Alfredo Santana1, Casimira Domínguez2, Angelines Lemes3, Teresa Molero3, Eduardo Salido1.
Unidad de Investigación Hospital Universitario de Canarias/ Facultad de Medicina Universidad de La Laguna (1);
Servicio de Análisis Clínicos (2) y de Hematología y Hemoterapia (3) / Hospital de Gran Canaria Dr Negrín.
Palabras clave: Retrovirus; SIDA; biología molecular.
Key Words: Retrovirus; AIDS; molecular biology.
Recibido: 27-VII-02
Aceptado: 23-XII-02
Correspondencia: Alfredo Santana ]]>
Hospital Universitario de Canarias. La Cuesta. 35320-Sta Cruz de Tenerife
sanrod@teleline.es
Introducción.
El VIH es un retrovirus perteneciente a la subfamilia de los lentivirus. El estudio de éstos, se ha visto notablemente incrementado después del descubrimiento del VIH 1, 2. Los lentivirus son retrovirus exógenos no oncogénicos que causan infecciones persistentes, dando lugar a enfermedades con largos periodos de incubación. El prefijo lenti- hace mención, precisamente, a la capacidad de estos virus para instalarse en el organismo infectado durante amplios periodos de tiempo. Normalmente infectan células del sistema inmune (macrófagos, células T) y causan en ellas efectos citopáticos. Una característica importante, carente en otros retrovirus, es su habilidad para infectar a células quiescentes.
Comparado con otros virus, los lentivirus tienen un genoma de Acido Ribonucleico (ARN) más extenso, en torno a las 10 Kilobases (Kb). Su propiedad más relevante estriba en la capacidad de codificar genes esenciales que permiten la regulación de su propia expresión en la célula infectada.
La replicación de los lentivirus es, en general, tóxica para la célula conduciendo a su disfunción y posterior muerte.
Muchas de las propiedades estructurales y funcionales del VIH son comunes a todos los retrovirus. Por ello, la intensa investigación desarrollada en el campo de los retrovirus ha permitido profundizar y conocer muchos aspectos inéditos de la biología molecular del VIH.
Estructura.
El VIH consta de una bicapa lipídica externa, como envoltura, donde se han encontrado diferentes proteínas membranales del huésped, además de glicoproteínas virales asociadas en trímeros o tetrámeros (Figura 1). La glicoproteína de superficie gp120 3 está unida de forma no covalente a la también glicoproteína transmembranal gp41; estos oligómeros son fundamentales para la actividad biológica del virión ya que aportan el sitio de interacción y fusión con las células blanco, además de aumentar el tamaño del virus hasta en 10 nanómetros (nm) siendo, por tanto, fácilmente identificables por microscopía electrónica. Las partículas virales maduras miden entre los 100 y 130 nm de diámetro, mientras que las inmaduras están entre los 120 y 140 nm 4.
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Por debajo de la envoltura, la proteína miristilada MA (p17) forma la matriz viral de estructura icosaédrica. En el centro, se encuentra la cápside que asemeja a un cono y está constituida por la proteína viral más abundante en la partícula, CA (p24). A excepción de los desoxirribonucleótidos, dentro del cono se encuentra todo el material necesario para armar el provirus: las proteínas virales PR (p15), RT (p55 y p66), IN (p11), NC (p17), Ll (p6), más las dos cadenas idénticas de ARN y un par de iniciadores de ARN transferente (ARNtLys). El VIH, como cualquier otro retrovirus, posee un genoma de ARN de cadena simple (ss) que depende de una sola enzima, la retrotrancriptasa, para convertir su ARN genómico en ADN (provirus) que es posteriormente integrado en el genoma celular. Este provirus posee aproximadamente 9.8 Kb de longitud 5.
Al igual que el resto de retrovirus, en su genoma encontramos tres regiones codificantes, gag, pol y env, que codifican las proteínas de la cápside (Gag), las enzimas necesarias para la replicación (Pol) y la glicoproteína externa (Env), responsable de la infectividad de la partícula viral a través de la unión a receptores específicos de la célula. Las enzimas virales codificadas por pol son la transcriptasa inversa (RT), la integrasa (IN) y la proteasa (PR). Como la mayoría de los retrovirus, el VIH posee un promotor y un sitio de poliadenilación dentro de la región larga terminal (LTR) y expresa un solo transcrito primario.
Las proteínas adicionales expresadas por el VIH son parte de la partícula viral (Vif, Vpr, Vpx), regulan directamente la expresión génica viral (Tat, Rev) o interactúan con la maquinaria celular para facilitar la propagación del virus (Vpu, Nef). Estas proteínas adicionales incrementan la complejidad de la organización y expresión del VIH. Se ha propuesto que los lentivirus deben incluirse en un subgrupo de los retrovirus denominado retrovirus complejos 6, 7. La característica distintiva de este subgrupo es la habilidad para regular su propia expresión vía factores proteicos codificados por el virus. Es esta propiedad la que permite a los virus que la poseen, como el VIH, permanecer durante largos periodos en la célula infectada, generando con ello infecciones crónicas activas.
Ciclo vital del VIH.
Generalidades.
El ciclo vital del VIH sigue, en general, las pautas del resto de retrovirus (Figura 2). Después de que el virus alcanza la célula diana y logra penetrar a través de la membrana plasmática, la RT convierte el ARN viral en ADN. El ADN retrotranscrito es transportado al núcleo e integrado al ADN celular, proceso mediado por la enzima IN. Debido a las características de replicación de los retrovirus, el ADN proviral está flanqueado por las regiones LTR (long terminal repeats), con importantes funciones reguladoras.
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Después de la integración, el ADN retroviral (provirus) usa la maquinaria celular para expresar el ARN viral. El ARN genómico, junto a las proteínas virales, son ensamblados en la partícula viral, que sale de la célula e infecta nuevas células mediante la unión a receptores celulares específicos.
Penetración del virus.
Comienza cuando la proteína Env del VIH se une al receptor de superficie CD4, un miembro de las inmunoglobulinas 8-11. Este receptor se encuentra en los linfocitos T, monocitos, linfocitos B y otras células 12. Aunque CD4 es el receptor primario, se han descrito receptores alternativos para la penetración del VIH en células CD4(-) como, por ejemplo, el esfingolípido galactósido ceramida 13.
El CD4 es una glicoproteína transmembrana de 58 KiloDalton (KDa), siendo la región comprendida entre los aminoácidos 400-430 14,15 la que define el sitio de unión con la proteína viral Env. La interacción de CD4 con Env es de vital importancia para el VIH, permitiendo la infección y disregulación de CD4. Esto afecta la función de las células T y eventualmente permite la depleción de las células T CD4(+) causando inmunodeficiencia en los pacientes infectados.
Los mecanismos post-unión requeridos para la fusión entre VIH y la membrana celular no son bien conocidos. El VIH, como otros retrovirus, infecta a las células de forma pH-independiente, a través de la fusión directa entre las membranas viral y celular 16-18. Se piensa que el proceso es conducido inicialmente a través de cambios conformacionales en Env, justo después de la unión a CD4, los cuales hacen exponer dominios de fusión, localizados en la región hidrofóbica N-terminal de la subunidad transmembrana de Env 19-21.
En la superficie celular humana existen otras moléculas que, junto a CD4, y actuando como cofactores, son cruciales para la eficaz entrada de VIH; destacan el receptor fusina-CCR5 o el receptor para quimiocinas CKR5 22-26.
Síntesis del Provirus.
Después de la penetración del virus, la cápside se desestructura y la RT viral es activada. Existen evidencias experimentales que sugieren el posible comienzo de la retrotranscripción del VIH incluso dentro del virión 27-28. Un complejo ribonucleoproteico (RNP) conocido como "complejo de preintegración" se estructura en el citoplasma de la célula infectada y es responsable de la transcripción reversa y del transporte al núcleo. El RNP contiene al ARN genómico junto a las proteína NC y MA así como las enzimas virales RT e IN 29. ]]> Durante la retrotranscripción, las dos moléculas de ARN del virión son convertidas a una doble cadena lineal de ADN 30.
Transporte nuclear e Integración.
El ADN proviral de doble cadena unido a proteínas es transportado al núcleo de la célula infectada. La cuestión de cómo el complejo de preintegración es transportado desde la membrana plasmática a la membrana nuclear no está del todo claro. Se especula con la posibilidad de que Vif esté implicada en el proceso teniendo en cuenta que la proteína es empaquetada en las partículas virales de VIH asociada al core viral 31. Por otra parte, Vif tiene la habilidad de asociarse con filamentos intermedios como la vimentina que conecta las membranas nucleares y plasmáticas 32. Por ello, parece probable que Vif actúe como puente de unión entre el complejo de preintegración y las moléculas motoras de los microtúbulos celulares para el transporte activo hacia el núcleo.
A diferencia de los oncoretrovirus, VIH puede entrar en el núcleo de células quiescentes como los macrófagos diferenciados. Las tres proteínas virales más importantes en el proceso de translocación nuclear son MA, IN y Vpr 33-37. Uno de los primeros pasos en la importación nuclear del complejo es el reconocimiento de señales de localización nuclear (NLS) presentes en el complejo de preintegración. El proceso en cuestión está mediado por un complejo proteico heterodimérico compuesto por Importina-a (Imp-a) e Importina-b (Imp-b). Imp-a une las NLS mientras que Imp-b media la translocación a través del poro nuclear 38. Tanto MA como IN portan secuencias NLS y se sabe que interaccionan con miembros de las Importinas 39-41.
El ADN del VIH es integrado en el genoma celular a través de la acción de la IN viral en sitios localizados al azar, aunque se han descrito regiones de alta probabilidad de integración 42,43.
Se sabe que el ADN viral lineal es el sustrato directo para la integración 44-46 siendo inviable la integración de formas circularizadas. El provirus integrado es homólogo al ADN viral excepto que se eliminan algunos nucleótidos de cada extremo además de la presencia, en ellos, de cortas repeticiones procedentes del genoma del huésped 47. La integración requiere que IN reconozca los extremos del ADN viral (los sitios att). La IN cataliza la eliminación de dos pares de bases de los extremos 3´ de cada cadena de ADN viral exponiendo un dinucleótido CA, muy conservado entre todos los retrovirus 47. Este ADN viral procesado es unido entonces a los extremos 5´ del ADN celular, previamente cortados, a través de una reacción de transesterificación 48. Las enzimas celulares reparan entonces las uniones generando las repeticiones cortas que flanquean las secuencias virales.
La proteína Nef está implicada en la regulación de la infectividad viral 49,50. De hecho, hay similitudes considerables entre los fenotipos derivados de defectos en Vif y en Nef. Para ambas proteínas, los defectos se manifiestan en un paso muy temprano del ciclo viral y se caracterizan por niveles reducidos en la síntesis de ADNc 51.
Expresión génica.
El provirus integrado y flanqueado por los LTR´s se organiza como una unidad transcripcional eucariótica. El LTR 5´ contiene un promotor/activador y el LTR 3´ contiene un eficiente sitio de poliadenilación. La transcripción del provirus, vía ARNpol II celular, da lugar a un transcrito primario que tiene dos importantes funciones: puede servir como ARN genómico para ser incorporado en el virión, o bien ser procesado para proveer todos los ARN mensajeros (ARNm) que codifican las proteínas virales.
El promotor del VIH es regulado por factores celulares y virales y su actividad varía dependiendo del estado celular. En muchas células de individuos VIH positivos la expresión del virus es indetectable. De este modo, puede existir un estado de latencia en células individuales aunque la infección esté crónicamente activa debido a la expresión continua de VIH en una fracción de las células. ]]>
La proteína Tat incrementa en gran medida la expresión del promotor de VIH. Esta proteína es la que permite la alta expresión de ARNm en los primeros momentos posteriores a la infección. Mientras que la activación de Tat conduce básicamente a la obtención de ARNm maduros, la proteína Rev (regulación postranscripcional) regula el balance entre ARNm pre y post splicing. La activación de Rev conduce la última etapa de la expresión viral donde el ARNm que no ha sufrido splicing predomina. La función de Rev dirige el balance de la expresión de las proteínas virales a través de un feedback negativo; la disfunción de esta proteína conduce al estancamiento del virus en un estado en el que domina un patrón ineficaz de la expresión génica 52,53.En la mayoría de las células, la transición desde la primera etapa de la expresión viral (producción de Tat y ARNm maduros) a la última (producción de Tat y Rev con expresión eficiente de todos los ARNm virales) ocurre con rapidez (horas). Aunque pueden detectarse muchas células conteniendo el genoma de VIH pero sin expresión proteica, parece que sólo unas pocas pueden bloquearse en las primeras etapas de la expresión viral 54.
Ensamblaje del virión.
Las proteínas estructurales traducidas se van acumulando dentro de la membrana plasmática. La proteína Gag interacciona con Env que está embutida en la membrana plasmática. La multimerización del precursor Pr55gag lleva consigo el inicio de la formación de la partícula. Junto a Pr55gag, algunas Pr160gag-pol son también incorporadas al virión. Dos moléculas de ARN genómico son también encapsuladas junto a las moléculas de ARNtLys3. La integración de Pr160gag-pol a la partícula permite la activación de la misma.
El corte ordenado de Pr160gag-pol y Pr55gag dirige la maduración de la partícula y su inmediata liberación. Este es un paso esencial para la producción de viriones infectivos, ya que las partículas virales conteniendo las moléculas precursoras no son infectivas. El proceso descrito permite que se inicie también la maduración y activación de otras enzimas virales. La RT está asociada con el complejo ARNgenómico-ARNt e inicia la retrotranscripción si hay disponibilidad de nucleótidos trifosfato (dNTP). Las proteínas accesorias Vif y Vpr y posiblemente Nef son también incorporadas al virión junto con las proteínas celulares|, jugando un papel importante en el proceso de ensamblado 55-57. En algunos casos, estas proteínas celulares son muy importantes para la infectividad viral 58-59.
Una de las peculiaridades de VIH es el requerimiento de ciclofilina A (CyPA) para la infectividad del virus 60,61. CyPA, una chaperona con actividad peptidil isomerasa tiene un papel general en el plegamiento proteico 62,63 y se cree que interacciona directamente con Gag del VIH 61. Probablemente sea necesaria para el correcto plegamiento de Gag 64.
Promotor viral.
El potente promotor del VIH contiene una caja TATA y sitios de unión para factores de transcripción celulares incluyendo sitios para NF-KB y Sp1 65-69. Estos factores de transcripción son esenciales para la función del promotor. Hay dos sitios de unión en tandem para NF-KB (posiciones -104 y -90) y tres sitios de unión para Sp1 (-78 a -47). La delección de los sitios Sp1 o de los NF-kB reduce la actividad del promotor mientras que la retención de un solo sitio NF-kB es suficiente para el desarrollo completo de la actividad del promotor 65, 67, 69. Por ello, la composición del promotor más simple eficaz contiene 1 sitio NF-kB, los sitios Sp1, la caja TATA, el sitio de iniciación de transcripción y el elemento sensible a Tat (TAR).
El promotor de VIH es altamente inducible y responde al estado de activación de la célula infectada. NF-kB es el mayor activador inducible conocido. Se han identificado otros sitios de unión para otros tantos factores como NFAT y AP1 en la región U3. Sin embargo, parece que sólo los sitios para Sp1, NF-kB, Ap2 y HIP-1 afectan a la expresión del promotor de VIH en células humanas 70. Estas interacciones unen la expresión de VIH a la activación de genes específicos de células T y contribuyen a explicar las propiedades biológicas descritas de este virus. Los factores celulares que interaccionan con el promotor han sido intensamente estudiados y son motivo de bastantes revisiones 71-73.
Está bien establecido que en muchas células del tejido linfoide de individuos infectados se encuentra el VIH latente 74,75, aunque la replicación viral en el organismo esté siempre activa. En las células T en reposo la actividad del promotor de VIH es mínima siendo éste uno de los mecanismos más importantes que permiten la quiescencia viral en la mayoría de las células primarias. La activación celular está asociada con la activación viral. Debido a la baja actividad basal de LTR en los linfocitos T en reposo, la transactivación dependiente de NF-kB es necesaria para la inducción del LTR del VIH y para la propagación viral. Además, el VIH emplea un segundo paso regulatorio esencial en el que interviene la proteína viral Tat. Esta se une al elemento TAR del ARN en el comienzo de la transcripción, incrementándola en gran medida. Por todo lo expuesto, el promotor completo activado del VIH es uno de los más potentes conocidos en células humanas. ]]>
Señales regulatorias en el ARN viral.Se han identificado muchos sitios en el ARN viral del VIH que son esenciales para su propagación. Entre ellos, se incluyen los elementos reguladores positivos TAR y el elemento sensible a Rev (RRE) junto a los negativos, que inhiben la expresión (INS o CRS). Estos elementos negativos regulan la expresión mediante la interferencia en la estabilidad, transporte y traducción de los ARNm. Junto a los descritos, el ARNm también contiene varios sitios necesarios para otros pasos en el ciclo viral como la dimerización del ARN genómico y la encapsidación (sitio psi).
Como otros lentivirus, el VIH contiene muchos sitios de splicing comparado con los oncoretrovirus. El control preciso del splicing es esencial para los retrovirus ya que requieren del ARNm sin procesar para la encapsidación dentro de la partícula viral (ARN genómico). El splicing de VIH no ocurre rápidamente in vitro ni in vivo 76 permitiendo su precisa regulación.
ARNm virales.
El transcrito primario del VIH generado por la ARNpol II está protegido con una estructura CAP en 5´ y una cola de poliAdeninas en el extremo 3´. Una porción de este transcrito es sometido a splicing alternativo, generando más de 30 especies diferentes de proteínas virales 5, 76-82. Para propósitos de regulación génica estos ARNm pueden dividirse en dos clases.
La primera clase, incluyendo los ARNm inmaduros y los que han sufrido parcialmente el proceso de splicing dependen de la proteína Rev para una expresión eficaz. Estos ARNm codifican para Gag, Pol, Vif, Vpr, Vpu, Env y Tat-1.
La segunda clase comprende a los ARNm pequeños sometidos a splicing completo. Estos ARNm son expresados eficazmente en ausencia de Rev y codifica para Tat-2, Rev y Nef así como para Vpr y otras como Tev.
Se sabe que la producción de ARNm maduros está gobernada por la interacción de las proteínas virales Tat y Rev con elementos cis-acting sobre los ARNm (TAR y RRE).
Se han descrito tanto ARNm monocistrónicos (gag-pol, tat, tat-1) como bicistrónicos (rev/nef, vpu/env). En general, cada proteína viral es producida por más de un ARNm. Estos ARNm son sometidos a splicing y codifican una de las proteínas como el primer ORF(marco de lectura abierto), resultando una expresión óptima. Las excepciones a esta regla general están en el precursor de Gag/Pol que es producido por el ARNm sin splicing mientras que Env es producida como el segundo ORF por el ARNm bicistrónico vpu/env 83.
Múltiples estudios corroboran el hecho de que la producción de VIH puede tener lugar dentro de un gran margen de niveles de ARNm. Está bien establecido que los diferentes VIH aislados varían ampliamente en sus características biológicas como tropismo, niveles de expresión y citopaticidad. Debido a la variación en el splicing de los aislados primarios, como se ha descrito, es concebible que algo de la variabilidad en las propiedades biológicas de los diferentes VIH debe poder ser explicado como resultado de diferencias en el splicing. ]]>
Proteínas virales.Los genes del VIH codifican para diversas proteínas que pueden clasificarse, básicamente, en tres clases.
Proteínas estructurales.
* Gag: el gen gag da lugar a una proteína precursora de 55 KDa también llamada p55 que se expresa a partir del ARNm viral sin procesar. La poliproteína Gag es la encargada de reclutar dos copias del ARN genómico viral junto a otras proteínas celulares y virales que permite la expulsión de la partícula viral desde la superficie de una célula infectada. Después de la expulsión, la p55 es fraccionada por proteasas 84 codificadas por el virus (derivadas del gen pol) durante el proceso de maduración. Las cuatro proteínas derivadas de este procesamiento proteolítico son MA (matriz, p17), CA (capside, p24), NC (nucleocapside, p9) y p6 84.
Las moléculas MA facilitan el transporte nuclear del genoma viral mediante una señal que reconoce la maquinaria nuclear celular. Este fenómeno es el que permite al VIH infectar a células que no están en mitosis (85). La proteína CA o p24 forma el core cónico de las partículas virales (61,62,86). La región NC de Gag es responsable del reconocimiento específico de la llamada señal de empaquetamiento de VIH (87). La región polipeptídica p6 media las interacciones entre p55 y la proteína accesoria Vpr, permitiendo la incorporación de Vpr a los viriones 88.
* Gag-Pol (precursor): las proteínas PR, IN, ARNasa H y RT son también expresadas dentro del contexto de una fusión proteica Gag-Pol 89. El precursor Gag-Pol (p160) es generado por un evento de cambio de marco de lectura ribosomal (frame shifting) desencadenado por un elemento cis-acting específico 90. Cuando los ribosomas encuentran este motivo cambian al marco de lectura de pol (aprox 5% del tiempo) sin interrumpir la traducción. Durante la maduración viral, las proteasas virales separan el polipéptido Pol del Gag y a continuación digieren éste para separar la PR (p10), RT (p50), ARNasa H (p15) y la IN (p31).
La PR del VIH es una aspartil proteasa 91 que actúa como un dímero. La actividad proteasa es importante para la escisión de los precursores durante la maduración del virión. El conocimiento de la estructura tridimensional de esta proteasa 92 ha sido de gran interés farmacológico permitiendo la generación de nuevos fármacos, diseñados para inhibir específicamente esta enzima viral. Es quizá uno de los mejores ejemplos de la utilidad real que la investigación básica presta a la medicina clínica.
La RT es codificada por el gen pol. El ADN viral puede ser completamente sintetizado en 6 horas desde la penetración del virus, aunque puede permanecer sin integrar durante largos períodos de tiempo 92.
La IN media la inserción del ADN proviral en el ADN genómico de la célula infectada. En el proceso se ven implicadas 3 funciones diferentes de IN 44. Por una parte la actividad exonucleásica corta dos nucleótidos de cada final 3´ del dúplex de ADN viral lineal. A continuación, una endonucleasa de actividad "doble cadena" corta el ADN de la célula huésped en el sitio de integración. Por último, la actividad ligasa genera una unión covalente simple en cada extremo del ADN proviral. Se cree que la zona de integración viene influenciada por la accesibilidad al ADN incluido en la cromatina 93. Al menos in vitro, los sitios donde el ADN se encuentra retorcido dentro de la cromatina son puntos calientes para la integración 94. Sin embargo, la integración preferencial en regiones de cromatina abierta, transcripcionalmente activa, facilita la expresión del provirus. Los genes virales no son expresados eficazmente desde el ADN proviral no integrado 95.
* Env: se trata de una proteína de 160 KDa (gp160) que se expresa a partir de un ARNm sometido a splicing simple. Sintetizada en el retículo endoplásmico, Env emigra a través del complejo de Golgi donde es glicosilada con 25-30 cadenas de carbohidratos en los residuos de asparagina. Esta glicosilación es importante para la infectividad del virus 96. Una proteasa celular escinde gp160 para generar gp41 y gp120. Mientras que gp41 contiene el dominio transmembrana del Env, la gp120 se localiza en la superficie de la célula infectada y del virión a través de interacciones no covalentes con gp41. Se sabe que Env existe como un trímero en la superficie del virión. ]]>
Las interacciones entre el VIH y el receptor del virión, CD4, están mediadas a través de dominios específicos de gp120 97. La gp120 presenta 9 puentes disulfuro intracadenas muy conservados y 5 regiones hipervariables (V1 a V5) cuyas secuencias de aminoácidos varían bastante entre los diferentes VIH aislados. Una de ellas, conocida como bucle V3, aunque no está implicada en la unión a CD4, es un importante determinante del tropismo preferencial de VIH por las células Linfoides T o los macrófagos primarios 97 Asimismo, este bucle es la principal diana para los anticuerpos neutralizantes que bloquean la infectividad de VIH 98.Por otra parte, la gp41 contiene un dominio N-terminal fusogénico que media la fusión de las membranas viral y celular permitiendo el vertido de los componentes virales a la célula infectada 99.
Proteínas reguladoras.
* Tat: es un transactivador transcripcional esencial para la replicación del VIH 100. Tat es una proteína que une ARN a diferencia de los factores transcripcionales habituales, que suelen interaccionar con ADN 101,102. En concreto, se une a una estructura corta, en forma de bucle, conocida como "elemento de respuesta a la transactivación" (TAR) que está localizado en el extremo 5´ del ARN viral. Esta unión de Tat a TAR activa la transcripción del LTR de VIH en un orden magnitud de al menos 1000 veces. Tat puede activar la expresión de un número considerable de genes celulares incluyendo el gen del factor de necrosis tumoral (TNF) 103, pudiendo asimismo regular la expresión de otros tantos como el gen bcl-2 104 y el gen MIP-1a 105.
* Rev: se trata de una proteína de 13 KDa que une ARN 106. Producida a partir de ARNm totalmente procesado, Rev induce el tránsito de la expresión génica temprana de VIH a su etapa avanzada. 107. Experimentalmente se ha comprobado que Rev es absolutamente necesaria para la replicación de VIH; así, los provirus que carecen de la función Rev son transcripcionalmente activos pero no expresan genes virales tardíos y, por tanto, no producen viriones.
Proteínas accesorias.
Aparte de los genes y sus correspondientes proteínas descritas anteriormente, VIH contiene otros genes adicionales: nef, vif, vpr, vpu, codificando las llamadas proteínas accesorias.
Las proteínas accesorias no son absolutamente necesarias para la replicación vírica in vitro pero, sin embargo, representan factores de virulencia críticos in vivo. Nef se expresa a partir de un ARNm muy procesado y por tanto, es independiente de Rev. En contraste, Vpr, Vpu y Vif son productos de ARN sometido a splicing incompleto y, por tanto, sólo son expresadas en la fase de replicación tardía Rev-dependiente.
La mayoría de las proteínas accesorias de VIH tienen múltiples funciones tal y como se describe a continuación.
* Nef (negative factor): El gen nef pertenece al grupo de genes de expresión temprana siendo su producto la primera proteína viral que se acumula hasta niveles detectables en la infección por VIH 107. De entre sus múltiples funciones conocidas, destacan la regulación de la expresión de CD4 en la superficie celular 108, la perturbación de la activación de las células T y la estimulación de la infectividad del VIH 109. Nef actúa post-transcripcionalmente para disminuir la expresión en la superficie celular de CD4 110, incrementa la velocidad de endocitosis de CD4 y su degradación lisosomal 111. ]]>
El dominio citoplasmático de CD4 y, en particular, una secuencia repetida de dileucinas es el sitio de acción de Nef; asimismo, también regula, aunque en menor medida, la expresión celular de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I.Está demostrado la capacidad de Nef para perturbar la activación de las células T. Diversos estudios demuestran que la expresión de Nef tiene un efecto negativo en la inducción de NF-kB y en la expresión de IL-2 50. En cualquier caso, Nef ejerce efectos pleiomórficos en la activación de las células T dependiendo del contexto de expresión. Consistente con este modelo, se ha encontrado que Nef está asocida con diversas quinasas presentes en las células T helper.
Nef también es capaz de estimular la infectividad de los viriones 112. Las partículas de VIH producidas en presencia de Nef pueden ser 10 veces más infectivas que los viriones producidos en su ausencia.
* Vpr: aproximadamente 100 copias de Vpr están asociadas con cada virión 113. Juega un papel en la habilidad del VIH para infectar células que no están en mitosis en tanto que facilita la localización nuclear del complejo de preintegración 36. También puede bloquear la división celular 114; las células que expresan Vpr arrestan en la fase G2 del ciclo celular 115, 116. La expresión de Vpr parece prevenir la activación del complejo p34cdc2/ciclina B, conocido regulador del ciclo celular, importante para la entrada en mitosis (117-119). Asimismo, Vpr interacciona con la proteína uracil-ADN-glicosilasa (UNG) 119 cuyas consecuencias biológicas están aún por determinar.
* Vpu: este polipéptido de 16 KDa es una fosfoproteína integral de membrana que está localizada en las membranas celulares 120. Vpu es expresada del mismo ARNm que codifica a Env. Vpu es traducida, desde este ARNm, a niveles 10 veces menores que Env ya que el codón de iniciación en la traducción de Vpu no es eficaz 83.
Las dos funciones de Vpu, la modulación de CD4 y el incremento de la liberación de viriones, están genéticamente separadas 121.
En las células infectadas por VIH los complejos formados entre CD4 y la proteína de la cubierta viral en el retículo endoplásmico causan el atrapamiento de ambas proteínas dentro de este compartimento. La formación de complejos Env-CD4, por tanto, interfieren con el ensamblaje del virión. Vpu se encarga de liberar la cubierta viral, desencadenando la degradación de las moléculas de CD4 unidas con Env 122.
Vpu también incrementa la liberación de VIH desde la superficie de una célula infectada. En ausencia de Vpu, puede observarse un número alto de viriones agregados a la superficie de la célula infectada 58.
* Vif: es una polipéptido de 23 KDa, esencial para la replicación de VIH en los linfocitos de sangre periférica, macrófagos y algunas líneas celulares 59. En muchas líneas celulares Vif no es imprescindible y, por ello, se denominan como permisivas para VIH-mutantes de Vif. Los viriones producidos en estas condiciones pueden infectar a células no permisivas aunque los virus resultantes no son infectivos. Diversos estudios indican que es posible complementar la infectividad de estos mutantes de Vif mediante su expresión en las células productoras pero no en la diana 123. Estos resultados indican que Vif debe estar presente durante el ensamblaje del virión siendo incorporada a posteriori 31. Este fenómeno, sin embargo, no es específico porque Vif es también incorporada a retrovirus heterólogos como los virus de la leucemia murina 124. Los VIH sin Vif pueden entrar en las células pero no sintetizan eficazmente el ADN proviral . No está claro si el defecto en Vif afecta directamente a la retrotranscripción, a la desestructuración del virus o a la estabilidad del complejo nucleoproteico viral. Los viriones mutantes de Vif tienen cores con nucleoproteínas empaquetadas erróneamente como revelan los análisis de microscopía electrónica 125.
Regulacion de la expresion génica de VIH. ]]>
La regulación de la expresión génica de VIH es llevada a cabo por una combinación de factores celulares y virales. Se produce a niveles tanto pre como post-transcripcionales.Los genes del VIH se dividen en genes tempranos y genes tardíos 126, 127. Los genes tempranos (tat, rev, nef) se expresan a través de un proceso Rev-independiente. Los ARNm que codifican para genes tardíos (gag, pol, env, vpr, vpu, vpi) requieren de Rev para ser localizados citoplasmáticamente y poder ser expresados.
* Regulación de la transcripción: como ya se ha comentado, el LTR de VIH contiene sitios de unión a ADN para múltiples factores de transcripción. Los más directamente implicados en la regulación de la transcripción de VIH son aquellos pertenecientes a la familia NF-kB. La proteína NF-kB permite al virus ser el responsable del estado de activación de la célula T infectada. La estimulación del TCR provoca que la forma inactiva de NF-kB (localizada en el citoplasma) sea translocada al núcleo donde induce la expresión de una serie de genes específicos relacionados con la activación de la célula T. La NF-kB y la consiguiente activación de la transcripción del provirus puede también ser inducida por la citocinas TNF-a e IL-1 128. Este fenómeno podría ser de interés en la patogenia del SIDA. Por una parte, la activación fisiológica de una célula T latente infectada puede ser el modo en el que la latencia finaliza y comienza la producción del virus. Por otra, las múltiples infecciones que sufren los pacientes con SIDA suponen una elevada expresión de TNF pudiendo éste estimular la producción de VIH y la infección de más células 129.
El LTR de VIH también contiene sitios de unión para los factores de transcripción constitutivos Sp-1, Lef y Ets así como para los factores de transcripción inducibles NF-AT y AP-1 130, 131. Es sabido que Lef y NF-At son factores específicos de las células T mientras que los sitios de unión para Sp-1 son esenciales para el eficaz funcionamiento del promotor del VIH.
La activación inicial del LTR del VIH es una consecuencia de los factores de transcripción constitutivos e inducibles celulares. La activación del LTR por factores de transcripción conduce a la generación de transcritos cortos 132. En el proceso interviene un elemento localizado justo después (downstream) del sitio de iniciación de la transcripción conocido como "inductor de transcritos cortos" (IST) 133.
Sin embargo, se generan también algunos transcritos completos que permiten la producción de Tat. La proteína Tat interacciona entonces con TAR para incrementar inmediatamente los niveles de transcripción del ARN viral.
* Splicing del ARNm y localización celular: el transcrito primario de VIH contiene múltiples donadores (5´ splice sites) y aceptores (3´ splice sites) de splicing que pueden procesarse dando lugar a más de 30 ARNm alternativos 80. La mayoría de los ARNm son policistrónicos conteniendo ORF de más de una proteína. Estos ARNm expresan generalmente un solo producto génico. La elección de un determinado ORF está gobernado por la eficacia del codón de iniciación y de la proximidad de este codón al extremo 5´ del ARNm 134.
Los ARNm de VIH producidos pueden ser clasificados en tres clases:
1. ARN sin procesar: el transcrito primario no sometido a splicing de 9 Kb puede ser expresado para generar los precursores de Gag y Gag-Pol o bien empaquetado en los viriones sirviendo entonces como ARN genómico.
2. ARN sometido a splicing incompleto: estos ARNm usan el sitio donador de splice cercano al extremo 5´ de ARN genómico del VIH en combinación con cualquiera de los aceptores localizados en la región central del virus. Estos ARN pueden expresar en potencia Env, Vif, Vpu, Vpr y Tat (isoforma de un exón). Todos ellos retienen el segundo intrón del VIH.
]]> 3. ARN sometido a splicing completo: en ellos se han eliminado los dos intrones de VIH y pueden expresar Rev, Nef y Tat (isoforma de dos exones). Estos ARNm no requieren la expresión de la proteína Rev.Como norma general, los ARN que contienen intrones deben ser sometidos a splicing completo antes de que puedan salir del núcleo. Esta regulación es esencial ya que previene la traducción de secuencias intrónicas contenidas en los ARNm con splicing parcial. En el caso de VIH, la proteína Rev une al ARN viral y retiene las secuencias intrónicas dirigiendo su exportación desde el núcleo. Esta estrategia permite la salida del núcleo de ARNm parcialmente procesados, portando secuencias intrónicas. Los ARNm totalmente procesados dejan el núcleo a través de los mecanismos habituales de transporte. En cualquier caso, es necesario la existencia de unos niveles mínimos de Rev para que se produzca la salida nuclear de ARNm con intrones lo que explica el porqué éstos codifican para productos génicos virales tardíos. En contraste, las proteínas codificadas por los ARNm totalmente procesados (Nef, Tat y Rev) pueden producirse inmediatamente y son por ello productos génicos virales precoces.
Variabilidad del VIH.
La secuenciación del genoma de diferentes VIH aislados, procedentes de diversas regiones han demostrado una amplia divergencia 135. El VIH-1 puede ser dividido al menos en 9 subtipos genéticos (A-J y O). En Europa y USA hay dominancia del subtipo B mientras que en otras partes del mundo predominan otros subtipos solos o en combinación. Se sabe que existen diferencias en cuanto a los diferentes subtipos se refiere; así, los subtipos noB parecen transmitirse de forma diferente que los B pudiendo causar epimedias con características diferenciadas. Los subtipos A y E parecen ser más eficaces en la transmisión heterosexual pudiendo causar nuevas y severas epidemias tanto en países del primer mundo como en aquéllos en vías de desarrollo.
El mecanismo de generación de la variabilidad de VIH-1 es similar a la de otros retrovirus. La falta de función correctora en las enzimas virales y celulares implicadas en la replicación viral lleva a tasas altas de error con la continua generación de variantes (aproximadamente 3x10-5 por base y por ciclo de replicación). Las mutaciones incorporadas por la RT retroviral incluyen sustituciones de aminoácidos, mutaciones frameshift (cambio pauta de lectura) y delecciones 136. Junto a ello, parece que la transcripción inversa puede conducir a provirus hipermutados que contienen múltiples sustituciones G--A 137. Además, es posible variaciones en el genoma viral a través de recombinación entre las dos moléculas de ARN viral 138,139 durante la síntesis de ADN.
Se sabe que la variabilidad genética del VIH-1 afecta más a unos genes que a otros. Parece claro que el gen env es el que presenta el mayor número de mutaciones 140. El análisis bioquímico profundo ha demostrado que no sólo se conservan más los genes como gag o pol sino que los tipos de nucleótidos y aminoácidos de esas regiones son distintos a los encontrados en la envoltura 141. En gag y pol la mayoría de los cambios de las secuencias de nucleótidos se deben a mutaciones puntuales mientras que en la envoltura existen agrupaciones de cambios que afectan a delecciones en tramas, inserciones y duplicaciones. En la envoltura es frecuente encontrar mutaciones de un solo nucleótido que dan lugar a mutaciones no silentes. A pesar de esta extrema variabilidad del gen env del VIH-1, existen regiones muy conservadas que previsiblemente desempeñan importantes funciones biológicas. Las 18 cisteínas localizadas en la región extracelular de la envoltura y la mayoría de las localizadas en la gp41 están conservadas en casi todos los virus 142. Este hallazgo respalda la teoría de que las cisteínas son necesarias para mantener la envoltura con una configuración estructural tridimensional adecuada. Existen también otras regiones muy conservadas, identificadas como C-1 a C-4, entremezcladas con regiones de hipervariabilidad (V1-V5) en la región de la envoltura extracelular.
Durante la infección crónica activa, la continua propagación de altos niveles de virus lleva a muchos ciclos de replicación y a la generación de un enorme número de variantes. La selección de variantes antigénicas y de mutantes resistentes a drogas es fácil en estas condiciones.
Existen pruebas suficientes que indican que la variación genotípica del VIH-1 in vivo es rápida y amplia, que numerosas variantes de formas viricas coexisten en el tiempo dentro del mismo enfermo y que los cultivos de VIH-1 consisten realmente en mezclas complejas de virus genotípicamente distintos aunque emparentados.
Sin duda la diversidad genómica del VIH-1 es uno de los mayores obstáculos actuales en la obtención de terapias efectivas.
VIH-2. ]]>
El VIH-1 es el agente etiológico del SIDA epidémico de Africa Central, Europa, USA y la mayoría de los restantes países. Las primeras pruebas de un segundo grupo importante de retrovirus asociados a la inmunodeficiencia humana adquirida se muestran en las publicaciones de Barin et al 143-145. Investigaciones posteriores llevaron al aislamiento de un virus linfótropo T humano emparentado con el SIV, denominado actualmente como virus de la inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2) 146-148 y que se encuentra con mayor frecuencia en Africa Occidental.Antigénicamente, el virus VIH-2 sólo presenta reacciones cruzadas con el VIH-1 en la proteína p24/p25 y de forma ligera con Pol mientras que guarda más semejanzas con el SIV de macaco. Entre el SIV y VIH-2 existe una homología en la secuencia de nucleótidos de alrededor del 75% mientras que entre VIH-2 y VIH-1 sólo es del 40% 149.
Como sucede con el VIH-1, el VIH-2 es un retrovirus, posee ARN como genoma, está limitado por secuencias LTR terminales redundantes y contiene los genes gag, pol y env. Existen 6 genes más (tat, rev, nef, vif, vpr y vpx) estando todos relacionados con los del VIH-1 salvo el vpx que sustituye al vpu. La mayor similitud entre ambos subtipos es a nivel de las proteínas del core (Gag, Pol) lo que explicaría la reactividad cruzada entre ambos virus.. Tiene un ciclo biológico similar al VIH-1 infectando de la misma forma a células que presenten CD4.
A pesar de todo, ambos tipos causan síndromes clínicos similares. Es interesante señalar la existencia de algunas publicaciones en las que se muestran datos sobre la menor patogenicidad de los grupos de virus VIH-2 147.
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