Reconstrucción tridimensional in vitro de mucosa vesical humana
In vitro three-dimensional reconstruction of human bladder mucosa.
E. de Diego Rodríguez, A. Roca Edreira*, A. Villanueva Peña, A. Meana Infiesta***, S. Gómez Llames***, B. Martín García*, J.Mª Gómez Ortega**.
Servicio de Urología y **Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Comarcal de Laredo (Cantabria).
* Servicio de Urología Hospital Universitario Marques de Valdecilla. Santander. (Cantabria).
*** Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado De Asturias. Oviedo. (Asturias).
RESUMEN
Objetivo: Aplicar las técnicas de cultivo in vitro de queratinocitos así como los principios de la ingeniería tisular al epitelio urinario humano, con el fin de reconstruir tridimensionalmente una mucosa vesical humana in vitro, apta para trasplantar.
Material y Métodos: Se obtuvieron muestras de mucosa vesical de pacientes programados para cirugía abierta de próstata, previo consentimiento de los mismos, las cuales fueron cultivadas in vitro, para proceder posteriormente al estudio histomorfológico de los tejidos obtenidos.
Resultados: Se obtuvo un tejido tridimensional compuesto por una submucosa bioartificial a base de un gel de fibrina y fibroblastos, sobre la que descansan las células uroepiteliales, pudiendo utilizar una malla de ácido poliglicólico, que facilite la manipulación de la mucosa y el posterior injerto de la misma. El tejido obtenido tenía el aspecto de un epitelio inmaduro con muy escasa reacción a citoqueratinas, sin poderse demostrar inmunohistoquímicamente el desarrollo de una membrana basal.
Conclusiones: Las técnicas de cultivo in vitro de queratinocitos son aplicables a otros epitelios, entre ellos el urotelio humano. En un periodo de tiempo relativamente corto se puede obtener un tejido in vitro tridimensional apto para trasplantar, precisando posiblemente de las interacciones con el lecho receptor para poder madurar.
Palabras clave: Cultivo in vitro. Urotelio. Ingeniería tisular.
ABSTRACT
]]> Objetive: The purpose of this study is to apply the in vitro keratinocyte culture techniques and the tissue engineering principles to human urothelium, to reconstruct an in vitro three-dimensional human bladder mucosa, suitable for grafting.Key words: In vitro culture. Urothelium. Tissue engineering.
El aparato genitourinario está expuesto a un gran número de lesiones ya desde el inicio de su desarrollo embriológico. Además de las malformaciones congénitas, otros procesos como neoplasias, infecciones, traumatismos o lesiones iatrogénicas pueden provocar alteraciones o pérdidas de los órganos genitourinarios, que hagan necesaria su reconstrucción o restitución1-5.
Tradicionalmente la cirugía reconstructiva del aparto urinario se ha enfrentado a la falta de tejidos urológicos nativos, lo que ha obligado a la utilización de tejidos heterólogos (piel, tracto gastro-intestinal, mucosa bucal, etc.) o materiales sintéticos, con no siempre buenos resultados.
El uso de tejidos no urológicos, como por ejemplo el tracto gastro-intestinal, es la técnica de elección universalmente aceptada a falta de una alternativa mejor para la reconstrucción la vía urinaria, a pesar de sus conocidas complicaciones: infección, formación de moco y litiasis, alteraciones metabólicas o desarrollo de neoplasias6-9.
]]> La utilización de otros tejidos como la piel y mucosa prepucial o el epitelio vesical o bucal ofrecen resultados aceptables con el serio inconveniente de no siempre disponer de los mismos o hacerlo en cantidades limitadas10,11.Por otra parte, el uso de materiales sintéticos persistentemente ha fracasado, en gran parte debido a las particulares características del aparato urinario, siendo una constante la presencia de infección, la formación de litiasis o el rechazo del material12,13.
Estas limitaciones han obligado a los investigadores a una búsqueda incesante de nuevas alternativas.
Recientemente se introduce un nuevo concepto en la cirugía reconstructiva génito-urinaria al intentar aplicar las técnicas del cultivo celular y de la ingeniería de tejidos, con el fin de obtener un tejido urológico bioartificial útil para trasplantar, que evitase así los problemas originados por el uso de tejidos heterólogos o materiales sintéticos14-18.
Basándonos en la amplia experiencia de otros autores1-5,14-18 y en la nuestra propia con el cultivo in vitro de urotelio en el animal de experimentación19, pretendimos reconstruir un equivalente uroepitelial completo in vitro, aplicando los principios del cultivo celular y de la ingeniería de tejidos al urotelio humano, para poder obtener así un tejido viable, de constitución tridimensional, fácil de manejar, y que en futuros trabajos nos permita demostrar su viabilidad como injerto libre y por tanto poder establecer con el tiempo posibles aplicaciones clínicas.
Material y métodos
Se obtuvieron muestras de mucosa vesical de 5 pacientes que iban a ser sometidos a adenomectomía transvesical, previo consentimiento escrito de los mismos, sin realizarse procedimiento alguno ajeno al acto quirúrgico. El tamaño de las muestras en ningún caso fue superior a 1 cm2.
Fueron desestimados pacientes portadores de sonda uretral, litiasis vesical, enfermedades del urotelio (cistitis, neoplasias) o infecciones urinarias previamente demostradas, condiciones todas ellas que pudiesen alterar el cultivo in vitro de la muestra.
Las biopsias fueron depositadas en medio de cultivo para su posterior traslado al laboratorio.
]]> La metodología utilizada fue prácticamente la misma que para el cultivo de urotelio en al animal de experimentación19, como a continuación se detalla y esquematiza (Fig. 1).
Procesamiento de las muestras
A la llegada de la biopsia de mucosa vesical al laboratorio se procede a la retirada del medio de transporte, (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con antibióticos). Se depositó la muestra sobre una placa de Petri para proceder a su lavado con solución de tripsina/ácido etilendiaminotetracético (tripsina / EDTA) estéril y a continuación se troceó finamente la mucosa hasta obtener pequeños fragmentos de tejido.
Seguidamente la muestra fue depositada en un frasco con agitador magnético estéril, añadiéndose aproximadamente 50 ml de solución de tripsina/EDTA y se incuba a 37°C, bajo agitación, durante 30 minutos.
Se procedió a la agitación de los fragmentos de mucosa, dejándose decantar éstos y se recogió la tripsina pasándose a un tubo cónico de 15 ml. Se añadieron 25 ml más de tripsina fresca al frasco agitador que contiene los fragmentos de mucosa y se incubaron nuevamente a 37°C durante 30 minutos.
La tripsina recogida se neutraliza con igual cantidad de medio de cultivo suplementado con un 10% de suero fetal bovino y se centrifuga a 1400 r.p.m. durante 10 minutos. El pellet obtenido se resuspende en 2-3 ml de medio de cultivo y se procede al recuento celular obtenido en cada incubación con ayuda de una cámara de Neubauer.
El procedimiento se repitió hasta que no se obtuvieron más células de la muestra suspendiéndose entonces las incubaciones.
CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS UROEPITELIALES
De las células obtenidas en el procesamiento de la muestra se se-leccionaron aproximadamente la mitad de ellas para su siembra en un pocillo de cultivo celular de 6 cm2 de superficie en presencia de una capa alimentadora de 5 x 105 células 3T3 (fibroblastos de ratón irradiados letalmente (6000 rads), ECACC 85022108), lo que equivale a unas 8 x 104 células 3T3/cm2.
]]> Para la siembra celular se utilizó medio de cultivo para queratinocitos, cuya composición es a base de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Biochrom KG) y Ham F-12 (Biochrom KG) en proporción 3:1, suplementado con 10% de suero fetal bovino (Bio-chrom KG), 5 µ/ml de insulina (Sigma), 0,4 µ/ml de hidrocortisona (Sigma), 1,3 ng /ml de triyodotironina (Sigma), 8 ng /ml de toxina colérica (Sigma) y 24 µ/ml de adenina (Sigma).Las células epiteliales sembradas en este medio se mantuvieron en incubación en estufa de CO2 al 5% a 37°C.
El medio de cultivo fue reemplazado cada 72 horas; en el primer cambio se añadió al medio 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Austral Biologicals), repitiéndose la misma operación hasta que las células estuviesen próximas a la confluencia.
Cuando las células epiteliales fueron confluentes se trataron con tripsina /EDTA estéril para despegar las células de la superficie del frasco de cultivo.
Una vez individualizadas las células la tripsina fue neutralizada mediante la adicción volumen a volumen de medio de cultivo suplementado con un 10% de suero fetal bovino y se centrifugan a 1400 r.p.m. durante 10 minutos.
Elaboración de la submucosa
ARTIFICIAL
Cultivo primario de fibroblastos
Para el cultivo primario de fibroblastos se utilizaron la otra mitad de las células obtenidas inicialmente en el procesamiento de la muestra; en un principio se sembraron aproximadamente 105 células en un pocillo de cultivo celular de 6 cm2, en ausencia de células cebadoras 3T3.
]]> Como medio de cultivo se utilizó DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino. Los cultivos se mantuvieron en estufa de CO2 al 5% a 37°C.Obtención del gel de fibrina-fibroblastos
La fuente de fibrina se obtuvo a partir de plasma congelado procedente del banco de sangre.
Los geles para una placa de 66 cm2 de superficie se prepararon con:
]]> La mezcla se depositó en la estufa a 37°C con un 5% de CO2 entre 30 minutos y una hora para permitir el secado y coagulación de los geles; transcurrido este tiempo se añadió 10 ml de medio de cultivo para queratinocitos sin EGF.• 5 ml de plasma.
• 800-1200 fibroblastos /cm2.
• 0,66 mg /ml de ácido tranexámico (Amchafibrin®, Fides-Rottapharm).
• 1 ml de cloruro cálcico (Sigma) al 1% en suero fisiológico.
• Se completa con suero fisiológico hasta un volumen de 15 ml.
Para mejorar la consistencia y manipulación del tejido obtenido se puede utilizar una malla de poliglactin 910 (Vicril® Jhonson & Jhonson, Intl. Brussels, Belgium), la cual se coloca en una placa de Petri y sobre ella se deposita el gel esperando 24 horas hasta la realización del cultivo secundario; en este trabajo no utilizamos inicialmente el soporte para poder estudiar mejor la estructura conseguida.
CULTIVO SECUNDARIO DE CÉLULAS UROEPITELIALES SOBRE SUBMUCOSA ARTIFICIAL
Las células obtenidas en cultivo primario son lavadas con tripsina /EDTA estéril e incubadas a 37°C hasta conseguir que las células se despeguen, posteriormente se neutraliza la tripsina mediante la adicción volumen a volumen de medio de cultivo para queratinocitos. Se procede centrifugación a 1400 r.p.m. y el pellet obtenido se resuspende en 5-10 ml de medio de cultivo de queratinocitos sin EGF.
Estas células se siembran sobre la submucosa artificial transcurridas 24 horas de la elaboración de la misma, en ausencia de capa alimentadora de células 3T3. El medio de cultivo se cambió cada 72 horas y el control del cultivo se realizó mediante microscopio de luz invertida.
La estructura del tejido obtenido constaba por tanto de una capa de células uroepiteliales que descansan sobre una submucosa bioartificial compuesta de gel de fibrina y fibroblastos, a la que se puede añadir el soporte mediante la malla de ácido poliglicólico (Fig. 2).
Las células uroepiteliales sembradas sobre la submucosa bioartificial se mantuvieron en cultivo hasta alcanzar la confluencia, para posteriormente proceder a su estudio anátomo-patológico.
ESTUDIO ANÁTOMO-PATOLÓGICO
A las 24-48 horas de alcanzar las células la confluencia sobre la submucosa creada se procedió a su estudio histológico.
]]> Las muestras de tejido fueron fijadas en formol al 10% y sometidas al procesamiento habitual para ser incluidas en parafina y posteriormente teñidas con la técnica de hematoxilina-eosina.Se realizaron tinciones inmunohistoquímicas mediante el inmunoteñidor automático TechMate TM 500-520 (Biotech Solutions, Santa Bárbara, California, USA), utilizando los anticuerpos monoclonales: anticuerpo monoclonal Panqueratina (CK 22) (Dako® Glostrup. Dinamarca), anticuerpo monoclonal colágeno IV (C IV) (Dako® Glostrup. Dinamarca), anticuerpo monoclonal laminina. (Dako® Glostrup. Dinamarca).
Resultados
CULTIVO IN VITRO DE MUCOSA VESICAL HUMANA
RECOLECCIÓN CELULAR
Las muestras se procesaron siguiendo el mismo método de disgregación celular enzimática, obteniéndose un número suficiente de células para su expansión en cultivo primario. (Tabla 1)
Destinamos la mitad de las células procedentes del tratamiento de la muestra para su cultivo primario y la otra mitad para cultivo primario de fibroblastos al observar un rápido crecimiento de las células uroteliales, bastante superior al presentado por queratinocitos humanos en las mismas condiciones de cultivo.
CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS UROEPITELIALES HUMANAS
Se pudo apreciar el inicio de la formación de colonias uroepiteliales aproximadamente hacia el 4º día de cultivo, siendo aún predominantes las células 3T3, las cuales progresivamente a lo largo de los días de cultivo fueron rechazadas a la periferia hasta llegar a desaparecer cuando el cultivo fue confluente (Fig. 3).
]]>
Los cultivos primarios de las células alcanzaron la confluencia entre los 10 y 13 días (Tabla 1).
CULTIVO SECUNDARIO SOBRE GEL DE FIBRINA-FIBROBLASTOS
Elaboración del gel de fibrina
Los geles de fibrina se elaboraron a partir de plasma congelado disponible en cualquier banco de sangre (Fig. 4).
Los fibroblastos fueron obtenidos mediante el cultivo primario de aproximadamente la mitad de las células conseguidas en el procesamiento de las muestras, utilizando como medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino, manteniendo los cultivos en estufa de CO2 al 5% a 37°C, en ausencia de células 3T3; en estas condiciones de cultivo únicamente se obtiene una proliferación fibroblástica en los medios (Fig. 5).
No hubo problema en la confección de las submucosas en ninguno de los casos.
Cultivo secundario
]]> El cultivo secundario se realizó al alcanzar la confluencia el cultivo primario (10-13 días) y 24 horas después de haberse elaborado la submucosa.En esta caso no utilizamos la malla de ácido poliglicólico para mejorar la consistencia al no ser injertado el tejido posteriormente por lo que la submucosa constaba de gel de fibrina y fibroblastos.
La confluencia celular de los cultivos secundarios se alcanzó entre 10 y 13 días, de forma tal que el tiempo necesario para la obtención de una mucosa bioartificial completa osciló entre 22 y 26 días (Tabla 1).
En ninguno de los cultivos realizados se apreció retracción significativa del gel de fibrina.
ESTUDIO HISTOMORFOLÓGICO
El aspecto histológico de los cultivos era inicialmente el de una monocapa de células de estirpe epitelial que descasan sobre un estroma fibrinoide con presencia de fibroblastos. (Fig. 6 y 7).
Manteniendo las condiciones de cultivo en días sucesivos se pudo apreciar en algunas zonas un epitelio pseudoestratificado, mostrando las células una apariencia reactiva, con núcleos agrandados y nucleolos eosinófilos prominentes, observándose en ocasiones células multinucleadas, aumentando el número de capas celulares (Fig. 8 y 9).
La morfología celular parecía corresponder a un epitelio; en determinadas zonas fue posible identificar una cierta pseudoestratificación celular que recordaban en algún modo el aspecto histológico característico de un epitelio de transición inmaduro (Fig. 10).
Todas las inmunotinciones realizadas resultaron negativas, exceptuando una muy leve y no significativa positividad para citoqueratinas en alguna de las muestras, sin encontrarse estructura alguna que se tiñese para colágeno IV o laminina.
Por tanto parece factible la aplicación de las técnicas de cultivo de queratinocitos a otro tipo de epitelio como es el transicional, en este caso humano, obteniéndose un tejido tridimensional, dotado de una submucosa (fibrina y fibroblastos) con capacidad presumiblemente para madurar y apto para trasplantar.
Por último señalar el difícil manejo del tejido obtenido por la frágil consistencia del mismo debido a su constitución; este inconveniente es fácilmente solucionable utilizando como soporte un polímero biodegradable que permitirá la manipulación del tejido y favorecerá su posterior injerto, como ya utilizamos experimentalmente en el conejo19.
Discusión
En base a los principios del cultivo celular introducidos por Reinwald y Green20 en 1970, a la amplia experiencia existente con el cultivo de queratinocitos21-26 y a los extensos trabajos sobre ingeniería tisular urológica2-5,14-16,18 pretendimos diseñar un tejido urotelial tridimensional in vitro apto para su trasplante.
Procedimos a la recolección celular utilizando el método de disgregación celular enzimática, abandonando los métodos de explante celular o dispersión mecánica, obteniendo en todos los casos un número adecuado de células viables, factor de especial importancia para asegurar el éxito del cultivo celular posterior14,15,27,28.
]]> Para el cultivo primario se utilizó una capa de células alimentadoras o cebadoras a base de fibroblastos de ratón letalmente irradiados (células 3T3), debido a la capacidad de las mismas para estimular el crecimiento, diferenciación y adhesión de las células epiteliales así como de secretar factores de crecimiento y proteínas de matriz extracelular29-33. Existen autores15,27,34,35 que prescinden de la utilización de esta capa argumentando que el uso de células heterólogas cuya genética ha sido alterada, pudiesen interferir en el control de la replicación de las células epiteliales. La amplia experiencia existente con el uso de estas células descarta esta opción y hasta el momento no hay referencia alguna sobre este tipo de alteraciones, por otra parte en el momento que las células epiteliales confluyen y forman una capa continua, ya no es posible demostrar la presencia de fibroblastos. Lauer36 estudia en cultivo células epiteliales tumorales de cavidad bucal demostrando que los fibroblastos de ratón son incapaces de inducir cambios degenerativos en líneas celulares premalignas en cultivo.Se utilizó un medio de cultivo para queratinocitos, usando de igual manera factor de crecimiento epidérmico (EGF) de comprobada eficacia para el desarrollo de los queratinocitos in vitro. En el caso del urotelio su acción es más controvertida, siendo para algunos autores el crecimiento del mismo independiente de dicho factor16,27,37, para otros38,39 sólo concentraciones elevadas (50ng/ml) inducen cambios morfológicos de diferenciación celular y según otros40,41 existirían EGF-likes (factor de crecimiento transformador-a, anfiregulina, EGF-like inhibidor de heparina...) que pudiesen regular el crecimiento y diferenciación de las células uroepiteliales por mecanismos autocrinos o paracrinos no bien conocidos42,43.
Los tejidos obtenidos mediante las técnicas de cultivo in vitro mostraban un predominio de células de aspecto basal, inmaduras e indiferenciadas, con una débil o nula respuesta a citoqueratinas en parte debido a esa inmadurez y al retraso de la misma sufrido por las células por el cultivo en inmersión44,45.
Por otra parte, el estudio inmunohistoquímico para los anticuerpos colágeno IV y laminina resultaron negativos, no pudiendo identificar ninguna estructura compatible con una membrana basal; probablemente las complejas y desconocidas interacciones entre las células trasplantadas y la matriz extracelular del receptor, mediadas por factores de crecimiento y proteínas de dicha matriz puedan contribuir al desarrollo de dicha membrana basal46-48, favoreciendo además el desarrollo y diferenciación celular.
Estudios recientes sobre el cultivo in vitro de queratinocitos45,49-51 apuntan hacia la creación de una dermis bioartificial que sirva de soporte a las células epiteliales facilitando además su crecimiento y diferenciación, creándose así una estructura tridimensional.
Fujiyama44 diseña una mucosa vesical tridimensional in vitro estableciendo la importancia de las interacciones, aún desconocidas, entre fibroblastos, matriz extracelular y células uroteliales, siendo dichas relaciones básicas para la reconstrucción e histodiferenciación del urotelio. De esta forma crea un tejido tridimensional conformado por una capa epitelial sobre una lámina propia bioartificial compuesta de gel de colágeno y fibroblastos; el tejido creado pudo mantenerse con las características de un epitelio polarizado y bien diferenciado hasta dos meses, trascurridos los cuales, la invariable contracción experimentada por el colágeno hizo inviable la mucosa.
El colágeno ha sido ampliamente utilizado como vehículo de transporte de células uroteliales cultivadas, si bien el inconveniente de la retracción que acontece con el mismo ha limitado bastante su aplicación44,45.
Basándose en la experiencia del cultivo de queratinocitos sobre matrices de fibrina51-53, se plantea la posibilidad de utilizar estos geles como soporte para el cultivo de células uroepiteliales.
Varios autores como Wechselberger54-56, Schoeller57,58, Schaefer59 o Bach60 han conseguido expandir en cultivo con éxito células uroteliales sobre matrices de fibrina, constituyendo esta proteína un adecuado soporte orgánico, no sólo físico, sino como una matriz adecuada para el desarrollo y diferenciación celular.
Uno de sus componentes fundamentales, la fibronectina, resulta a su vez uno de los constituyentes más importantes de las membranas basales de reconocida trascendencia para los epitelios54,61.
]]> Por otra parte se ha demostrado que los fibroblastos cultivados en el seno de geles de fibrina inducen una rápida reorganización de las fibrillas que los rodean, las cuales se reorientan en haces paralelos a la superficie del cultivo, al igual que los fibroblastos, de esta forma la contracción que experimenta el gel se produce en espesor pero no en diámetro, contrariamente a lo que sucede con los geles de colágeno.Staack62 pone de manifiesto la importancia de los fibroblastos en el crecimiento y diferenciación de las células uroepiteliales en cultivo, atribuyéndose la acción de los mismos a la secreción de un factor soluble no identificado probablemente especie y órgano-específico.
La fibrina para realizar los cultivos se puede obtener a partir de preparados comerciales o a partir de plasma procedente de crioprecipitados.
Los preparados comerciales presentan el inconveniente de sufrir un procesamiento con calor, que puede afectar a proteínas (factor VIII, factor XIII, fibronectina) y factores de crecimiento presentes en los crioprecipitados, que pueden resultar beneficiosos para el desarrollo de los cultivos.
De esta forma se pudo diseñar una submucosa bioartificial conformada por un gel de fibrina y fibroblastos, sobre la cual se realizó el cultivo secundario de las células uroepiteliales, obteniéndose así una estructura tridimensional.
Debido a las dificultades presentadas para el manejo del tejido es conveniente dotar a la estructura de un soporte físico mediante una malla de ácido poliglicólico que nos permita manipular el tejido obtenido in vitro sin dificultad alguna y a su vez la biodegradación de dicho polímero provocará una respuesta angiogénica en el huésped, útil para la superviviencia del injerto una vez trasplantado15,63-66.
Conclusiones
En el presente trabajo pudimos demostrar la posibilidad de aplicar las técnicas de cultivo de tejidos, como habíamos probado en el animal de experimentación, al urotelio humano, reconstruyendo tridimensionalmente in vitro muestras de mucosa vesical.
Por una parte se procedió a diseñar un tejido subepitelial bioartificial compuesto por gel de fibrina y fibroblastos, que actuase a modo de lámina propia, la cual por su composición facilitaría el crecimiento y diferenciación de las células uroepiteliales y a su vez proporcionaría mayor consistencia a la lámina epitelial, sin experimentar retracciones como sucede con el colágeno.
]]> Como consecuencia de los importantes problemas a la hora de manipular los tejidos obtenidos in vitro por su escasa consistencia, dada su constitución exclusivamente epitelial, se puede utilizar como soporte del cultivo una malla de ácido poliglicólico, la cual proporciona un excelente "andamiaje" al tejido cultivado obtenido facilitando enormemente su manejo, siendo posible configurar con ella diferentes formas (lámina, tubo, esfera), fenómeno interesante en la cirugía reconstructiva.Actualmente la experiencia existente dentro del cultivo in vitro de urotelio se basa en el cultivo y siembra de las células uroepiteliales disgregadas sobre polímeros biodegradables o sobre matrices orgánicas (colágeno, fibrina), para posteriormente ser devueltas al organismo donante.
Con nuestro procedimiento, desarrollamos una estructura tridimensional in vitro, previo al injerto, combinando los principios del cultivo celular al dotar al tejido de una submucosa artificial, y los de la ingeniería tisular, asociado un polímero biodegradable que sirva de soporte al cultivo, permitiendo su manipulación y facilitando su posterior injerto.
Agradecimientos. Mostrar una vez más mi agradecimiento al Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de Asturias, donde pudimos desarrollar las técnicas de cultivo de tejidos, así como a la colaboración obtenida de la Sociedad Cántabra de Urología.
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Dirección para correspondencia:
Dr. E. de Diego Rodríguez
Miguel de Unamuno, 6 - 5º B
39012 Santander (Cantabria)
Trabajo recibido el 19 de octubre 2005
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