Porfirinas en Cálculos Renales (Revisión)

Mª L. Traba Villameytide

Bioquímica Clínica. Sección Fisiopatología Ósea. Fundación Jiménez Díaz. Madrid.

RESUMEN PORFIRINAS EN CÁLCULOS RENALES (REVISIÓN) ]]> Hemos realizado una revisión del contenido de porfirinas en una clase peculiar de cálculos renales. Estos son negros como el carbón y presentan un espectro infrarrojo (EIR) similar al conocido como "materia orgánica", el cual no indica la clase de sustancia a la que corresponde. Otros tipos de cálculos renales, principalmente de pequeño tamaño y eliminados espontáneamente, pueden tener un compuesto oscuro o negro de forma difusa o aislada y presentan un espectro de IR similar al de "materia orgánica". Después de observar que la hemoglobina presentaba un espectro de IR de "materia orgánica", estudiamos, por cromatografía en capa fina, un método sensible para la determinación de porfirinas, la presencia de porfirinas en diversos tipos de cálculos renales negros y oscuros, ya que las porfirinas son los precursores del grupo hemo. Este trabajo ha puesto de manifiesto dos tipos de porfirinas: la coproporfirina, en pacientes que padecen hepatopatías, y la uroporfirina y heptacarboxilporfirina en pacientes con algún tipo de porfiria o bien con fracaso renal crónico. Palabras clave: Cálculos renales negros. Coproporfirina. Uroporfirina. ABSTRACT PORPHYRINS IN RENAL CALCULI (REVIEW) We performed a review of the porphyrines content in a type of black, charcoal-like, renal calculi exhibiting infrarred spectra (IRS) similar to those characteristic of "organic material" which has not yet been fully elucidate. Several other types of renal calculi, mainly those of small size, spontaneous passage renal stone, may also have diffuse or isolated dark charcoal components showing "organic material" IRS. After observing that haemoglobin has an "organic material" IRS, we studied, by a sensitive thin layer chromatography method, the presence of porphyrines in several types of dark or charcoal renal stones, since porphyrines are the physiological precursors of haemo group biosynthesis. We found two types of porphyrine content: coproporphyrin, in patients suffering from hepatopathy, and uroporphyrin and heptacarboxil-porphyrin in patients with some types of porphyria or with chronic renal failure. Key words: Porphyrin renal black calculi. Coproporphyrin. Uroporphyrin.

Existe un reducido número de cálculos renales negros, generalmente de pequeñas dimensiones, que a la lupa binocular muestran la apariencia del carbón, Fig. 1-I (a, b), y que por espectrometría de infrarrojos (IR) muestran el espectro denominado "materia orgánica", Fig. 2A. Existen otro grupo de pequeños cálculos de expulsión espontánea de Weddellita y Whewellita que morfológicamente y a la lupa binocular muestran un componente negro en forma difusa o aislada en áreas del cálculo, Fig. 1-II (a, b, c, d). El análisis por IR de la materia negra mostró el espectro de "materia orgánica", Fig. 2 (A, B). Existe otro grupo de cálculos farmacológicos compuestos por triamterene que presentaban un color negruzco, en lugar del característico color dorado, (Fig. 1-III). También nos llamó la atención un grupo de cálculos papilares de Whewellita de color oscuro (Fig. 1-IV).

FIGURA 2. Espectros de infrarrojos de: A, materia orgánica; B, cálculo negro; ]]> C, mezcla de porfirinas (copro, proto y uroporfirinas);
D, hemoglobina; E, albúmina y F, cálculos de traimterene.

Con el fin de definir la composición de los cálculos, éstos fueron diluidos en agua destilada y se aplicaron las tiras de Labstix (Lab Ames, Madrid), dando positiva la reacción de los grupos tetrapirrólicos¹. A partir de estos resultados nos planteamos realizar un espectro de infrarrojos de hemoglobina (Difco, Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), de albúmina humana, fracción V de Miles Martín (Lab Ames, Milán, Italia). Ambos mostraron un EIR similar a "materia orgánica", Fig. 2 (D y E respectivamente). La Fig. 2F muestra el espectro del triamterene. También se hicieron espectros de fibrina y globina que muestran espectros mas planos¹. Estos hechos nos llevaron a la determinación de porfirinas en otro tipo de cálculos negros o bien muy oscuros.

MATERIALES Y MÉTODOS

De 4.761 cálculos renales analizados por espectroscopía infrarroja, 40 de ellos presentaban el tipo peculiar negro, semejante al carbón (0.8%) mostrando un EIR de "materia orgánica"^1-4 (Fig 2B). En primer lugar, se hizo el análisis de porfirinas⁵ a los grupos de cálculos, Fig 1 (I, II, III)) anteriormente citados, y a un grupo tomado como control formado por cálculos de carbonato apatita, estuvita, whewellita, weddellita y cistina^4,6,7. Con posterioridad se realizó el contenido de porfirinas de un grupo de cálculos papilares (Fig. 1-IV).

El análisis por espectrometría de infrarrojos se realizó por el método de comprimidos de bromuro potásico³ y la determinación de porfirinas por cromatografía de capa fina⁵. Para ello los cálculos fueron homogeneizados (en mortero de vidrio) y sus porfirinas esterificadas a temperatura ambiente y en oscuridad mediante la mezcla metanol/ácido sulfúrico (9:1 v/v). A las 24 h los ésteres de porfirinas fueron extraídos con cloroformo, que una vez lavado y neutralizado fue evaporado. Las muestras se suspendieron en cantidades conocidas de cloroformo y aplicadas a placas cromatográficas de sílicagel G-60 de 0.25 mm de espesor (Merck) sin indicador de fluorescencia. El desarrollo cromatográfico se efectuó mediante el solvente constituído por acetato de etilo/propionato de etilo/diclorometano/tetracloruro de carbono (1:1:2:2, v/v). Los cromatogramas se cometiieron a "scanning" fluorométrico en un lector de placas Schimadzu Mod CS-920. La aplicación simultánea de ésteres de porfirinas patrones (Porphyrin Products, Utah), en cantidades conocidas, permitió cuantificar e identificar los metil-ésteres de los diversos carboxil-porfirinas presentes en las muestras de los cálculos a analizar. Por otra parte, los cálculos del grupo I fueron estudiados por el método de cromatografía en capa fina con microscopía de polarización y con microscopía electrónica de barrido.

Dado que las porfirinas tienen la capacidad de unirse a iones para originar metaloporfirinas y debido a la alta reactividad de los grupos carboxílicos de las cadenas laterales pueden unirse a proteínas y lípidos⁸. Por todo ello, a 4 cálculos negros y 4 cálculos controles se les determinó el contenido de iones por espectrometría de absorción atómica (Perkin Elmer), fósforo por el método de Fiske y Subbarow⁹ proteínas totales por el método de Bradford et al¹⁰ colesterol por el método de Richmond¹¹ y triglicéridos por el método de Bucolo et al¹².

El método estadístico aplicado en el estudio de las porfirinas de los grupos I, II, III con respecto al grupo control fue el test no paramétrico de Mann-Whitney. La hipótesis nula fue eliminada para valores de p<0.05. En los demás estudios realizados se aplicó el test de la t de Student. El valor de p<0.05 se consideró significativo.

RESULTADOS

La Tabla II muestra el contenido de porfirinas de un grupo de cálculos papilares.

La figura 3 muestra el contenido total de proteínas (µg/mg) en los grupos de cálculos I,II,III y IV y control.

FIGURA 3. Contenido total de proteínas (µg/mg) en cálculos negros (I),
cálculos con una mancha negra (II), cálculos negruzcos de triamterene (III),
cálculos oscuros papilares (IV) y cálculos controles.

La Figura 4 muestra el espectro de IR de la copro, proto y uroporfirina (4A, 4B y 4C respectivamente) y de la mezcla de estas porfirinas con albúmina (Fig. 4D, E y F respectivamente). La Fig. 2C muestra un espectro de IR de una mezcla de copro, proto y uroporfirina.

 
FIGURA 4. Espectros de infrarrojo de: estándar de copro, proto y uroporfirina (A, B, C, respectivamente).
Espectros de infrarrojo correspondientes a la mezcla de copro, proto y uroporfirina con albúmina
(D, E y F, respectivamente).

La Figura 5 muestra la visión de un cálculo del grupo I por microscopía de polarización y la Figura 6 muestra el cálculo por microscopía electrónica de barrido.

FIGURA 5. Imagen por microscopía de luz polarizada de un cálculo negro ]]> por el método de lámina delgada (aumento x 40).

FIGURA 6. Imagen de un cálculo negro por microscopía electrónica
de barrido (aumento x 80).

La Tabla III muestra el contenido de iones de cuatro cálculos negros que contienen porfirinas frente a cuatro cálculos controles.

Se ha observado un aumento significativo del contenido de proteínas en los cálculos que contienen porfirinas frente a los cálculos controles (1.75 ± 0.95 vs 0.39 ± 0.45 23 µg/mg de cálculo, p<0.0025). También, existe un aumento de la fracción lipídica en los cálculos que contienen porfirinas frente a los controles, así el colesterol es de 4,4 ± 3,93 vs 0.002 ± 0.041 µg/mg de cálculo, p<0.005. Por otra parte, la suma de glicerol y triglicéridos es de 1.53 ± 0.51 vs 0.002 ± 0.0027 µg/mg cálculo, p<0.0125. En el espectro electroforético se ha observado la presencia de una banda que corresponde a la albúmina y se han detectado dos pequeñas bandas en la zona de la α-globulina y el fibrinógeno⁸.

El aspecto morfológico de los cálculos de color negro con apariencia como el carbón (grupo I) es totalmente característico y difiere del resto de los cálculos renales^3,6. En el trabajo publicado por el Dr. Cifuentes Delatte en 1984¹³ se indicó la existencia de una materia negra muy característica y no identificada, detectada en la cara cóncava de una serie de cálculos papilares. Es posible que estos cálculos puedan corresponder a los referidos como "cálculos de índigo"¹⁴. Thiel et al¹⁵ describieron cálculos renales como coágulos de sangre después del transplante renal. Los cálculos de triamterene (grupo III) mostraron un color oscuro⁴. Este hecho fue reportado por Ettinger et al (1917) que observaron una gama de colores en este tipo de cálculos que era desde el color típico dorado de estos cálculos a un color oscuro. Estos autores pensaron que este hecho era debido a la incorporación de pigmentos urinarios en los cálculos. El contenido de porfirinas en los cálculos negros y oscuros es sorprendentemente elevado, aunque encontramos un rango de valores muy variado.

En un intento de valorar el contenido de porfirinas en estos cálculos renales tan peculiares, se comparó con el contenido de porfirinas en hígado y eritrocitos, siendo éste de 1 ng/mg y 300 ng/mg respectivamente, correspondiendo a la coproporfirina⁶. En personas normales la eliminación en orina de coproporfirina representa alrededor del 70-80% de la eliminación total de porfirinas⁶.

Pacientes con hepatopatías pueden eliminar altas cantidades de porfirina, principalmente de coproporfirina (tetracarboxil-porfirina). En pacientes con algún tipo de porfiria o con fracaso renal crónico, la eliminación de porfirinas corresponde a las mas carboxiladas, así tenemos la uroporfirina (octacarboxil-porfirina) y heptacarboxil-porfirina. Precisamente en el tipo de cálculos negros y de color negruzco hemos encontrado estos dos patrones de acumulación de porfirinas. Durante el desarrollo del cálculo, el contenido de porfirinas puede haberse unido a otros componentes del cálculo. Es bien conocido que las porfirinas tienen afinidad para unirse a proteínas y lípidos⁸. Así, nosotros hemos encontrado un aumento significativo del contenido de proteínas y lípidos en los cálculos que contienen porfirinas⁸.
También es conocida la capacidad de unión de las porfirinas a iones para formar las metaloporfirinas. En los cálculos con porfirinas hemos encontrado un aumento significativo del contenido de Fe²⁺ y Cu²⁺ frente a los cálculos controles, no existiendo diferencias significativas entre el grupo de cálculos problema respecto al grupo control en el contenido de Zn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, K⁺, Na⁺y P. Los pacientes que expulsaron cálculos de triamterene padecían enfermedades hepáticas, hecho que puede explicar la alta concentración de coproporfirina⁴. Los pacientes que eliminaron cálculos negros mostraron que padecían un fracaso renal crónico, habiéndose encontrado en estos cálculos un predominio de uroporfirina. La hipótesis de que las porfirinas tuvieran un origen hematúrico no se ha podido confirmar, dado que la dicarboxil-protoporfirina (porfirina presente en los eritrocitos) no se ha detectado en estos cálculos.

Por otra parte, no tenemos referencias de la presencia de porfirinas en cálculos renales, excepto el encontrado por Castro-Mendoza¹⁸, en el que describe la existencia de coproporfirina III (Fig. 7) procedente de la parte oscura de un cálculo de xantina (Fig. 8). Miller et al¹⁸ reportaron el hecho de encontrar hematina en dos cálculos renales.

FIGURA 7. Coproporfirina III.

]]> FIGURA 8. Cálculo de xantina donde puede observarse una mancha negra.

Escasa información puede obtenerse por espectroscopía infrarroja de la existencia y tipo de porfirina contenida en estos cálculos negros. Sin embargo, cuando el espectro de IR es el de "materia orgánica" en cálculos negros o negruzcos, es sugerente la existencia de porfirinas en ellos y debe completarse el estudio del cálculo con el análisis de porfirinas.

La alta concentración de porfirinas en este tipo peculiar de cálculos renales es difícil de evaluar. Son necesarios estudios posteriores para clarificar el mecanismo o mecanismos que conducen a las porfirinas a ser parte constituyente de cálculos renales.

Agradecimientos

Quiero hacer patente mi agradecimiento al Dr. Castro-Mendoza por haberme facilitado los dispositivos correspondientes a la coproporfirina III y el cálculo de xantina. Igualmente quiero agradecer al Dr. Cifuentes-Delatte el haber cedido el estudio de un cálculo negro por microscopía electrónica.

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Dra. Mª L. Traba Villameytide
Bioquímica Clínica
Sección Fisiopatología Ósea
Fundación Jiménez Díaz
Avda. Reyes Católicos, 2 ]]> 28040 Madrid

(Trabajo recibido el 2 septiembre de 2004)