0034-7973

S0034-79732003000100002

00 03 2003

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ORIGINALES

Evaluación de un nuevo medio CHROMagar Candida para la identificación presuntiva de levaduras

Jesús Ruiz-Aragón, Pedro García-Martos, José Luis Puerto, Pilar Marín, Abel Saldarreaga, Patricia Moya

Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cádiz.

Palabras clave: CHROMagar Candida; Levaduras; Candida; Identificación
Key Words: CHROMagar Candida; Yeasts; Candida; Identification

Resumen

Se evaluó la utilidad de un nuevo medio cromogénico diferencial CHROMagar Candida frente a dos medios de eficacia probada. Ensayamos 34 levaduras de diferentes especies, pertenecientes a ocho géneros: Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Blastoschizomyces, Rhodotorula, Kloeckera, Pichia y Saccharomyces. Tras su correcta identificación se cultivaron en los tres medios a estudiar, apreciando la morfología colonial, color y capacidad de crecimiento. En el nuevo medio las colonias presentaron un tamaño menor y más intensidad de color. Muchas especies ofrecieron el mismo morfotipo. El nuevo medio CHROMagar Candida no muestra la misma eficacia que los otros medios para la identificación de especies de levaduras, al presentar menor sensibilidad, requerir un mayor tiempo de incubación para que las colonias se desarrollen y dificultar la diferenciación de algunas especies de interés clínico como C. tropicalis, C. dubliniensis y C. parapsilosis.

Abstract ]]> The efficiency of a new chromogenic differential medium CHROMagar Candida was evaluated against two media of efficiency proved. We tested 34 different yeast species, pertaining to eight genera: Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Blastoschizomyces, Rhodotorula, Kloeckera, Pichia and Saccharomyces, previously identified. Isolates were cultured in each plates of chromogenic media. The colony colour, morphology and growth were noted. Colonies in new medium developed small size and high intensity colour. Several yeasts showed same morphotype. New CHROMagar medium has not demonstrated similar efficiency for identification of yeast species that another media. It presents less sensibility, longer incubation time for colony growth, and the differentiation of some clinical interest yeasts as C. tropicalis, C. dubliniensis and C. parapsilosis was difficult.

Recibido: 3-VII-02
Aceptado: 4-XI-02
Correspondencia: Jesús Ruiz Aragón
Av. del Ejército, 13-1º G.
El Puerto de Santa María 11500. Cádiz
E-mail: reducido@hotmail.com

Introducción ]]> Muchas de las técnicas convencionales de identificación de levaduras se basan en pruebas bioquímicas que requieren al menos 48 horas para su correcta interpretación. En los últimos años se han desarrollado medios de cultivo adicionados de sustratos cromogénicos que, a partir de actividades enzimáticas y en presencia de un indicador de la enzima, permiten la identificación presuntiva de distintas especies en función de la coloración, textura y morfología de las colonias, en 24-48 horas^1,2. Estos medios tuvieron sus precursores en los medios Nickerson³ y Pagano-Levin^4,5. Una de las principales ventajas de estos medios es permitir diferenciar los cultivos mixtos. Están disponibles para el aislamiento primario e identificación de Candida albicans sobre todo (Albicans ID, Cromogen Albicans, Candida ID y CandiSelect)^6-13. El medio CHROMagar Candida fue descrito por Odds y Bernaerts en 1994 para diferenciar las especies del género Candida de interés clínico, y permite identificar bien a C. albicans, C. tropicalis, C. krusei y C. glabrata^14-16. El medio CHROMagar Candida original (Becton-Dickinson, Francia) (CHROM-R) ha sido reformulado recientemente buscando un mayor nivel de diferenciación, especialmente para Candida dubliniensis. Este medio (CHROM-R) ha sustituido al original (CHROM-O).

En este trabajo hemos evaluado la nueva fórmula del medio CHROMagar Candida (CHROM-R) frente a la fórmula original (CHROM-O), considerando la capacidad de crecimiento y morfotipo de las colonias, y posteriormente hemos realizado un estudio comparativo del medio reformulado con un nuevo medio de similar composición de otra casa comercial (MAIM, Izasa, Barcelona) (CHROM-M).

Material y Métodos

Los medios de cultivo CHROMagar Candida de Becton-Dickinson (CHROM-O, CHROM-R) y CHROMagar Candida de MAIM (CHROM-M) están diseñados para el aislamiento y diferenciación de varias especies de Candida de interés clínico. La composición del medio CHROM-M por litro es la siguiente: peptona (10,2 g), mezcla cromogénica (22 g), cloranfenicol (0,5 g) y agar (15 g), tamponado a pH 6,1.

Ensayamos un total de 269 levaduras de 34 especies diferentes, pertenecientes a ocho géneros: Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Blastoschizomyces, Rhodotorula, Kloeckera, Pichia y Saccharomyces, identificadas mediante sus características morfológicas, fisiológicas y nutricionales, empleando métodos convencionales y el sistema de asimilación de compuestos de carbono ID 32C (bio-Mérieux, Francia). Las cepas procedían en su mayor parte de muestras clínicas de pacientes atendidos en el Hospital Universitario Puerta el Mar de Cádiz, y unas pocas de origen ambiental. Tras su correcta identificación, se cultivaron en agar de Sabouraud durante 48 horas a 35-37ºC, y a partir de aquí se realizó una suspensión de 10⁷ufc/ml en agua destilada estéril, la cual fue estriada con asa de 10 µl sobre la superficie de los tres medios cromogénicos estudiados. Las placas se incubaron a 35-37ºC en ambiente aerobio y fueron examinadas a las 24 y 48 horas, apreciando en las colonias su morfología, color y capacidad de crecimiento. Como cepas control se utilizaron Candida albicans ATCC 752, C. tropicalis ATCC 750, C. glabrata ATCC 2001 y Cryptococcus neoformans ATCC 2344.

Resultados

El espectro de colores obtenido en los medios cromogénicos fue variado: blanco, crema, azul, turquesa, verde, pistacho, lila, rojo, rosa y beige. En la tabla 1 se muestran las tonalidades de color, textura y morfología colonial, correspondientes a cada una de las 34 especies ensayadas para establecer el morfotipo colonial.

]]> Las variaciones morfológicas y de color observadas en la comparación del medio CHROM-O frente al CHROM-R fueron mínimas. Cabe resaltar un cambio en la intensidad del color verde en la detección de C. dubliniensis (verde oscura) en relación con C. albicans que conserva su coloración característica de verde clara. Este resultado se aprecia mejor pasadas 48 horas de su incubación y no ocurre en todas las cepas. En el resto de especies las coloraciones fueron similares, si bien la intensidad de color experimentó algunas variaciones.

En el nuevo medio CHROM-M hubo cambios significativos con respecto a la morfología, color e intensidad de éste. Todas las colonias tuvieron en este medio un tamaño menor que en CHROM-R y la intensidad del color fue mayor, especialmente en las tonalidades azules y lilas. El crecimiento de C. dubliniensis fue indistinguible del de C. albicans, apreciándose en ambas especies una coloración verde. Para C. tropicalis obtuvimos tres tonalidades de color (pistacho, violeta claro y azul). C. glabrata presentó un color lila en ambos medios, si bien en CHROM-M la coloración fue más intensa y se evidenció la presencia de halo. C. parapsilosis evidenció una tonalidad rosa-crema más clara en CHROM-M que en CHROM-R. Para las especies de Rhodotorula se observaron diferencias en cuanto a color y brillo, pudiéndose diferenciar con estas características las tres especies estudiadas. Para los géneros Cryptococcus, Saccharomyces, Trichosporon, Pichia, Kloeckera y Blastoschizomyces, los resultados obtenidos en ambos medios fueron idénticos.

Discusión

Las infecciones fúngicas, en especial las causadas por levaduras, han incrementado su incidencia en los últimos años debido al aumento de pacientes inmunocomprometidos, donde se comportan como oportunistas, y al mayor número de cepas de levaduras resistentes a los antifúngicos. El género Candida es el predominante en muestras clínicas, y dentro de éste, C. albicans la especie más aislada. Sin embargo, cada vez hay más infecciones por otras especies de Candida, que presentan habitualmente mayor resistencia a los azoles, lo que justifica la necesidad de la utilización de medios diferenciales para la rápida identificación a nivel de especie, que puede acelerar el diagnóstico y favorecer un tratamiento precoz y apropiado.

Los medios cromogénicos diferenciales ofrecen la gran ventaja de poder aislar e identificar presuntivamente las levaduras de una muestra con flora polifúngica, siempre que cada una de las distintas especies posea una actividad enzimática característica que ofrezca distintas tonalidades de color al actuar sobre los sustratos cromogénicos del medio. Según algunas publicaciones los medios cromogénicos, y especialmente el medio CHROMagar Candida, son útiles para la identificación de las especies de Candida más habituales en muestras clínicas: C. albicans, C. tropicalis, C. krusei y C. glabrata, no ofreciendo resultados definitivos para C. parapsilosis^14-16.

En el conjunto de los tres medios CHROMagar Candida objeto de nuestro estudio, los colores obtenidos con más frecuencia fueron el blanco, crema, rosa y lila, haciendo complicada la diferenciación de las diversas especies que presentan esta gama de tonalidades. Las características de aspecto, textura y presencia de halo se conservan para la mayoría de las especies en los tres medios y aportan información adicional para la correcta identificación.

Las variaciones entre CHROM-O y CHROM-R fueron mínimas como ya se ha demostrado en trabajos anteriores¹⁷. El medio reformulado aporta la posibilidad de distinguir entre C. albicans y C. dubliniensis, no teniendo esta capacidad el medio original^17-20, ni el nuevo medio CHROM-M.

El nuevo medio CHROMagar de MAIM no ha demostrado la misma eficacia para la identificación de especies de levaduras que el medio CHROMagar Candida de Becton-Dickinson, ya que presenta una menor sensibilidad, necesita un mayor tiempo de incubación para que las colonias se desarrollen y dificulta la diferenciación de algunas especies de interés clínico como C. tropicalis y C. parapsilosis. No es tampoco un medio apropiado para le identificación de C. dubliniensis, siendo el color de ésta semejante al de C. albicans. El medio CHROM-R presenta frente a éste, sin duda, una mayor sensibilidad y especificidad para la identificación de C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis y C. dubliniensis.

Dado que el medio cromogénico CHROMagar Candida de Becton-Dickinson ha sido bien evaluado por otros autores^1,2,14-17, y el nuevo medio CHROMagar de MAIM no mejora las características de los anteriores, en nuestro caso seguimos utilizando en el trabajo rutinario de laboratorio el medio CHROMagar Candida reformulado de Becton-Dickinson.

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