Recuperação de oócitos e produção in vitro de embriões de vacas estimuladas com FSH ou ECG

Oocyte recovery and in vitro production from cows stimulated with either FSH or ECG

Ribeiro, L.V.P.^1*, Rigolon, L.P.¹, Cavalieri, F.L.B.², Seko M.B.², Martinez, A.C.¹, Ribeiro, M.G.¹, Martins, R.R.¹, Ávila, M.R.¹ e De Conti, J.B.¹

¹Universidade Estadual de Maringá. Umuarama-Paraná. Brasil. *luvet20@hotmail.com
²Centro Universitário de Maringá. Maringá-Paraná. Brasil.

RESUMO

Avaliou-se a recuperação de oócitos e produção de embriões in vitro de 42 vacas, mestiça Nelore proveniente de grupo genético homogêneo, com idade de 4 a 9 anos, com peso médio de 420 kg, estimuladas com FSH ou eCG. Estas foram distribuídas em três grupos: grupo 1, controle (n=14), apenas OPU, grupo 2, tratadas com 1400 UI de eCG, em dose única seguida de aspiração folicular (OPU) (n= 14); e, grupo 3, tratadas com 120 UI de FSH, administrados com intervalo de 12 horas em quatro doses seguida de OPU (n= 14). Todos os grupos receberam implante auricular contendo 3 mg de Norgestomet no primeiro dia (D0) associado a administração de 2 mg de benzoato de estradiol via intramuscular. No sétimo dia (D7) foram retirados todos os implantes e na sequência foram realizadas as aspirações ovarianas das vacas do grupo 1. O grupo 2 recebeu a aplicação de eCG no quinto dia e a OPU foi realizada no D7. Já o grupo 3 recebeu o tratamento com FSH no quinto e sexto dia, e foram aspiradas em D7. O procedimento de aspiração folicular foi realizado via transvaginal guiada por ultrassom. Foram realizadas 42 aspirações com obtenção de 627 oócitos, sendo 502 viáveis e 125 inviáveis. Realizou-se a maturação e fecundação in vitro. Avaliaram-se as taxas de clivagem, blastocisto e eclosão. Não houve diferenças significativas (p>0,05) nos parâmetros avaliados entre os grupos. Conclui-se que o estímulo ovariano com FSH ou com eCG nas doses utilizadas, foram insuficientes para incrementar o número e a qualidade de oócitos viáveis submetidos a fertilização in vitro para produção de embriões.

Palavras chave: OPU. FIV. Reprodução animal.

SUMMARY

It was evaluated the oocyte and embryo in vitro production of 42 Nellore mixed breed cows (Bos taurus indicus) come from de same genetic group, aging from 4 to 9 years, with mean body weight of 420 kg, stimulated with FSH and eCG. The animals were distributed into three groups: group 1, control (n= 14), only with follicular aspiration (OPU); group 2, treated with 1400 UI of eCG in a single dose plus OPU (n= 14); and group 3, treated with 120 UI of FSH administered four times plus OPU with 12 h of interval (n= 14). All groups received auricular implant with 3 mg of Norgestomet on the first day (D0) associated with 2 mg of estradiol benzoate intramuscularly. At the seventh day (D7) the implants were removed and the ovarian aspirations were realized on the cows of group 1(OPU). Group 2 had the eCG applied at the fifth day and the OPU was performed at D7. The animals from group 3 were treated with FSH at fifth and sixth day and the aspiration occurred at D7 (OPU). The follicular aspiration procedure was done via transvaginal guided with ultrasound. It was performed 42 aspirations obtaining 627 oocytes, where 502 were viable and 125 non-viable. Then, it was realized the in vitro maturation and fecundation. The cleavage, blastocyst and eclosion rate were evaluated. There were no significant difference (p>0.05) at these parameters between the groups. In conclusion, the gonadotrophic stimulation with FSH and eCG, at the doses used in this study, was insufficient to increase the quality of the viable oocytes submitted to in vitro fertilization to produce embryos.

Key words: OPU. FIV. Animal reproduction.

Introdução

A utilização de fármacos na reprodução animal assistida teve significativos progressos na última década, de modo que, atualmente, alguns ainda vêm sendo intensamente testados e diversos outros já são utilizados rotineiramente. Utilizando-se a hormonioterapia é possível incrementar os índices reprodutivos dos rebanhos de corte e de leite, visando o tratamento de afecções ovarianas ou nos programas de inseminação artificial e superestimulação ovariana em animais de elevado valor genético (Kozicki et al., 2005).

Entre as técnicas utilizadas para a coleta de oócitos, a aspiração transvaginal guiada por ultrassom é a que apresenta maior número de embriões produzidos in vitro por doadoras devido a alta repetibilidade, possibilitando maior recuperação de oócitos (Pieterse et al., 1988).

Para Brogliatti e Adams (1996), a superestimulação hormonal aumenta o número de folículos de tamanho adequado para a aspiração e, consequentemente, o número de embriões que podem ser produzidos, devido a maiores taxas de recuperação, porém outros autores utilizando os mesmos tratamentos encontraram respostas diferentes.

Nos últimos anos muitos grupos de pesquisa vêm trabalhando com o intuito de aprimorar a maturação citoplasmática in vitro e, consequentemente, melhorar a capacidade a partir de desenvolvimento embrionário de oócitos provenientes de folículos antrais pequenos. Estudos da regulação da maturação de oócitos são essenciais para a geração de conhecimentos necessários para o aumento dos índices de produção de embriões in vitro.

Hoje a aspiração folicular (OPU), no Brasil, tem sido utilizada com sucesso por instituições dedicadas a pesquisa, assim como pela iniciativa privada na recuperação de oócitos para produção in vitro de embriões bovinos.

O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar oócitos de doadoras Nelore mestiças, verificando o efeito do tratamento estimulatório, com dosagem utilizada em programa de superovulação tradicional, com FSH ou eCG sobre a taxa de recuperação, a produção e a qualidade morfológica de oócitos colhidos por aspiração folicular por via transvaginal, orientada pela ultrassonografia e, a subsequente produção in vitro (PIV) de embriões.

Material e métodos

O experimento foi desenvolvido na Fazenda do CESUMAR (Centro de Ensino Superior de Maringá), no Centro de Biotecnologia em Reprodução Animal, BIOTEC, que dispõe de laboratório de produção in vitro de embriões, localizada no município de Maringá, PR.

Foram utilizadas 42 fêmeas Nelore mestiças, proveniente de um mesmo grupo genético, com idade de 4 a 9 anos, com peso médio de 420 kg. Estas fêmeas foram everminadas com Ivermectina 1% (Ivomec, Merial^®) e passaram por um período de adaptação de 45 dias, permaneceram em pastagem de Cynodon spp. (grama estrela) e tiveram acesso à água e sal mineral ad libitum.

As fêmeas foram separadas aleatoriamente, em três grupos de 14 animais: grupo 1: controle, não receberam tratamento estimulatório, apenas OPU em D7; grupo 2: estimulação com 1400 UI de gonodotrofina coriônica equina (eCG), (Folligon^®, Intervet), via intramuscular, em D5 e OPU em D7; e grupo 3: estimulação com 120 UI de hormônio folículo estimulante (FSH) (Pluset^®, I.F. Serono,Roma, Itália), administrados via intramuscular em 4 aplicações com 12 horas de intervalo (30 UI), iniciando a partir do quinto dia da colocação do implante auricular, seguida de OPU em D7.

Os implantes foram retirados em sete dias, em todos os animais e, em seguida foi realizada uma aspiração nos animais de cada grupo, totalizando 42 OPUs. O detalhamento do esquema de hormonioterapia dos grupos 1, 2 e 3 estão detalhados na figura 1.

O procedimento de aspiração folicular foi realizado com ultrassom Aloka SSD-500, acoplado a um transdutor microconvexo de 5 mHz (UST 974-5), sendo que o mesmo foi adaptado a uma guia de aspiração específica para o sistema reprodutor de bovinos. Uma agulha 20 G (WTA^®) foi conectada ao sistema de aspiração (Cook VBOA 18L) com tubo Falcon de 50 ml. A pressão de vácuo foi obtida com uma bomba Cook V-MAR 5000, ajustada para 38 a 45 mmHg, permitindo um fluxo de 12 ml de meio/minuto.

Para inibir os movimentos peristálticos e desconforto ao animal foi feita uma anestesia epidural sacrococcígea, utilizando-se 100 mg de lidocaína a 2% (Anestésico Pearson^®) e, em seguida, o transdutor foi inserido até o fundo vaginal e, com o auxílio da manipulação transretal, os ovários foram posicionados para obtenção de uma boa visualização dos folículos na tela do ultrassom.

Os folículos a serem aspirados foram posicionados no percurso da linha de punção indicada na tela do ultrassom e quando se aproximou a agulha do folículo a ser aspirado, foi pressionado o pedal da bomba de vácuo e o oócito aspirado, procedimento repetido em todos os folículos acima de 3 mm de cada ovário. O meio utilizado para a aspiração, lavagem da agulha e do tubo Falcon receptor dos oócitos foi composto por uma solução de: 2,0 % de soro fetal bovino (Nutricell), 98,0 % de DMPBSFLUSH (Nutricell) e 25 UI/ ml de heparina sódica (Liquemine^®), evitando a coagulação sanguínea no interior do sistema de aspiração.

O material aspirado foi transferido para o filtro de colheita de embriões (EmCom^®) e lavado com a mesma solução utilizada na aspiração. O sedimento restante no filtro foi observado em placas de Petri e efetuado a busca e contagem dos oócitos com posterior classificação da qualidade. Os oócitos foram quantificados e classificados de acordo com sua morfologia (número de camadas de células do cumulus e aspecto do citoplasma) em qualidade 1, 2 e 3 (cumulus completo, parcial ou expandido, respectivamente), oócitos sem cumullus (s/c) ou desnudos, expandidos (exp), degenerados (deg) ou atrésicos (atr), conforme descrito por Gonçalves et al. (2001). Os oócitos considerados viáveis, qualidade 1, 2 e 3, foram lavados em solução comercial de MIV-T (Nutricell) e transportados para o laboratório, em criotubos (Corning^®), contendo meio de maturação em banho-maria a 35^oC.

Os oócitos maturados foram lavados três vezes em 100 µl de meio TALP-FIV suplementado com 10 µg/ml de heparina, 22 µl/ml de piruvato, 50 µg/ml de gentamicina, albumina sérica bovina-BSA (sem ácidos graxos), solução de PHE (2 µM de penicilina, 1 µM de hipotaurina e 0,25 µM de epinefrina). O sêmen utilizado foi de uma mesma partida de um touro da raça Nelore, descongelado em banho-maria a 35^oC. Para seleção dos espermatozoides móveis e remoção de diluidores e plasma seminal, foi realizado centrifugação em gradiente percoll 90% e 45%, a 1200 rotações por minuto, durante 20 minutos. Foi utilizada a concentração de 2 x 106 espermatozoides/ml e estes foram transferidos para microgotas com 20 oócitos/gota juntamente com COCs, onde permaneceram por 18 horas, a 38,5^oC, em atmosfera com 5% de CO₂ em ar.

Após a fecundação, os zigotos foram cultivados in vitro no meio SOF suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), com monocamada de células da granulosa. O cultivo foi realizado por 18 horas pósinseminação, em incubadora, com atmosfera gasosa contendo 5% de CO₂, em ar com máxima umidade. Decorridas 48 horas, foi avaliada a taxa de clivagem e feito a renovação do meio de cultivo. Sete dias após a fecundação foram realizadas as avaliações dos embriões de cada grupo, classificando-os em blastocisto inicial, blastocisto, blastocisto expandido ou blastocisto eclodido, conforme classificação recomendada pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS).

Os dados foram analisados no software SAS Versão 8. A diferença entre os grupos no número de oócitos viáveis, inviáveis, clivados, embriões ou embriões eclodidos foram analisados por análise de variância (PROC GLM) e as diferenças entre médias pelo teste Tukey.

Resultados e discussão

Para a recuperação de oócitos dos animais dos três tratamentos foram realizadas 42 aspirações foliculares (OPU) em que foram obtidos 627 oócitos, sendo 502 viáveis e 125 inviáveis.

Na tabela I, estão descritos os resultados da aplicação do eCG ou do FSH sobre a qualidade dos oócitos viáveis.

Observou-se que não houve efeito (p>0,05), dos tratamentos com eCG ou FSH no número de oócitos viáveis com relação ao grupo controle. O número de oócitos viáveis é de importância fundamental em programas de fertilização in vitro (FIV). O fato de não haver diferença significativa entre as quantidades de oócitos morfologicamente viáveis, pode indicar que a sincronização da onda folicular permitiu que todos os oócitos estivessem na mesma fase fisiológica, não havendo diferença entre os estimulados ou não.

Neste trabalho utilizou-se a préestimulação com FSH ou eCG, após sincronização das ondas foliculares com implante auricular de Norgestomet e aplicação intramuscular de 2 mg de benzoato de estradiol, com intuito de minimizar o efeito de algum folículo dominante (Bó et al., 1995), que resultou em uma média de 10,35 7,27 oócitos viáveis com FSH, de 16,38 15,21, com eCG e de 10,50 11,56 no grupo controle. As diferenças nos resultados encontrados neste trabalho não foram significativas (p>0,05).

Sendag et al. (2008) encontraram melhores resultados utilizando 500 UI de FSH comparando com a aplicação de 3000UI de eCG, em vacas Holandesas. No trabalho os autores sugerem que a resposta ovariana, o número de folículo nos ovários e número oócitos, além de sua qualidade são afetados pelo tipo de gonadotrofina aplicada, sendo o FSH a melhor alternativa para OPU em relação ao eCG. Merton et al. (2003) também encontraram um efeito positivo na préestimulação ovariana com FSH, antes da OPU e, em relação a competência de desenvolvimento dos oócitos. O esquema de superovulação varia em relação à quantidade a ser aplicada, o número de aplicações realizadas e o intervalo entre a última aplicação de FSH e a aspiração. Nibart et al. (1995) indicam que a recuperação de oócitos viáveis pode dobrar com a utilização da superestimulação com FSH. Uma das possíveis explicações para o bom resultado da pré-estimulação ovariana com FSH seria um aumento no número de folículos médios e grandes, impedindo os mesmos de entrarem em atresia, isto poderia resultar em oócitos mais capacitados para sofrerem a maturação in vitro. Stubbings e Walton (1995) relatam que o pré-tratamento com FSH resulta numa resposta ovariana imediata, produzindo um maior número de folículos para aspiração na primeira semana de tratamento, comparando com animais não estimulados hormonalmente.

Rouillier et al. (1996); Goodhand et al. (1999); Roover et al. (2005) comentam que o tratamento com FSH supera os resultados obtidos nos tratamento como eCG, sendo para estes autores o método de escolha para superovulação de bovinos. Na maioria dos estudos comparando os dois procedimentos, o tratamento com FSH resultou em leve aumento de número de embriões utilizáveis.

Wang et al. (1988) relataram que o número total de oócitos aumenta com a utilização de eCG, mas o número e percentual de clivagem diminui com altas doses de eCG. Entretanto, esses efeitos negativos não foram observados com doses crescentes de um extrato de pituitária suína altamente purificada (FSH) (Abdul et al., 1989). A dose total de eCG e a sua origem ou método de purificação, são fatores que podem ter contribuído para essas diferenças. Pieterse e Kappen (1992) utilizando um tratamento com eCG em 10 vacas, obtiveram resultados positivos em comparação aos animais não tratados.

Na tabela III, está descrito os resultados médios da aplicação do eCG ou do FSH sobre a produção de embriões in vitro a partir de oócitos aspirados de vacas Nelore mestiças.

Ramos et al. (2006) avaliaram os efeitos de dois protocolos de punção folicular na quantidade/qualidade dos oócitos e na produção de embriões in vitro, em vacas da raça Gir, não lactantes, sendo um grupo sem estimulação hormonal e outro com aplicação de 250 UI de FSH em doses decrescentes. Encontraram taxa de clivagem de 56% e de blastocisto de 18%, tendo a pré-estimulação ovariana melhorado a qualidade e a taxa de clivagem dos oócitos recuperados por punção folicular. Goodhand et al. (1996) verificaram que o FSH em doses múltiplas e aspiração de animais estimulados uma vez por semana têm sido mais eficientes que uma só administração. Entretanto Monteiro et al. (2009) utilizaram vacas controle, préestimuladas com FSH e OPU 6 horas após e, pré-estimuladas com FSH e OPU 48 após, não tendo ocorrido qualquer diferença. As taxas de clivagem e de blastocisto foram semelhantes entre os três tratamentos, sendo 77,4% e 42,70%, 75,54% e 31,65%, 63,52% e 33,33%, respectivamente, contudo a taxa de blastocistos eclodidos foi superior nos controles (30,27%) em relação aos demais. No trabalho em questão obteve-se resultado semelhante comparando o grupo controle (sem estimulação) e o grupo 3 (tratado com FSH), já que as taxas de clivagem, de blastocisto e de eclosão de todos os grupos foram semelhantes. Satrapa et al. (2005) notaram que a superestimulação ovariana com OPU 48 horas após a última aplicação de FSH não aumentou a produção in vitro de embriões de vacas da raça Nelore, além de as maiores taxas de blastocisto eclodido foram observadas em oócitos provenientes de vacas que não foram superestimuladas. Já, Nonato et al. (2005) observaram que a administração prévia de FSH na aspiração folicular não aumentou a média de oócitos obtidos, porém, aumentou a taxa de produção embrionária, o que é benéfico para a tecnologia de produção de embriões in vitro, discordando dos resultados encontrados no trabalho aqui desenvolvido.

Chaubal et al. (2007) administraram FSH em dose única e múltiplas na estimulação ovariana antes da OPU e, notaram que a administração de FSH em três aplicações no período de 24 horas aumentou, significativamente, a resposta folicular e a recuperação de oócitos em vacas.

No presente trabalho foi observada elevada variação na quantidade de oócitos, sendo que no controle foi de 1 a 43, nos pré estimulados com FSH de 2 a 27 e nos préestimulados com eCG de 2 a 49, o que evidencia diferenças no potencial de vacas utilizadas como doadoras de oócitos. Tal fato torna necessária a avaliação prévia do animal antes de sua utilização em programas comerciais de produção de embriões in vitro e as razões para essa variabilidade ainda são pouco compreendidas (Ramos, 2006).

Considerando as informações concluise que pesquisas de ordem técnica e biológica poderiam contribuir para o incremento da OPU, aumentando a eficiência do procedimento e disponibilizando mais oócitos para os procedimentos de produção in vitro de embriões.

O resultado na recuperação de oócitos após aspiração folicular está condicionado a fatores ainda não totalmente compreendidos, portanto há interesse em realizar estudos tendendo a encontrar condições ótimas para cada situação.

Conclusões

O estímulo ovariano com 120 UI de FSH por animal ou com 1400 UI de eCG foi insuficiente para incrementar o número e a qualidade de oócitos viáveis na aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassom, não resultando em melhoria na produção de embriões in vitro.

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Recibido: 15-10-09 ]]> Aceptado: 23-9-10.