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INTRODUCCIÓN
La vía de Wnt es una vía de señalización involucrada en una gran variedad de procesos, incluidos el desarrollo y la homeostasis ósea1. De acuerdo con esto, se han identificado mutaciones en diversos componentes de la vía de Wnt que causan diferentes enfermedades musculoesqueléticas2. La vía canónica de Wnt se inicia con la formación de un complejo heterotrimérico entre un co-receptor, LRP5/6, un ligando, WNT, y un receptor, FZD, lo que produce una acumulación de la ß-catenina que, una vez en el núcleo, activará la transcripción de numerosos genes diana importantes para el hueso1. Esta activación está finamente regulada por una serie de inhibidores extracelulares como DKK1 y esclerostina que se unen a LRP5/6 impidiendo la formación del complejo heterotrimérico. Para que DKK1 y esclerostina ejerzan su actividad inhibidora, deben formar otro complejo heterotrimérico con LRP5 y KREMEN1/2 o LRP4, respectivamente. Aunque en el caso de DKK1 la presencia de KREMEN no parece ser necesaria para llevar a cabo una correcta inhibición, sí que es indispensable la presencia de LRP4 para la función inhibitoria de esclerostina3,4.
En humanos se han descrito mutaciones en LRP4 que causan diferentes enfermedades que no solo afectan a la masa ósea, sino también a la regulación de las extremidades y del riñón entre otras, dependiendo de la posición donde tiene lugar la mutación2. En concreto, mutaciones en la cavidad central del tercer propulsor β(β-propeller) causan esclerosteosis, caracterizada por una sindactilia variable e hipercrecimiento óseo progresivo, particularmente severo en el esqueleto facial y cráneo. Estos pacientes presentan un incremento en la vía de Wnt en osteoblastos, generando un aumento de la formación ósea4-6. Además de estas mutaciones, en 2017, Merello y cols.7 describieron una mutación en el segundo dominio β-propeller (p.Thr851Arg) que cosegregaba con el fenotipo en una familia con malformación de Chiari tipo I (MCI). Ésta es una malformación del sistema nervioso central caracterizada por un desplazamiento caudal de las amígdalas cerebelosas, que genera síntomas muy variados tanto en el inicio como en la gravedad (Orphanet, https://www.orpha.net/consor/cgibin/index.php). Aunque algunos pacientes con MCI pueden ser asintomáticos, otros pueden presentar cefalea suboccipital y dolor cervical, entre otros. Es interesante resaltar que esta malformación fue descrita en un paciente que presentaba un fenotipo de alta masa ósea (High Bone Mass: HBM) debido a mutaciones de ganancia de función en LRP5, abriendo así una posible relación entre la MCI, el fenotipo HBM y la vía de Wnt8. Teniendo en cuenta el papel de LRP4 sobre la vía de Wnt y el importante papel que tiene esta vía en la determinación de la densidad mineral ósea (DMO) y en el desarrollo del cráneo, hipotetizamos que mutaciones en LRP4 podrían ser los causantes del fenotipo HBM de mujeres con este fenotipo o de causar la enfermedad en pacientes con MCI. En este trabajo hemos realizado una re-secuenciación del gen LRP4 en una cohorte de 10 mujeres con el fenotipo HBM y en una cohorte de 12 pacientes con MCI.
MATERIAL Y MÉTODOS
Cohortes estudiadas
La cohorte HBM estudiada está descrita en el trabajo de Sarrión y cols.9. Brevemente, se trata de 10 mujeres con fenotipo HBM, donde este fenotipo se define como la suma de los valores de Z-score de columna y de fémur igual o superior a 4.
La cohorte MCI estudiada consta de 12 pacientes con MCI no relacionados, diagnosticados y tratados en el Hospital del Mar de Barcelona. El diagnóstico de MCI se basa en la posición de las amígdalas cerebelosas mediante resonancia magnética cerebral (Achieva 3.0 T, Philips, Amsterdam, Países Bajos) con una herniación igual o superior a 5 mm en una imagen ponderada en T1 sagital media en presencia de signos o síntomas que indiquen compresión neural en la unión cráneo-vertebral, siringohidromielia, disfunción cerebelosa o hipertensión intracraneal. Además, se dispone de información de 8 familiares de 4 de los pacientes con MCI.
Re-secuenciación de LRP4
El ADN genómico de los casos de MCI y sus parientes y de las mujeres HBM se aisló de leucocitos de sangre periférica utilizando el kit de purificación de ADN genómico Wizard® (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En cuanto a la re-secuenciación, específicamente, hemos amplificado los exones que codifican para las mutaciones causantes del síndrome de Cenani-Lenz (p.D137N, p.C160Y, p. D449N, p. T461P, p.L473F, p. D529N, p.L953P, p.C1017R, p.R1277H, p.E1233K) y el tercer dominio β-propeller donde se localizan las mutaciones causantes del síndrome miasténico y de la esclerosteosis. La amplificación de cada uno de estos fragmentos se hizo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando GoTaq Flexi DNA polymerase (Promega). Los fragmentos de PCR fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa y su purificación se hizo en MultiScreenTM Vacuum Manifold 96-well plates (Merck Millipore). Los productos de PCR purificados fueron secuenciados mediante el método de Sanger en el servicio de genómica del CCiTUB (Genómica, Parc Científic, Barcelona, España). El kit de marcado utilizado fue BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ThermoFisher), la detección y la electroforesis se realizaron en los secuenciadores capilares automáticos 3730 Genetic Analyzer y 3730xl Genetic Analyzer (ThermoFisher). El diseño de los cebadores se basó en la secuencia consenso ENSG00000134569 (LRP4; GRCh37.p13) y la secuencia de los mismos se presenta en la tabla 1.
Análisis bioinformático y predicciones in silico del efecto de las variantes
Para identificar y caracterizar todas las variantes, hemos usado información de la base de datos Ensembl GRCh37.p13 y ENCODE. La frecuencia del alelo minoritario (MAF) de cada una de las variantes está extraída de la población europea no finlandesa de gnomAD v2.1.1. Hemos utilizado SIFT, (http://sift.bii.a-star.edu.sg/) y PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) para testar el efecto de las variantes de cambio de aminoácido (missense). La base de datos GTEx (www.gtexportal.org/home/) se ha utilizado para identificar variantes que actúan como eQTLs.
RESULTADOS
Re-secuenciación de LRP4 en mujeres con fenotipo HBM y en pacientes con MCI
En la re-secuenciación de LRP4 hemos identificado 12 variantes, de las cuales una es una variante no descrita anteriormente (c.3364+16A>C; tabla 2). Esta variante se ha encontrado en heterocigosis en la mujer HBM2 que presenta una suma de Z-score (columna y fémur) de 4,6. Seis de las 12 variantes identificadas se encuentran tanto en la cohorte de mujeres con fenotipo HBM como en la cohorte de pacientes con MCI, con una frecuencia similar en ambas cohortes a la de población europea. Además, hemos encontrado 4 variantes solamente presentes en la cohorte HBM y 2 variantes únicamente presentes en la cohorte MCI. Todas las variantes descritas, exceptuando rs558515201 y la variante c.3364+16A>C, aparecen como eQTL de diferentes genes y tejidos en la base de datos GTEx. En concreto las variantes rs17790156, rs61898529, rs2306028, rs964551 y rs2306032 son eQTL de LRP4.
Tabla 2. Variantes encontradas en la re-secuenciación de LRP4 en mujeres con fenotipo HBM y en pacientes con MCI. Los genotipos de la primera columna se indican con los nucleótidos de la cadena codificante del gen LRP4, que es la reversa respecto de la que se usa de modo estándar para indicar las SNVs genómicas. Por ello, por ejemplo, el alelo A de c.431-12G>A equivale al alelo T de rs139371503, e igualmente para las demás variantes
MAF: frecuencia del alelo minoritario; EUR: población europea no finlandesa de gnomAD v2.1.1.; HBM: fenotipo de alta masa ósea; MCI: malformación de Chiari tipo I; dup: duplicación; M: variante missense; I: variante intrónica; S: variante sinónima; eQTL: descrito como eQTL en Gtex; T: tolerado por SIFT; B: benigno por Polyphen-2.
DISCUSIÓN
En diferentes estudios se ha destacado el papel del gen LRP4 en la determinación de la DMO, ya que mutaciones en el mismo generan un fenotipo de sobrecrecimiento óseo. Además, también se lo ha asociado a la MCI en un trabajo de secuenciación de todo el exoma7. En el presente trabajo hemos re-secuenciado las regiones del gen que contienen mutaciones asociadas a diferentes patologías. En él solo hemos encontrado una mutación missense en LRP4 en una paciente con MCI que no cosegrega con el fenotipo en la familia, descartando así su patogenicidad (Figura 1). Es interesante destacar que hemos encontrado una variante no descrita previamente (c.3364+16A>C) y la variante rs55851521, que presenta una muy baja frecuencia en la población europea (MAF=0,00006480), en heterocigosis en dos mujeres con HBM. Además, las variantes rs3751097 y rs540384558, presentes tanto en pacientes HBM como MCI, se encuentran en un elemento regulador en cis categorizado como distal enhancer-like signature por EN-CODE. Por otro lado, de manera contraria a lo esperado, hemos encontrado en ambas cohortes una frecuencia ligeramente menor para el alelo minoritario de la variante rs2306032 que ha sido definido como protector en un estudio de asociación de genoma completo con la DMO total10.
Figura 1. Pedigrí de la familia de la paciente de MCI CH10. NA: no se dispone de datos de los progenitores. Los genotipos se indican con los nucleótidos de la cadena codificante del gen LRP4, que es la reversa respecto de la que se usa de modo estándar para indicar las SNVs genómicas. Por ello, el alelo C equivale al alelo G de rs72897663
Hay que tener en cuenta el bajo número de pacientes como una limitación del presente trabajo. Esto podría explicar tanto la ausencia de variantes causales en el gen LRP4 en estas dos cohortes como los resultados contrarios a los esperados en la frecuencia alélica en el SNP rs2306032. Es por esto que incrementar el tamaño de las cohortes nos permitiría un conocimiento más profundo del papel de LRP4 sobre estos fenotipos.
En conclusión, si bien LRP4 es un gen indudablemente importante para la biología ósea, no hemos encontrado ninguna variante que pueda estar explicando el fenotipo HBM ni MCI. A pesar de estos resultados negativos, es interesante tener en cuenta a LRP4 en la selección de genes candidatos que puedan explicar fenotipos de HBM o causantes de MCI.
