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Puntos clave
La industria pesquera del departamento de Tumbes produce gran cantidad de residuos de crustáceos, siendo estos desechos la materia prima, que permite industrializar la quitina. En primer lugar, se aísla la proteína de los minerales, generalmente calcáreos y otros pigmentos. El quitosano es un derivado de la quitina y se obtiene por industrialización mediante tratamiento de desacetilación química o enzimática.
Introducción
El quitosano tiene transcendencia por sus propiedades químicas y biológicas debido a que es biodegradable, bioactivo, poli-catiónico y biocompatible1; gracias a estas propiedades es muy utilizado en la industria biomédica. Se ha comprobado que derivados del quitosano como el carboximetilquitosano soluble en agua puede actuar como antimicrobiano en el algodón en la industria textil. El quitosano se extrae a partir de la quitina obtenida de los desechos de los crustáceos, siendo el segundo polisacárido más abundante en la Naturaleza.
En la industria alimentaria el quitosano se usa como aditivo (espesantes, gelificantes y emulsificantes)2, también como un clarificador en la industria de bebidas tales como el agua, el vino y el zumo de manzana, presentando la ventaja de que no afecta al color de las bebidas.
En la industria pesquera, como por ejemplo en el departamento de Tumbes, se generan residuos de crustáceos3; estos desechos sirven como materia prima para industrializar la quitina. Una de las etapas en este procedimiento consiste en aislar primero la proteína, minerales calcáreos y pigmentos. El quitosano es un derivado de la quitina que se obtiene en la industria mediante tratamiento de desacetilación química o enzimática. A pesar de que el quitosano tiene grandes propiedades4 y es abundante en la naturaleza, en la industria farmacéutica o alimentaria no ha sido admitido como un componente o un excipiente de las formulaciones. El quitosano es muy versátil ya que puede ser modificado físicamente y obtenerse en forma de polvo, perlas de gel, nano partículas, membranas, esponjas, en forma de panal, fibras o también fibras huecas.
El interés de encontrar nuevos recursos naturales que favorezcan a la humanidad ha llevado a indagar sobre la utilización de los desechos de la industria pesquera5, tal es el caso de los exoesqueletos de los crustáceos. Estos residuos que se generan en la industria pesquera son considerados contaminantes ambientales, sin embargo, de estos residuos se puede extraer la quitina, y de la quitina se puede obtener el quitosano. Estos biopolímeros a su vez tienen un alto valor nutricional.
Las principales causas de deterioro de alimentos se deben a microorganismos tales como levadura, hongos y bacterias6. Este deterioro causa grandes pérdidas económicas para los fabricantes, distribuidores y consumidores.
En la ciudad se ha incrementado el consumo de alimentos conservados para bebes y adultos de la tercera edad, la gran mayoría de estos alimentos no tienen la cantidad necesaria de nutriente o tienen en ella un conservante sintético7. Las compotas elaboradas con dos variedades de plátano y enriquecidas con frutas de la misma región cumplen con los requisitos del Codex alimenticio y la Organización de Mundial de la Salud.
En el año 1811 Braconnot extrajo la quitina por primera vez a partir de hongos superiores8, no obstante, de mayor importancia fueron los estudios de Hoppe-Seyler, quien agregándole hidróxido potásico concentrado a 180°C a la quitina, obtuvo una molécula soluble en ácido acético a la cual denominó quitosano.
La quitina es la materia prima del quitosano y de otros polímeros; este compuesto, se encuentra en animales (artrópodos, anélidos y moluscos) en hongos (ascomicetos, zigomicetos, basidiomicetos y deuteromicetos), aunque según sea la fuente presenta ciertas modificaciones químicas. Estas quitinas presentan diferentes características en su estructura cristalina según sea su fuente. La composición de la quitina no es un polímero amigable para incluirlo en el desarrollo de nuevas formas farmacéuticas; Es por ello, que debe ser procesada en un medio alcalino concentrado y a temperaturas altas de 60°C con el propósito de perder el resto acetilado del grupo acetamida del carbono 2; este tratamiento da lugar al quitosano. La quitina y su derivado el quitosano, a diferencia de los polímeros sintéticos, no genera inconvenientes en relación a su biodegradabilidad, biocompatibilidad y toxicidad, además de ser naturalmente abundantes y renovables.
El consumo de crustáceos tiene un alto valor y entre el 70% y 80% son desechos considerados contaminantes, los desechos de crustáceos pueden ser aprovechados para la obtención de dos biopolímeros, la quitina y su derivado funcional el quitosano9. En la actualidad, el quitosano es un producto que está generando mucha demanda. Este producto puede ser utilizado en la agricultura, industria alimentaria, cosmética, farmacéutica, medicina, como por ejemplo en el tratamiento de quemaduras.
El proceso de obtención de la quitina se realiza en varias etapas: en primer lugar, se procede al acondicionamiento de la materia prima10, seguido de una desproteinización, desmineralización y decoloración; para obtención del quitosano, al producto obtenido se le realiza la desacetilación.
El quitosano en medio ácido presenta carga positiva debido a que se produce una protonización en cada una de sus unidades del grupo amino15. La glucosamina hace que sea soluble en medio acuoso, diferenciándolo de su polímero matriz. Según diversos autores la quitina tiene una alta actividad biocida y en algunos casos el quitosano ha mostrado una alta capacidad biocida frente a bacterias Gram positivas, como por ejemplo S. aureus y B. cereus. Esta capacidad biocida parece ser debida a que las cargas positivas del quitosano (NH3+) interaccionan con las cargas negativas de las membranas bacterianas.
El objetivo principal del estudio es determinar el efecto antimicrobiano del quitosano obtenido a partir de la quitina de cangrejos (Chionectes opilio) añadido en una compota artesanal obtenida a partir de dos especies de plátano peruano, plátano isla (Musa paradisiaca) y plátano pildorita (Musa alinsanaya).
Métodos
Diseño del estudio y población
El presente estudio se incluye en el ámbito de la investigación aplicada con enfoque cuantitativo19. Es de tipo experimental-explicativo y tiene como finalidad comprobar el efecto antimicrobiano del quitosano obtenido a partir de la quitina procedente de los crustáceos de los Manglares de Tumbes en compotas de dos variedades de plátano peruano: plátano isla (Musa paradisiaca) y plátano pildorita (Musa alinsanaya).
La técnica microbiológica utilizada para determinación del efecto antimicrobiano de la solución de quitosano fue el de recuento en placa. Se incluye el análisis de los siguientes parámetros: recuento del número de colonias de hongos y levaduras, observación del tipo de crecimiento, observación de la formación de esporas (conidios y esporangios), y formación de pigmentos; los resultados del recuento se exponen como UFC/g (unidades formadoras de colonia por gramo de muestra). Para el estudio del resto de parámetros la técnica utilizada fue la observación directa.
Variables de evaluación
La variable independiente fue la concentración de quitosano obtenido a partir de la quitina de cangrejos (Chionectes opilio); la concentración utilizada corresponde con la proporción de quitosano que puede ser disuelto. El producto final obtenido consiste en un polvo blanquecino resultado del proceso de desnaturalización de la quitina.
La variable dependiente fue el efecto antimicrobiano del quitosano que, a una concentración del 80%, presenta la capacidad de matar o inhibir el crecimiento microbiano. Este parámetro se evaluó mediante el procedimiento experimental midiendo el halo de inhibición del crecimiento microbiano.
Tratamiento utilizado
Obtención de quitosano. Se utilizó el método convencional; 1. Recolección, primera limpieza y separación del caparazón de los cangrejos de los Manglares de Tumbes. 2. Limpieza de la muestra con solución jabonosa de clorhexidina al 2% (p/v) en agua destilada. 3. Secado a 76°C. Cantidad obtenida de caparazones: 200,86 g. 4. Trituración de caparazones. Tras este proceso se obtuvo una cantidad de 136 g de los cuales sólo se utilizó 50 g. Despigmentación mediante tratamiento con metanol en frasco ámbar. 5. Desmineralización mediante tratamiento con HCl 0,6N durante 24h. En este proceso se eliminan sales orgánicas (CaCO3). 6. Desproteinización y desacetilación mediante tratamiento con NaOH 0,3N a 65ºC/90 min. 7. Secado a 40º C. 8. Adición de 392 ml de ac. acético (1%, v/v); el producto se mantuvo en caliente a 73°C durante 2h. 9. Precipitación del quitosano: filtrado y ajuste a pH =6 con ac. acético. 10. Se filtró nuevamente agregando agua destilada hasta neutralizar la muestra. 11. Secado del producto resultante (quitosano) a 40° C.
Cuantificación de hongos y levaduras. Medio de cultivo: Agar Sabouraud (Merck). Muestras iniciales: 10 compotas de plátano de cada tipo (isla y pildorita) + 80% de quitosano. Preparación de la muestra: se realizaron 3 diluciones (10-1, 10-2, 10-3) de la muestra original en agua de peptona al 1%, p/v. Se sembraron 2 placas por muestra. La inoculación de las placas se utilizó mediante la técnica de incorporación; para ello se agregaron a las placas 1 ml de cada muestra diluida cubriéndose con una cantidad de agar. Tras homogenización con suaves movimientos rotatorios en ambos sentidos se dejó enfriar. Incubación a 25ºC/ 7 días.
Análisis estadístico
Se llevó a cabo un análisis estadístico de medida de tendencia central y de dispersión. Además, se realizó el análisis estadístico inferencial para la comprobación de las hipótesis. Para el análisis de las diferencias significativas de las medias independientes se utilizó la prueba paramétrica chi cuadrado, considerándose un margen de error estadístico de 5%.
Resultados y Discusion
Comparación del efecto antimicrobiano del quitosano obtenido de cangrejos (Chionectes opilio) con y sin el conservante (benzoato sódico)
Se exponen los resultados de la evaluación de las compotas artesanales de plátano isla (Musa paradisiaca) y plátano pildorina (Musa alinsanaya) tratadas térmicamente, y adicionadas de quitosano (80%, p/v) y de conservante.
En la Tabla 1 se observa que las muestras sin tratamiento térmico evidenciaron un alto crecimiento microbiano (>1000 UFC/ml) en el 100% de las muestras analizadas. Este resultado fue mayor al de muestras con tratamiento térmico a excepción de aquellas muestras tratadas térmicamente, pero sin adición de conservante ni de quitosano. Por otro lado, se detectó ausencia de microorganismos en el 60% de muestras adicionadas de quitosano y en el 80% de muestras adicionadas de conservante, ambas tratadas térmicamente. Por otro lado, del total de las muestras de compotas tratadas con quitosano al 80%, el 40% presentaron un resultado de 5 UFC/g, mientras que en las muestras tratadas con conservante el 20% presentaron un resultado de 10 UFC/g; por último, las muestras con tratamiento térmico y sin conservante un 20% de los casos refirieron un resultado de 15 UFC/g.
Tabla 1: Comparación del efecto antimicrobiano expresado como recuento de hongos y levaduras de muestras de compotas de plátano, elaboradas artesanalmente y adicionada de quitosano al 80%, adicionada de conservante (benzoato sódico) y sin conservante.
| Muestra de compota (n=5) | Recuento (UFC/g) | Frecuencia | Porcentaje de muestras (%) |
|---|---|---|---|
| T. término + quitosano (80%) | 5 | 2 | 40 |
| Ausencia | 3 | 60 | |
| T. térmico sin conservante | 15 | 1 | 20 |
| 25 | 1 | 20 | |
| 30 | 1 | 20 | |
| >500 | 1 | 20 | |
| >1000 | 1 | 20 | |
| T. térmico con conservante | 10 | 1 | 20 |
| Ausencia | 4 | 80 | |
| Sin tratamiento térmico | >1000 | 5 | 100 |
En la Tabla 2, se expone la media de los recuentos microbianos de los cuatro grupos de muestras estudiados para evaluar la actividad antimicrobiana frente hongos y levaduras. Las muestras sin tratamiento térmico dieron como resultado recuentos muy superiores al resto de los grupos evaluados (1000 UFC/g), seguido de las muestras con tratamiento sin conservante, las cuales refirieron una media de 314 UFC/g; Por otro lado, se observa que el tratamiento con quitosano al 80% (p/v) y con conservante dieron como resultado una media de 2 UFC/g en ambos casos.
Tabla 2: Diferencias de medias de los valores en los recuentos de hongos y levaduras en los diferentes tratamientos realizados a muestras de compota de plátano artesanal.
| Muestra | N | Media | Desviación Estándar | Desv. Error promedio |
|---|---|---|---|---|
| T. Térmico + Quitosano 80% | 5 | 2,00 | 2,739 | 1,225 |
| T. Térmico Sin Conservante | 5 | 314,00 | 4,355 | 1,947 |
| T. Térmico Con Conservante | 5 | 2,00 | 4,472 | 2,000 |
| Sin Tratamiento Térmico | 5 | 1000,00 | 0,000 | 0,000 |
En la Tabla 3, se describe la prueba de Anova de un factor, donde el valor del nivel de significancia (Sig.) es 0,000 entre los grupos con diferentes tratamientos analizados para el recuento de hongos y levaduras. Este resultado es menor que el nivel de significancia de 0,05 donde p-valor es menor que 0,05 y por lo tanto, se rechaza la hipótesis nula (Ho) y se acepta la hipótesis (H1)
Tabla 3: Prueba Anova de los recuentos de hongos y levaduras en los diferentes tratamientos antimicrobianos en una compota de plátano artesanal.
| Suma de cuadrados | Grados de libertad | Media cuadrática | Prueba de Fisher | Sig. | |
|---|---|---|---|---|---|
| Entre grupos | 3321615,000 | 3 | 1.107.205,000 | 23,344 | 0,000 |
| Dentro de grupos | 758880,000 | 16 | 47.430,000 | ||
| Total | 4080495,000 | 19 |
*Valores de p significativo a un nivel de significancia de 0,05
En la Tabla 4, al comparar las diferencias entre las medias de los valores obtenidos en los recuentos de hongos y levaduras en los diferentes tratamientos de efecto antimicrobiano de una compota de plátano artesanal, se observa que las muestras bajo tratamiento térmico + quitosano al 80% (D) no indican diferencias significativas con las muestras tratadas con y sin conservante al ofrecer una significancia de p= 0,148 y p= 1,000 respectivamente, mayores al nivel de significancia establecido en la investigación (p> 0,05). Mientras que, con las muestras sin tratamiento térmico (C), se evidencian diferencias significativas p-valor= 0,000 .
Tabla 4: Comparaciones múltiples mediante la prueba de Tukey de los recuentos de hongos y levaduras en los tratamientos de una compota de plátano artesanal.
| (I) Muestra | (J) Muestra | Diferencia de medias (I-J) | Sig. |
|---|---|---|---|
| D | A | -312,000 | 0,148 |
| B | 0,000 | 1,000 | |
| C | -998,000* | 0,000 | |
| A | D | 312,000 | 0,148 |
| B | 312,000 | 0,148 | |
| C | -686,000* | 0,001 | |
| B | D | 0,000 | 1,000 |
| A | -312,000 | 0,148 | |
| C | -998,000* | 0,000 | |
| C | D | 998,000* | 0,000 |
| A | 686,000* | 0,001 | |
| B | 998,000* | 0,000 |
A: Tratamiento térmico sin conservante. B: Tratamiento térmico con conservante. C: Sin tratamiento térmico.D: Tratamiento térmico + quitosano (80%, p/v).
*Desv. error para todas las muestras es de 137,739.
Las muestras bajo tratamiento térmico sin conservante (A) no refieren diferencias significativas con los grupos de tratamientos de quitosano al 80% (p= 0,148 ) y con conservante (p= 0,148). Sin embargo, si se evidencian diferencias significativas con el grupo que no recibió tratamiento (p= 0,001).
Por su parte, las muestras bajo tratamiento térmico con conservante (B) no refieren diferencias significativas con los grupos de tratamientos de quitosano al 80% (p= 1,000) y sin conservante (p= 0,148), evidenciando diferencias significativas con el grupo que no recibió tratamiento (p= 0,000 ).
De esta manera a través de los resultados obtenidos en la prueba de Tukey se verifica que los recuentos de hongos y levaduras en las muestras de compota de plátano artesanal entre los grupos son iguales para las muestras tratadas con quitosano al 80% (p/v), con y sin conservante (benzoato sódico), y diferente para las muestras que no recibieron tratamiento. Es decir, en el estudio planteado se verifica que el quitosano surte un efecto antimicrobiano frente a hongos y levaduras.
En la Tabla 5, según las medias obtenidas de los recuentos de hongos y levaduras, y de acuerdo con la prueba de Tukey no existen diferencias entre los tratamientos térmicos + quitosano al 80%, tratamiento térmico con y sin conservante, dado que se alinean en el mismo grupo (1), mientras que las muestra que no recibieron tratamiento por presentar diferencias significativas se alinean al grupo 2.
Tabla 5: Subconjuntos agrupados en la prueba de Tukey del recuento de hongos y levaduras en los tratamientos de una compota de plátano artesanal.
| Muestra: Compota | Numero de muestra | Subconjunto para alfa = 0,05 | |
|---|---|---|---|
| 1 | 2 | ||
| Tratada térmicamente + quitosano 80% | 5 | 2,00 | |
| Tratada térmicamente + benzoato sódico | 5 | 2,00 | |
| Tratada térmicamente - benzoato sódico | 5 | 314,00 | |
| Sin tratamiento térmico | 5 | 1000,00 | |
| Sig. | 0,148 | 1,000 | |
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.Se utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5,000
Los resultados de la presente investigación acerca del efecto antimicrobiano del quitosano obtenido de la quitina de los cangrejos de los Manglares de Tumbes, exponen que el recuento de hongos y levaduras en las muestras de compotas de plátanos artesanales tratadas con quitosano al 80%, mostraron que del total de muestras analizadas (n= 5), en el 60% no crecieron ni hongos ni levaduras y en el 40% hubo crecimientos de 5 UFC/g de estos microorganismos. Es decir, el quitosano al 80% surte un efecto antimicrobiano en las muestras de compotas procesadas, dado que existe una mayor proporción donde no crecen ni hongos ni levaduras.
En los resultados estadísticos se evidencia un p valor Sig.= 0,000 asociado al coeficiente F= 23,344 de la prueba de análisis de varianza (Anova) en los recuentos de hongos y levaduras en los diferentes tratamientos antimicrobianos en las muestras de compota de plátano artesanal, que por ser mayor al nivel de significancia establecido (p>0,05), indica que existen diferencias entre el valor medio de los diferentes tratamientos en las muestras de compotas artesanales. De esta manera a través de los resultados obtenidos en la prueba de Tukey se verifica que los recuentos de hongos y levaduras en las muestras de compota de plátano artesanal entre los grupos son iguales para las muestras tratadas con quitosano al 80%, sin y con conservante (benzoato sódico), y diferente para las muestras que no recibieron tratamiento. Es decir, en el estudio planteado se verifica que el quitosano tiene un efecto antimicrobiano.
Conclusiones
El quitosano obtenido a partir de la quitina de cangrejos procedentes de los Manglares de Tumbes tiene efecto antimicrobiano en las muestras de compotas procesadas de dos variedades de plátano peruano.
El efecto antimicrobiano contra hongos y levaduras en muestras de compotas procesadas se produce a una concentración óptima de quitosano al 80%.
Se obtuvieron resultados similares al comparar el quitosano de cangrejos al 80% y el conservante benzoato sódico en compotas artesanales de dos especies de plátano peruano.
