Bases moleculares de resistencia de Mycobacterium tuberculosis
E. Quirós-Roldán, M. Airoldi, F. Moretti, G. Carosi.
**Istituto di Malattie Infettive e Tropicali. Università di Brescia (Italia)
Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis, resistencia, genotipo.
Key words: Mycobacterium tuberculosis, resistance, genotype.
Correspondencia: Eugenia Quirós-Roldan
Istituto di Malattie Infettive e Tropicali
Ospedali Civili, Pzle Spedali Civili, 1
Brescia 25125 (Italy)
M. tuberculosis infecta únicamente a la especie humana y aunque se estima que un tercio de la población mundial ha tenido contacto con esta bacteria, sólo una baja proporción de las personas infectadas desarrollan la enfermedad. Según la O.M.S. se producen 8 millones de nuevas infecciones y 3 millones de muertos por esta infección al año, lo que supone un gran problema de salud mundial1. En la actualidad el 95% de los casos de tuberculosis se produce en los países subdesarrollados o en vía de desarrollo, aunque desde el inicio de los años 80 se ha observado un incremento en los países industrializados donde la enfermedad se consideraba controlada y en vía de erradicación2. El frecuente retraso diagnóstico y terapéutico, la necesidad de largos periodos de tratamiento que frecuentemente ocasionan el abandono y el incremento de cepas resistentes a uno o más de los fármacos usados en el tratamiento condicionan el continuo aumento de la infección manteniéndola un tema de actualidad.
Aunque el concepto de resistencia antibiótica básicamente se asocia a una característica fenotípica (incapacidad de crecimiento en presencia de un antibioterápico), la dificultad técnica que presenta la prueba fenotípica en el caso de algunos virus (VIH), la carencia de una línea celular de propagación en el caso de otros (VHB) o la lentitud de crecimiento en cultivo de determinadas bacterias (M. Tuberculosis) ha provocado desde el inicio de los años 90 el desarrollo de técnicas que permiten la detección de los genes o secuencias específicas que codifican la resistencia. ]]>
M. tuberculosis es una bacteria fisiológicamente resistente a la mayoría de los antibióticos debido fundamentalmente a la típica estructura lipídica de su pared celular (> 60%) que actúa como barrera permeable únicamente a solutos hidrofílicos. Los compuestos hidrofílicos atraviesan lentamente la pared celular debido al escaso número de porinas, a la escasa fluidez de los ácidos micólicos y al espesor total de la pared de M. Tuberculosis3. Las moléculas activas contra M. Tuberculosis se dividen en fármacos de primera y segunda elección según la mayor o menor eficacia. La resistencia a los fármacos antituberculares se produce como consecuencia de la aparición de mutaciones espontáneas en el interior de su genoma (no se han descrito plásmidos codificantes de resistencia como en otras bacterias) independientemente de la exposición a la terapia y suelen codificar resistencia a un solo fármaco (no existe resistencia cruzada).
Los bacilos resistentes generados durante el proceso replicativo de M. Tuberculosis conviven con una población de bacilos sensibles que vienen eliminados mediante la terapia, dando como resultado la selección de cepas resistentes. Por este motivo el tratamiento de la infección tubercular (como la infección de VIH) se basa en la asociación de un determinado número de fármacos con mecanismos de acción diferentes para evitar la aparición de resistencias. La frecuencia de aparición de mutantes resistentes varia dependiendo del fármaco: 10-6 para la isoniazida, estreptomicina y etambutol y 10-8 para la rifampicina4.
1. Resistencia a la isoniácida
La isoniácida fue descubierta en 1912 pero su uso como fármaco antitubercular no se inicio hasta el año 1952. Posee una potente acción bactericida y actúa únicamente contra bacterias en fase de replicación activa. Su mecanismo de acción es desconocido aunque parece estar mediado por la enzima catalasa-peroxidasa de M. Tuberculosis que lo transforma en el principio activo, el cual es el responsable de la alteración de la síntesis del ácido micólico. La resistencia de M. Tuberculosis a la isoniácida se relacionó hace ya algunos años a la reducción o carencia de la actividad catalasa5 y posteriormente con determinados cambios genéticos (mutaciones o delecciones) en el gen katG, el cual codifica el enzima catalasa-peroxidasa y probablemente impiden la transformación del fármaco en su principio activo6,7. De hecho más del 60% de cepas de M. tuberculosis resistentes a la isoniácida presentan mutaciones en este gen8.
]]>
Más recientemente se ha descrito una mutación en cepas isoniácida resistentes (con alteraciones genéticas en katG en el promotor ahpC, el gen que codifica la alkil hidroperóxido-reductasa C que parece «compensar» el defecto de la actividad catalasa peroxidasa y teóricamente restituye la sensibilidad a la isoniácida (mutación compensatoria)9.
Otra mutación, esta vez localizada en el gen inhA que codifica la síntesis de la proteina inhA implicada en la producción de los ácidos grasos de la micobacteria (diana de la isoniácida activada) también es responsable de un porcentaje de cepas resistentes a isoniácida10,11.
Finalmente, debido a que un 15-25% de cepas M. tuberculosis resistentes a la isoniácida poseen el genotipo salvaje tanto en el gen katG como inhA (no presentan mutaciones) se piensa que debe existir otro mecanismo de resistencia responsable de estos casos. Un estudio reciente parece demostrar que el objetivo de la isoniácida es la proteina kasA, la cual está implicada en el mecanismo de elongación de los ácidos grasos y en un 15% de cepas resistentes a la isoniácida se han encontrado mutaciones en el locus kasA12.
2. Resistencia a estreptomicina
La estreptomicina fue descubierta en 1943 y fue la primera sustancia con probada actividad antitubercular usada en el tratamiento de la tuberculosis. Al contrario de los otros fármacos antituberculares de primera línea, la estreptomicina posee un amplio espectro de actividad antimicrobiana y el efecto contra M. tuberculosis se limita a la forma extracelular. ]]>
El mecanismo de acción de la estreptomicina es similar al de los otros aminoglucósidos, uniéndose al fragmento 16S del ARN ribosomial (rARN) provoca la inhibición de la síntesis proteica. La resistencia a este fármaco con actividad antitubercular se asocia a mutaciones en el gen rrs que codifica la síntesis del fragmento 16S del rARN y en el gen rpsL que codifica el fragmento 12S13,14. El desarrollo de resistencia a la estreptomicina es más eficaz en el caso de mutaciones en el gen rrs de M. tuberculosis que en el caso de otras eubacterias debido a que las micobacterias poseen una única copia de dicho gen en comparación con ls múltiples copias de otros microorganismos.
En el 30% de cepas de M. tuberculosis estreptomicina resistentes no se han encontrado mutaciones presentes en estos genes y se cree que existe otro mecanismo de resistencia diferente15. El mecanismo de resistencia en estas cepas es desconocido, pero debido a que presentan un bajo grado de resistencia se ha hipotizado que puede estar relacionado con mecanismos de permeabilidad de la pared y membrana bacteriana.
3. Resistencia a etambutol
Este fármaco se sintetizó por primera vez en 1961, tiene actividad bacteriostática y es activo únicamente en bacterias en fase de multiplicación activa. Su mecanismo de acción no está claro y se ha relacionado con la interferencia del metabolismo del rARN, la síntesis de fosfolípidos, la síntesis del ácido micólico, y la síntesis de polisacáridos de la pared celular16-19.
]]>
La resistencia a etambutol recientemente se ha asociado a una sola mutación en el gen embB, que codifica la síntesis de la enzima arabinosiltransferasa, relacionada con la síntesis de polímeros de arabinosa y galactosa de la pared celular y probablemente la verdadera diana del etambutol20.
4. Resistencia a rifampicina
La rifampicina se usa en el tratamiento antituberculoso desde el inicio de los años 70. El fármaco se une a la ARN polimerasa e interfiere con la síntesis del ácido nucleico en el proceso de replicación bacteriana. La resistencia a la rifampicina se asocia a determinadas mutaciones en una región de 81 bp del gen rpoB que codifica la subunidad beta de la ARN polimerasa21. En el 97% de cepas de M. tuberculosis rifampicina resistentes se han detectado mutaciones en este gen.
La rifabutina aunque comparte el mecanismo de acción de la rifampicina, posee actividad in vitro contra más del 10% de cepas de M. tuberculosis rifampicina resistentes22.
]]>
5. Resistencia a piracinamida
Es un derivado de la nicotinamida (sintetizado en 1952) y es inactivo contra las formas replicativas de M. Tuberculosis. In vitro es activo únicamente a pH ácido, y in vivo el fármaco es transformado en ácido piracinoico (principio activo) mediante el enzima piracinaminidasa. El pH ácido provocado por el ácido piracinoico parece ser el responsable del efecto contra M. Tuberculosis. El bajo nivel de actividad piracinaminidasa en las cepas de M. Tuberculosis resistentes a la piracinamida sugieren que este enzima está relacionado con el mecanismo de resistencia23. Esta hipótesis ha sido confirmada recientemente con la detección en más del 80% de cepas resistentes a este fármaco de mutaciones en el gen pncA que codifica la piracinaminidasa24,25.
6. Resistencia a quinolónicos
Las quinolonas se consideran fármacos de segunda línea en el tratamiento antituberculoso, aunque el incremento de la resistencia a los fármacos de primera línea ha aumentado su uso en el caso de cepas resistentes. El fármaco se une al enzima ADN-girasa inhibiendo la síntesis de ADN. La resistencia a las quinolonas en el curso de tratamiento aparece con una frecuencia de 107-108 y se asocia a mutaciones puntuales en el gen gyrA el cual codifica la enzima26.
]]>
7. Multiresistencia
La búsqueda de un mecanismo responsable de la multiresistencia de M. Tuberculosis no ha sido fructífero y la única explicación está relacionada con la acumulación de mutaciones adquiridas en el genoma bacteriano. Actualmente la resistencia a la rifampicina se considera como un marcador de multiresistencia ya que la resistencia a este fármaco raramente se presenta sola y frecuentemente viene asociada a resistencia a la isoniácida.
Las alteraciones genéticas no siempre son detectadas en cepas consideradas como resistentes con los métodos convencionales (antibiograma), por lo que se supone que deben existir mutaciones todavía no identificadas en el genoma micobacteriano responsables de dicho fenotipo.
Métodos genotípicos para la detección de resistencia a la terapia antituberculosa
La identificación de alteraciones concretas en el genoma de M. tuberculosis relacionadas con la reducción en sensibilidad a la terapia antitubercular ha condicionado el desarrollo de diferentes técnicas genéticas para permitir su rápida identificación. El primer paso es común a todas estas técnicas y consiste en la destrucción de la pared bacteriana y la amplificación genética (PCR) de la región que contiene la/s mutación/es conocidas responsables de la resistencia. ]]>
En un segundo lugar el análisis de estos fragmentos se puede realizar con diversos métodos: a) secuenciamiento; es la más exacta, ya que permite la identificación concreta de las mutaciones; b) SSCP o single strand conformational polymorphism analysis, con una sensibilidad del 87% para la resistencia a la isoniácida y un 96% para la resistencia a la rifampicina; c) migración de heteroduplex, en la cual se compara la mobilidad en geles de electroforesis de heteroduplex formados con la cepa problema y una sensible. d) RFLP o retriction fragment lenght polymorphism, técnica ampliamente usada en estudios epidemiológicos27.
La única técnica disponible actualmente en comercio se basa en la hibridación del material amplificado con sondas específicas inmovilizadas en tiras de nitrocelulosa, capaces de identificar las mutaciones codificantes de resistencia y hasta el momento sólo identifican la resistencia a la rifampicina (LiPA Rif TB, Innogenetic, Belgium)28.
El diagnóstico genético de la resistencia antibiótica de M. Tuberculosis permite abreviar el tiempo necesario requerido por los métodos convencionales, sin embargo a pesar del enorme progreso realizado en los últimos años, existen todavía diversos problemas que limitan su uso cotidiano en el laboratorio. De una parte estas técnicas reconocen el cepo mutado cuando éste representa >10-15% de la población total con lo que presentan una baja sensibilidad y de otra parte no se han identificado todavía todos los "marcadores genéticos" responsables de la resistencia. A pesar de estos problemas, junto al costo y a la necesidad de un laboratorio especializado, los resultados obtenidos hasta ahora y los avances en el diagnóstico genético de la farmacoresistencia conseguidos en el campo de la infección de VIH y VHB prometen que en un futuro no muy lejano se utilicen de forma cotidiana también en el laboratorio de micobacterias.
Bibliografía
1. Fountan FF. Tuberculosis update. J Infect Dis 2001; 94: 117 [ Links ]
2. Culligan T. Drug-resistant tuberculosis: desperate measures?. J Infect Dis 2001; 357: 1124. [ Links ]
3. Rinder H, Mieskes KT, Loscher T. Heteroresistance in M. Tuberculosis. J Infect Dis 2001; 5: 339-345. [ Links ]
4. David HL. Probability distribution of drug-resistant mutans in unselected populations of M. Tuberculosis. Appl Microbiol 1970; 20: 810-814. [ Links ]
5. Devi G, Shaila M, Ramakrishnan T, Gopinathan K. The purification and properties of peroxidase in M. Tuberculosis and itd possible role in the mechanism of action of isonicotinic acid hidrazide. Biochem J 1985; 149: 187-197. [ Links ]
6. Heym B, Zhang Y, Poulet S, Young D, Cole ST. Characterization of the katG gene encoding a catalase-peroxidase required for the soniazid susceptibility of M. Tuberculosis. J Bacteriol 1993; 175: 4255-4259. [ Links ]
7. Zhang Y, Heym B, Allen B, Young D, Cole ST. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of M. Tuberculosis. Nature 1992; 358: 591-593. [ Links ]
8. Cole ST, Telenti A. Drug resistance in M. Tuberculosis. Eur Respir J 1995; 8: S701-S713. [ Links ]
9. Kelley CL, Rouse D, Morris SL. Analysis of ahpC gene mutations in isoniazid-resistant clinical isolates of M. Tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 2057-2058. [ Links ]
10. Banerjee A, Dubnau E, Qhemard A y cols. InhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in M. Tuberculosis. Science 1994; 263: 227-230. [ Links ]
11. Winder FG. Mode of action of antimicrobial agents and associated aspects of the mplecular biology of the micobacteria. In: The biology of the micobacteria. Ed. Ratledge C, Stanford J. Vol 1. Academic Press. London 1982, 353-438. [ Links ]
12. Mdluli K, Slayden RA, Zhu Y y cols. Inhibition Of a M. Tuberculosis b-ketoacyl ACP synthase by isoniazid. Science 1998; 280: 1607-1610. [ Links ]
13. Finken M, Kirsch ner P, Meier A, Wrede A, Bottger EC. Molecular basis of streptomycin resistance in M. Tuberculosis: alterations of the ribosomal protein S12 gene and point mutations within a functional 16S ribosomal RNA pseudoknot 1993; 9: 1239-1246.
14. Meiner A, Kirschner P, Bange F, Vogel U, Bottger E. Genetic alterations in streptomycin-resistant M. Tuberculosis. Mapping of mutations conferring resistance. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 228-233. [ Links ]
15. Honore N, Cole S. Streptomycin resistance in micobacteria. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 238-242. [ Links ]
16. Cheema S, Astora S, Khuller G. Ethambutol induced leakage of phospholipids in M smegmatis. IRCS Med Sci 1985; 13: 843-844. [ Links ]
17. Silve G, Valero-Guillen P, Quemard A y cols. Ethambutol inhibition of glucose metabolism in micobacteria. A possible target of the drug. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 1536-1538. [ Links ]
18. Lety M, Nair S, Berche P, Escuyer V. A single point mutation in the embB gene is responsible for resistance to ethambutol in M smegmatis. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 2629-2633. [ Links ]
19. Takayama K, Armstrong E, Kunugi K, Kilburn J. Inhibition by ethambutol of mycolic acid transfer into the cell wall of M; stegmatis. Antimicrob Agents Chemother 1979; 16: 240-242. [ Links ]
20. Sreevatsan S, Stockbauer K, Pan X y cols. Ethambutol resistance in M. Tuberculosis: critical role of embB mutations. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 1677-1681. [ Links ]
21. Telenti A, Imboden P, Marchesi F y cols. Detection of rifampicin-resistance mutations in M. Tuberculosis. Lancet 1993; 341: 647-650. [ Links ]
22. Bodmer T, Zucher G, Imboden P, Telenti A. Mutation position and type of substitution in the b-subunit of the RNA polymerase influence in vitro activity of rifamycin and rifampicin resistant M. Tuberculosis. J Antimicrob Chemother 1995; 35: 345-348. [ Links ]
23. Butler W, Kilburn J. Susceptibility of M. Tuberculosis to pyrazinamide and its relationship tp pyrazinamidase activity. Antimicrob Agents Chemother 1983; 24: 600-601. [ Links ]
24. Sreevatsan S, Pan X, Zhang Y, Kreiswirth B, Musser JM. Mutations associated with pyrazinamide resistance in pncA of M. Tuberculosis complex organism. Antimicrob Agents Chemother 1997; 42: 636-640. [ Links ]
25. Scorpio A, Lindholm-Levy P, Heifets L y cols. Characterization of pncA mutations in pyrazinamide-resistant M. Tuberculosis . Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 540-543. [ Links ]
26. Takiff H, Salazar L, Gurrero C y cols. Cloning and nucleotide sequence of M. Tuberculosis gyrA and gyrB genes and detection of quinolone resistance mutations. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 773-780. [ Links ]
27. Felmlee TA, Liu Q, Whelen AC y cols. Genotypic detection of M. Tuberculosis rifampin resistance: comparison of single-strand conformation polymorphism and dideoxy fingerprinting. J Clin Microbiol 1995; 33: 1617-1623. [ Links ]
28. Gamboa F, Cardona P, Manterola J y cols. Evaluation of a commercial probe assay for detection of rifampin resistance in M. Tuberculosis directly from respiratory and nonrespiratory clinical samples. Eur J Clin Microbiol Infet Dis 1998; 17: 189-192. [ Links ] ]]>