Santos García
Avda. Tres Cruces, 13. Entrepl. 3. 49008 Zamora
Telf. 980510247; Fax: 923219011
E-mail: asantos@infomed.es

Recibido: 6-11-2003 Aceptado: 7-3-2004

 

Santos-García A, Abad-Hernández MM, Fonseca-Sánchez E, Cruz Hernández JJ, Bullón-Sopelana A. Expresión proteica de P53 y proliferación celular en leucoplasias orales. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2005;10:1-8. © Medicina Oral S. L. C.I.F. B 96689336 - ISSN 1698-4447

 

RESUMEN

Objetivos: Conocer la expresión proteica de las alteraciones genéticas que se producen en las etapas precoces de la cancerización del campo de cavidad oral en nuestro medio. Estudiar la proliferación celular mediante Ki-67 y la expresión de la proteína p53 para valorar si las alteraciones en la expresión proteica de estos marcadores suceden de forma secuencial a través de las distintas etapas en la cancerización del campo de la cavidad oral.
Material y métodos: Se realizó un estudio mediante técnicas de inmunohistoquímica sobre 53 pacientes que presentaron lesiones de leucoplasia oral, atendidos por el Servicio de O.R.L del Hospital Universitario de Salamanca, desde 1.990 hasta 2000. Se incluyen en el estudio 11 muestras de epitelio normal, 15 displasias leves y moderadas, 15 carcinomas in situ, y 12 carcinomas microinvasores. Resultados: Encontramos la proliferación celular aumentada y sobreexpresión de p53 a medida que avanzamos en el grado de severidad histopatológica de las lesiones. Las alteraciones más precoces son el aumento significativo de la proliferación celular en displasias leves y moderadas y el aumento de expresión de p53.
Conclusión: La leucoplasia oral es un estado precanceroso que constituye una lesión cancerizable debido a las alteraciones genéticas que intervienen en la evolución de la lesión. El estudio inmunohistoquímico y molecular de las lesiones es un medio rutinario que permite conocer la expresión proteica de las alteraciones genéticas, que puede ayudar en el diagnóstico precoz y tratamiento de esta patología, teniendo especial relevancia el estudio de Ki-67 en etapas iniciales y p53 en lesiones más avanzadas.

Palabras clave: Lesiones precancerosas orales, Cancerización del campo, p53, Ki-67, Inmunohistoquímica.

 

INTRODUCCIÓN

La prevención del cáncer de cabeza y cuello requiere diversas actuaciones entre las cuales puede ser clave el estudio de las lesiones premalignas orales en su localización oral. Dentro de las lesiones premalignas podemos incluir en orden de frecuencia: leucoplasia oral, eritroplasia, liquen plano oral, lupus eritematoso discoide, sífilis, disfagia sideropénica, y fibrosis oral submucosa (1,2). El nivel de riesgo de transformación maligna de la leucoplasia se ha asociado con el tipo de lesión histológica (3). La tasa global de transformación maligna para las lesiones con diagnóstico anatomopatológico de displasia varía, en los distintos estudios, del 2 al 36% y es distinta en función del tiempo de seguimiento de las lesiones (4,5). La elevada frecuencia de desarrollo de segundas lesiones premalignas y malignas en cavidad oral y en cabeza y cuello subraya la naturaleza "condenada" de toda la mucosa de esta región. La teoría de cancerización del campo se ha propuesto explicar este aumento del riesgo de transformación en el tracto aéreo - digestivo superior (6-8). El desarrollo del cáncer oral lleva consigo unos pasos previos a la progresión maligna a través de grados crecientes de displasia que son el resultado de la acumulación de diversas alteraciones genéticas. Según esta teoría, los tumores crecen mediante un proceso de evolución clonal dirigida por mutaciones, en donde múltiples "golpes" (mutaciones) en una célula son necesarios para desarrollar el carcinoma (9). Los modelos más recientes de génesis tumoral muestran que es un proceso en el que median múltiples alteraciones moleculares, a través de las cuales, se activan protooncogenes que estimulan el crecimiento celular, y genes supresores de tumor que inhiben la proliferación celular en condiciones normales, volviéndose inactivos y conduciendo a la célula hacia una transformación neoplásica (7,10,11). Los análisis de las alteraciones genéticas de los loci de los cromosomas principales han demostrado incrementos en las pérdidas alélicas que progresan desde diversos grados de displasia hacia carcinoma in situ y cáncer invasivo que soportan las bases genéticas de la cancerización del campo (10). Dentro de estas alteraciones, adquiere especial relevancia el gen p53. Es un supresor de tumor que reduce la proliferación celular y la replicación del DNA, ejerce un control sobre el ciclo celular bloqueando la progresión desde la fase G1 a la fase S. En células normales el tipo normal de la proteína p53, debido a su corta vida, es normalmente indetectable por inmunohistoquímica, de forma que las alteraciones en p53 debidas a mutaciones tienen como resultado una pérdida de control del ciclo celular (12,13). La detección de esta expresión proteica, mediante inmunohistoquímica, empleada de forma rutinaria en el laboratorio, puede contribuir a la mejora del diagnóstico y el tratamiento de las lesiones precancerosas orales. En el presente estudio vamos a observar el comportamiento de la expresión proteica de la proliferación celular (Ki-67) y del gen supresor de tumor (p53), en lesiones precancerosas orales cuyo diagnóstico anatomopatológico abarca desde epitelio normal, displasias, carcinomas in situ y microinvasores con el objeto de determinar la relación entre la expresión proteica de estos marcadores y de estas lesiones potencialmente malignas.

MATERIAL Y MÉTODOS

Para la realización de este trabajo se han revisado los archivos de los Servicios de Anatomía Patológica y ORL del Hospital Clínico Universitario de Salamanca desde el año 1990 hasta el año 2000 ambos inclusive. Seleccionando 53 muestras de pacientes con diagnóstico macroscópico de leucoplasia oral cuyo diagnóstico anatomopatológico fue de 11 casos de epitelio normal, 2 displasias leves y 13 displasias moderadas, 15 carcinomas in situ y 12 carcinomas microinvasores siguiendo los criterios de diagnóstico anatomopatológico de estas lesiones (14,15).

Técnicas Inmunohistoquímicas:

Se realizan varios cortes, de 4 µ de las 53 muestras de biopsias. Posteriormente se efectúa el desparafinado y rehidratación mediante 4 baños de Xilol 100% de 5 minutos de duración cada uno seguido de 3 baños de alcohol absoluto de 5 minutos de duración cada uno. El desenmascaramiento antigénico se lleva a cabo mediante el lavado de los portaobjetos con agua corriente previa introducción en olla a presión con tampón citrato a pH 6, contando de 3 minutos desde que empiece a hervir. Lavándose seguidamente los portaobjetos, con agua destilada primero, y después con PBS. Los anticuerpos utilizados son monoclonales.

La técnica de marcaje inmunohistoquímico se ha llevado a cabo en un inmunoteñidor automático Optimax Plus de Biogenex de Menarini Diagnostics. Se ha utilizado la técnica Biotina/Estreptavidina Amplificada (BSA) según método supersensitivo de inmunodetección de Biogenex. Para Ki-67, se ha utilizado como anticuerpo primario MIB-1 (1/100. Master Diagnostics) y para p53 la clona DO7 (1/200, Biogenex). La incubación fue de 30 minutos en ambos casos. Contratinción del corte histológico con hematoxilina de Carazzi y montaje en medio acuoso. Control negativo: el anticuerpo primario específico se sustituye por un tampón. Como control positivo se empleó un carcinoma de mama con alta expresión de Ki 67 y p53.

Valoración de la técnica inmunohistoquímica

Para Ki-67 y p53 se realiza un estudio semicuantitativo valorado por dos observadores independientes. Se valoraron como positivos los núcleos teñidos, expresando el porcentaje de tinción (16) y considerando positividad si la expresión era > 20% para ambos marcadores.

Análisis estadístico:

Hemos utilizado el programa estadístico NCSS para Windows. Realizando un estudio estadístico descriptivo: media, desviación típica y error estándar para las variables cuantitativas y frecuencias y porcentajes para las variables cualitativas. Los estudios inferenciales de comparación de tendencia central para las variables cuantitativas se han realizado utilizando un ANOVA. Cuando resultó significativo (p<0,05), se buscaron las partes diferentes utilizando los test de Bonferroni, Tukey y LSD. En todos los casos se tomaron como significativos los contrastes con p-valores < 0,05. Hemos agrupado las muestras en un grupo epitelio normal, un grupo de displasias leves y moderadas, un grupo de carcinomas in situ, un grupo de carcinomas microinvasores.

RESULTADOS

La edad de los pacientes varía desde 38-85 años de edad. La media de edad es de 60 años. Un 33% de los pacientes son mujeres y un 67% son varones. La lengua es la localización más frecuente en estas lesiones con un 36%, seguido de trígono retromolar 28%, encía 15%, suelo de boca 13% y paladar duro 8%.

Resultados para Ki-67: En el estudio morfológico de todas las lesiones incluidas en el estudio observamos positividad para Ki-67. En el epitelio poliestratificado normal, encontramos núcleos teñidos en la capa basal. En displasias leves y moderadas, no es raro encontrarlas en el estrato medio. En los carcinomas in situ, además encontramos núcleos teñidos en el estrato intermedio; y de forma ocasional, incluso en el estrato superior. Asimismo, las mitosis son frecuentes tanto en estrato basal, como en capas altas, siendo positivas para Ki-67. En el carcinoma microinvasor se observa una tinción similar a la del carcinoma in situ, pero además, observamos una tinción positiva en cordones epiteliales atípicos localizados en la zona subepitelial. Los valores para Ki-67 se exponen en la tabla 1, donde queda reflejado que la proliferación celular es negativa en epitelio normal, es positiva en 6 de 15 displasias leves y moderadas, aumentando en 10 de 15 carcinomas in situ, y 10 de 12 carcinomas microinvasores. Encontramos diferencias significativas p < 0.05 entre el grupo de epitelio normal y displasias leves y moderadas; entre epitelio normal y carcinomas in situ y microinvasores (Tabla 2 y Fig.1).

 

Resultados para p53: en epitelio normal no observamos positividad. En displasias leves y moderadas encontramos núcleos teñidos para p53. La distribución en la mayor parte de los casos es parcheada. En carcinomas in situ y microinvasores existe una brusca separación entre epitelio normal e hiperplásico, y el carcinoma in situ (Fig. 2). En los casos en los que existen células con núcleos irregulares y con pleomorfismo llamativo suelen ser positivas para p53. La cuantificación de p53 se muestra en la tabla 1. En epitelio normal p53 es negativo en la totalidad de las muestras. Hay positividad para p53 en 5 de 15 displasias leves y moderadas. En 7 de 15 carcinomas in situ y en 10 de 12 carcinomas microinvasores, hay sobre expresión de p53. Encontramos diferencias significativas entre epitelio normal y carcinomas in situ y microinvasores (Tabla 2).

 

DISCUSIÓN

En las últimas décadas se ha estudiado la base molecular del proceso de desarrollo del cáncer, y se han propuesto modelos de progresión genéticos para varios tipos de tumores. Se ha observado que la acumulación, de varias formas de alteraciones genéticas, es la base para la progresión desde una célula normal a una célula cancerosa, denominándose al proceso, carcinogénesis de múltiples pasos. El proceso de cancerización del campo puede definirse en condiciones moleculares, y la secuencia en el proceso de carcinogénesis de múltiples pasos puede comenzarse a vislumbrar (17).

Los últimos avances en la biología celular vienen aclarando los mecanismos precisos de la regulación del ciclo celular y han venido mostrando que las alteraciones en la proliferación celular es una manifestación muy común en algunos cánceres y en lesiones precancerosas (17). Pero también intervienen genes supresores de tumor como pRb y p53 y otras proteínas asociadas al ciclo celular (18, 19).

El marcador de proliferación, MIB-1 o Ki-67 se expresa en todas las fases del ciclo celular excepto en G0 (20). La expresión de Ki-67 ha sido informada como un buen marcador de proliferación celular en lesiones premalignas y malignas (20). El análisis de la expresión de Ki-67 se usa para determinar el índice de proliferación de las células en tejido normal y en muestras de tumor (16,21). En el presente estudio, para Ki-67, observamos un incremento de expresión, en función del grado de alteración histopatológica de las lesiones. Cuanto más diferenciado es el epitelio menor positividad encontramos, y por el contrario, aquellos epitelios con una gran desdiferenciación la práctica totalidad de los estratos son positivos para este marcador. Por lo tanto, Ki-67 es un excelente marcador de proliferación celular y además permite tipificar con mayor certeza el grado de displasia. La expresión aumenta de forma marcada, a medida que avanzamos en la progresión del grado de displasia de las lesiones orales, habiendo diferencias significativas en la proliferación celular entre epitelio normal y displasias leves y moderadas; aumentando en carcinomas in situ y microinvasores.

p53 es el gen supresor de tumor más importante, se le ha denominado "guardián del genoma", juega un papel importante en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, progresión del ciclo celular, diferenciación celular, reparación del DNA y apoptosis (22). Puede ser inactivado por muchos mecanismos, mutaciones puntuales, deleciones y unión con células y proteínas víricas. Un alto porcentaje de carcinomas epidermoides de cavidad oral tienen niveles elevados de expresión de p53 (15-60%). Pérdidas de heterocigosidad del alelo p53 se han publicado en el 22% de las lesiones precancerosas y también restructuraciones en la región 5´ del gen p53 (23). En condiciones fisiológicas, la hemivida de la proteína p53 es corta (20 minutos). Sin embargo p53 es imprescindible cuando se requiere la aplicación de frenos de emergencia, por ejemplo, frente a radiaciones, luz UV o sustancias químicas que dañen el DNA. Estos casos de asalto al material genético causan cambios espectaculares en la proteína p53 que, de lo contrario, permanece dormida. A través de mecanismos todavía mal conocidos, se produce un rápido aumento de los niveles de p53 y su activación como factor de transcripción. El tipo natural de p53 acumulado se une al DNA y estimula la transcripción de varios genes que intervienen en los dos efectos principales de p53: la detención del ciclo celular y la apoptosis (23,24). Aunque en otros tipos de tumores, la sobreexpresión de p53 es un acontecimiento tardío, en cavidad oral se puede observar en fases más iniciales (12,17).

La detección de p53 en el núcleo celular es debida a una acumulación de proteína mutante, pero ocasionalmente, lesiones p53 positivas pueden no portar mutaciones provocando falsos positivos que pueden deberse a la estabilización de p53 al unirse a mdm2 o a detección de p53 normal sobre regulada como respuesta a daños en el DNA por radiación u otros agentes. La concordancia entre mutación en el gen p53 y la acumulación no es totalmente perfecta, aunque la inmunorreactividad es un indicador aproximado de las lesiones con función p53 alterada (13).

Existen diferentes clonas de P53 para estudios inmunohistoquímicos. Nosotros hemos utilizado DO7, esta clona se ha utilizado ampliamente en el estudio de alteraciones de P53 en diferentes órganos y sus resultados están ampliamente contrastados (25-27). Actualmente se han desarrollado nuevas clonas que permitirán, probablemente, en el futuro una mejor selección de lesiones con P53 mutada.

En nuestro estudio, los niveles más elevados de p53 se localizan en carcinomas in situ y microinvasores. En displasias aumenta el número de núcleos teñidos y la distribución es parcheada, de repente hay zonas de atipia totalmente teñida por p53 al lado de zonas que no expresan tanto p53, como si tuviese un comportamiento selectivo con el clon celular que parece iniciar la alteración del campo, que iniciará la progresión de las lesiones o la aparición de recurrencias y de segundas lesiones; lo que puede explicar algunas de las hipótesis de la cancerización del campo en cavidad oral, como las que propugnan que la exposición a agentes carcinógenos producen alteraciones en distintas partes del epitelio, que con el tiempo, pueden producir lesiones múltiples (17) (Figura 2). Cuanto mayor pleomorfismo y atipia mayor positividad hemos encontrado para p53.

La tasa de transformación maligna de las leucoplasias, en nuestro medio, es de alrededor del 3% por año. Algunas lesiones de leucoplasia pueden contener alteraciones genéticas asociadas al carcinoma y que pueden constituir lo que Braakhuis et al., 2003 definen por "campo" (17), donde p53 es una de las alteraciónes más precoces que inician el desarrollo celular en parches que al crecer se transformarán en "campos". Una célula "stem" adquiere una (o más) alteraciones genéticas y forma un parche con las células hijas genéticamente alteradas. Como resultado de alteraciones genéticas subsecuentes, las células "stem" escapan al control del crecimiento normal, adquiriendo una ventaja de crecimiento y desarrollando un clon, que va creciendo transformándose en un "campo" que desplaza de su localización al epitelio normal (17). Solamente una parte de estos "campos" son clínicamente reconocibles, por ello es urgente el desarrollo de técnicas, lo más rutinarias posible, que ayuden en el diagnóstico de estos "campos" como la tinción con azul de toluidina (OraTest) y la fluorescencia (17,28), así como el estudio rutinario de las biopsias mediante inmunohistoquímica, pueden contribuir a disminuir las recurrencias de las lesiones primarias y la aparición de segundas lesiones a distancia. Cuanto mayor es el número de células preneoplásicas que proliferan en campos, es probable que aumente el riesgo de cáncer dramáticamente. El estudio de modelos de progresión de las alteraciones genéticas o de su expresión proteica que permitan detectarlos, puede jugar un papel clave en la prevención del cáncer oral.

BIBLIOGRAFÍA

1. Thomas G, Hashibe M, Jacob BJ, Ramadas K, Mathew B, Sankaranarayanan R, et al. Risk factors for multiple oral premalignant lesions. Int J Cancer 2003;107:285-91.        [ Links ]

2. Neville BW, Day TA. Oral cancer and precancerous lesions. CA Cancer J Clin 2002;52:195-215.        [ Links ]

3. Rosin MP, Cheng X, Poh C, Lam WL, Huang Y, Lovas J, et al. Use of allelic loss to predict malignant risk for low-grade oral epithelial dysplasia. Clin Cancer Res 2000;6:357-62.        [ Links ]

4. Lee JJ, Hong WK, Hittelman WN, Mao L, Lotan R, Shin DM, et al. Predicting cancer development in oral leukoplakia: Ten years of translational research. Clin Cancer Res 2000;6:1702-10.        [ Links ]

5. Kim J, Shin DM, El-Naggar A, Lee JS, Corrales C, Lippman SM, et al. Chromosome polysomy and histological characteristics in oral premalignant lesions. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001;10:319-25.        [ Links ]

6. Thomson PJ. Field change and oral cancer: new evidence for widespread carcinogénesis?. Int J Oral Maxillofac Surg 2002;31:262-6.        [ Links ]

7. Song JI, Grandis JR. STAT signaling in head and neck cancer. Oncogene 2000;19:2489-95.        [ Links ]

8. Slaughter DP, Southwick HW, Smejkal W. Field cancerization in oral stratified squamous epithelium. Cancer 1953;6:963-8.        [ Links ]

9. Volgestein B, Kinzler KW. The multistep nature of cancer. Trend Genet 1993;9:138-41.        [ Links ]

10. Califano J, van der Riet P, Westra W, Nawroz H, Clayman G, Piantadosi S, et al. Genetic progression model for head and neck cancer: implications for field Cancerization. Cancer Res 1996;56:2488-92.        [ Links ]

11. Califano J, Westra WH, Meininger G, Corio R, Koch WM, Sidransky D. Genetic progression and clonal relationship of recurrent premalignant head and neck lesions. Clin Cancer Res 2000 ;6:347-52.        [ Links ]

12. Kerdpon D, Rich AM, Reade PC. Expression of p53 in oral mucosal hyperplasia, dysplasia and squamous cell carcinoma. Oral Dis 1997;3:86-92        [ Links ]

13. Lopez-Martinez M, Anzola M, Cuevas N, Aguirre JM, Martinez de Pancorbo. Aplicaciones clínicas del diagnóstico de las alteraciones de p53 en el carcinoma escamoso de cabeza y cuello (p53 en el CECC). Med Oral 2002;7:108-20.        [ Links ]

14. WHO Collaborating centre for oral precancerous lesions. Definition of leukoplakia and related lesions: An aid to studies on oral precancer. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1978;46:517-39.        [ Links ]

15. Wenig BM. Squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract: precursors and problematic variants. Mod Pathol 2002;15:229-54.        [ Links ]

16. Saito T, Nakajima T, Mogi K. Immunohistochemical analysis of cell cycle-associated proteins p16, pRb, p53, p27 and Ki-67 in oral cancer and precancer with special reference to verrucous carcinomas. J Oral Pathol Med 1999;28:226-32.        [ Links ]

17. Braakhuis Bj, Tabor MP, Kummer JA, Leemans CR, Brakenhoff. A genetic explanation of Slaughter ´s concept of field cancerization: evidence and clinical implications. Cancer Res 2003;63:1727-30.        [ Links ]

18. Saiz-Rodriguez A. Molecular basis of oral cancer. Med Oral 2001;6:342-9.        [ Links ]

19. Van Oijen MG, Slootweg PJ. Oral field cancerization: carcinogen-induced independent events or micrometastatic deposits? Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000;9:249-56.        [ Links ]

20. Bjarnason GA, Jordan RC, Sothern RB. Circadian variation in the expression of cell-cycle proteins in human oral epithelium. Am J Pathol 1999;154:613-22.        [ Links ]

21. Bongers V, Snow GB, de Vries N, Braakhuis BJ. Potential early markers of carcinogenesis in the mucosa of the head and neck using exfoliative cytology. J Pathol 1996;178:284-9.        [ Links ]

22. Vera-Sempere FJ, Navarro-Hervas M. Sobreexpresión del gen supersor p53 en el cáncer oral. Med Oral 1997;2:283-96.        [ Links ]

23. Whyte DA, Broton CE, Shillitoe EJ. The unexplained survival of cells in oral cancer: what is role of p53? J Oral Pathol Med 2002;31:125-33.        [ Links ]

24. Forastiere A, Koch W, Trotti A, Sidransky D. Head and neck cancer. N Engl J Med 2001;345:1890-900.        [ Links ]

25. Nasierowska-Guttmejer A, Trzeciak L, Nowacki MP, Ostrowski J. P53 protein accumulation and p53 gene mutation in colorrectal cancer. Pathol Oncol Res 2000;6:275-9.        [ Links ]

26. Masuda N, Kato H, Nakajima T, Sano T, Kashiwabara K, Oyama T, Kuwano H. Synergistic decline in expressions of p73 and p21 with invasion in esophageal cancers. Cancer Sci 2003;94:612-7.        [ Links ]

27. Harlozinska A, Bar J, Montenarh M. Analysis of the immunoreactivity of three anti-p53 antibodies and estimation of the relations between p53 status and MDM2 protein expression in ovarian carcinomas. Anticancer Res 2000;20:1049-56.        [ Links ]

28. Guo Z, Yamaguchi K, Sanchez-Cespedes M, Westra WH, Koch WM, Sidransky D. Allelic losses in OraTest-directed biopsies of patients with prior upper aerodigestive tract malignancy. Clin Cancer Res 2001;7:1963-8.        [ Links ]