Expresión inmunohistoquímica de p53, p21, p16 y Ciclina D1 en el cáncer de vejiga superficial. Estudio en un soporte de tissue microarray

Immunohistochemical expression of p53, p21, p16, and cyclin d1 in superficial bladder cancer. A tissue microarray study

Vallmanya Llena F.R., Laborda Rodríguez A., Lloreta Trull J.*, Cortadellas Ángel R., Placer Santos J., Gelabert Mas A.

Servicio y Cátedra de Urología. *Servicio de Anatomía Patológica. Hospital del Mar. Universitat Autónoma de Barcelona-Universitat Pompeu Fabra. Barcelona.

Trabajo financiado por el FIS, proyecto PI: 02/0468.

Dirección para correspondencia

RESUMEN

Introducción y objetivos: Evaluar, de forma retrospectiva, la relación entre la expresión inmunohistoquímica de p53, p21, p16 y ciclina D1, con la recurrencia, progresión tumoral y supervivencia en los carcinomas vesicales superficiales.
Métodos: 163 pacientes sometidos a resección transuretral de tumor vesical superficial entre febrero de 1995 y marzo de 2004. Las muestras tumorales evaluadas estaban contenidas en un soporte de tissue microarray, al que se le realizaron varias secciones consecutivas para tinción inmunohistoquímica.
La asociación del grado y estadio tumoral con los marcadores se valoró según el test de Chi-cuadrado y para valorar la relación con la recurrencia, progresión y supervivencia se utilizaron las curvas de Kaplan-Meier y se compararon con el log-rank test.
Resultados: No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de los marcadores según el grado y estadio tumoral a excepción de la Ciclina D1, que sí mostraba diferencias significativas según el estadio tumoral (p=0,030).
La expresión de p21 se relacionó con la recurrencia tumoral (p=0,035), progresión (p=0,008) y supervivencia (p=0,034). La expresión de p16 también se relacionó con la recurrencia (p=0,048) y supervivencia (p=0,047), pero no con la progresión tumoral (p=0,116).
La expresión de p53 y ciclina D1 no mostraron asociación estadísticamente significativa con la recurrencia y progresión tumoral ni con la supervivencia.
Conclusiones: En nuestra experiencia, sólo los marcadores p16 y p21 pueden ser útiles en el manejo de los tumores vesicales superficiales por ser predictores de recurrencia y supervivencia en pacientes con estadios Ta y T1.

ABSTRACT

Introduction and objectives: To retrospectively assess the relationship between immunohistochemical expression of p53, p21, p16, and cyclin D1, with recurrence, progression and survival in superficial bladder cancer.
Methods: 163 patients undergoing transurethral resection for superficial bladder cancer between February 1995 and March 2004. Tumor samples were included in a tissue microarray support that was serially sectioned for immunohistochemical staining.
Grade and stage associations for each marker were evaluated by the Chi-square test. Assessment of the relationship with recurrence, progression, and survival Kaplan-Meier curves and log-rank test were used.
Results: There were no statistically significant differences in marker expression depending on tumor grade and stage, with the exception of Cyclin D1, that was significantly different depending on tumor stage (p=0.030).
p21 expression was related to tumor recurrence (p=0.035), progression (p=0.008) and survival (p=0.034). p16 expression was also related to recurrence (p=0.048) and survival (p=0.047), but not to tumor progression (p=0.116).
p53 and Cyclin D1 were not statistically associated with tumor recurrence, progression or survival.
Conclusions: In our experience, only p16 and p21 may be useful in the management of superficial bladder tumors, as they are predictors of recurrence and survival in Ta and T1 patients.

Key words: Cyclin D1. p53. p21. p16. Urothelial Carcinoma. Tissue Microarray.

La carcinogénesis y la progresión tumoral son el resultado del acumulo de múltiples alteraciones genéticas: activación de oncogenes, deleción de regiones cromosómicas e inactivación de genes supresores tumorales¹. La sobreexpresión y las alteraciones en las proteínas codificadas por estos genes, producen alteraciones en el control del ciclo celular.

La p53 es una proteína involucrada en la regulación del ciclo celular. Actúa a nivel del paso de G1 a S y cuando se activa induce apoptosis en respuesta a la alteración del DNA. La p53 media su efecto en parte a través de la p21 y por ello se estudian normalmente de forma conjunta.

La p21 tiene efecto p53 dependiente y p53 independiente, y este último inhibe a su vez a ciclina-kinasas dependientes (CDKs), deteniendo el ciclo celular al inhibir la replicación de DNA^2,3,4.

Las CDKs son facilitadoras de la progresión del ciclo celular y también actúan en el paso de G1 a S, por lo que sus inhibidores pueden bloquear la progresión del ciclo celular.

La proteína p16 es un inhibidor de CDKs y compite por la unión de la ciclina D con CDK4 y CDK6, que a su vez tiene efecto sobre la función de pRb⁵. Cuando se une a las CDKs, la p16 inhibe la fosforilación de pRb inactivándolo, deteniéndose así el ciclo celular.

En el carcinoma urotelial (CU) de vejiga la expresión de p53 es el predictor más importante entre los marcadores, seguido por la de p21, sugiriendo que esta vía es la más importante para la progresión². La pérdida de p16 es a menudo un evento crítico en la progresión de muchos tumores⁶. Hasta la fecha, de los estudios que hay publicados, pocos demuestran una asociación estadísticamente significativa de la expresión de p16 con el pronóstico en el CU cuando se estudia de forma individual^7,8.

No sucede así en la expresión de ciclina D1 en el CU, que se ha estudiado más que la expresión de p16. La mayoría de estudios coinciden en que es un predictor importante de supervivencia^9,10.

En el presente estudio se pretende evaluar la relación existente de los factores pronósticos de recurrencia, progresión y supervivencia con la expresión inmunohistoquímica de p53, p21, p16 y ciclina D1.

Material

Se estudiaron un total de 187 carcinomas uroteliales, procedentes del archivo de registro de tumores del Servicio de Urología. Se seleccionaron los tumores obtenidos entre 1995 y 2004, que habían sido informados como estadios pTa y pT1, grados 2 y 3 según clasificaciones de la OMS de 1973 (casos desde 1995 hasta 1998) y de la OMS/ISUP de 1999 (los casos posteriores). Todos los casos fueron reevaluados por el mismo uro-patólogo siguiendo los criterios de la OMS de 2004, objetivándose discrepancia por sobrevaloración del grado en 27 de los tumores clasificados como G2 en el dictamen histórico, etiquetados de tumores de bajo grado actualmente. El cómputo final fue, por lo tanto, de 160 tumores de alto grado y 27 tumores de bajo grado, 86 tumores pT1 y 101 tumores pTa.

Construcción de TMA

De los 187 bloques de parafina archivados, se seleccionaron las áreas más representativas de cada tumor obteniéndose un cilindro. De los casos más heterogéneos, y de los casos en que existía poca representación tumoral se obtuvieron 2 e incluso 3 cilindros, con el fin de no perder información histológica relevante. Se construyó un soporte de micromatrices tisulares (tissue microarray, TMA) formado por 231 cilindros de 0,6 milímetros de diámetro cada uno (Fig. 1). Se incluyeron de forma aleatoria 10 cilindros de otros tejidos para control, que sirvieron además para la orientación de la lectura y el análisis.

Inmunohistoquímica

Se realizaron varias secciones consecutivas del bloque de parafina; cuatro se utilizaron para tinción inmunohistoquímica con anticuerpos (Ac) para p53 (DO7, Novocastra, Reino Unido, dilución 1:50), p21 (anti p21^waf1 SX118, DakoCyto-mation, Dinamarca, dilución 1:25), p16 (p16^INK4a EGH4, DakoCytomation, Dinamarca, prediluido) y ciclina D1 (DCS-6, DakoCytomation, Dinamarca, dilución 1:25). La visualización de la reacción inmunohistoquímica se hizo mediante el sistema de polímeros de dextrano conjugados con anticuerpo secundario (Envision, DakoCytomation, Dinamarca), seguido de revelado con diaminobencidina. Para cada anticuerpo, se utilizaron controles positivos y negativos adecuados, a partir de líneas celulares y tejidos tumorales.

La lectura de la expresión en cada campo se hizo midiéndose el porcentaje de células teñidas a intensidad alta (++,+++/+++) y fue realizada por tres observadores, sin conocimiento de la evolución clínica del tumor, y en los casos en que existía discrepancia se llegó a solución de consenso.

El punto de corte, para considerar la expresión de p53, p21 y ciclina D1 como positivos o negativos, se estableció en el 10% y para p16 se estableció en el 15%, haciendo varias estimaciones para buscar el punto de corte con la máxima potencia estadística para cada marcador. Los puntos de corte seleccionados coincidían con los más frecuentemente utilizados en la literatura para cada molécula.

Selección de casos

Con intención de homogeneizar la serie, sólo se incluyeron en el estudio 163 tumores (22 de bajo grado, 141 de alto grado; 94 Ta y 69 T1) de pacientes afectos de tumor vesical superficial sometidos a resección transuretral (RTU) de vejiga entre febrero de 1995 y marzo de 2004. Todos ellos fueron tumores iniciales y realizaron instilaciones intravesicales con quimioterapia o Bacillus Calmette-Guérin (BCG) según el protocolo del momento en nuestro servicio. Los casos excluidos, así como los criterios de exclusión, se muestran en la Tabla 1.

Análisis estadístico

Mediante el programa estadístico (SPSS, Inc., USA) se determinó la relación de los cuatro marcadores con el grado y estadio anatomopatológico y su relación con la recurrencia, progresión tumoral y supervivencia. Se consideró que existían diferencias estadísticamente significativas cuando p <0,05.

La asociación del grado y estadio tumoral con los marcadores se valoró según el test no paramétrico de Chi-Cuadrado y para valorar la relación con la recurrencia, progresión y supervivencia se utilizó las curvas de Kaplan-Meier y el log-rank test. Las variables significativas fueron incluidas en el análisis multifactorial que se realizó con un modelo de riegos proporcionales de Cox.

Resultados

163 pacientes (138 hombres, 25 mujeres), con una media de edad de 69,06 años (rango, 41- 91 años). La media de seguimiento fue de 45 meses (rango 1-127 meses). 97 pacientes presentaron recurrencia tumoral (59,9%), 34 presentaron progresión tumoral (20,9%) y 20 (12,3%), tuvieron muerte enfermedad-específica.

No se encontró relación estadísticamente significativas de la expresión de p53, p21, p16 y ciclina D1 con el grado tumoral (p=0,497, p=0,362, p=0,205 y p=0,668 respectivamente).

Según estadio, sólo se encontró significación estadística con la expresión de ciclina D1 (p=0,030) (Tabla 2).

Asociación de la expresión de p53, p21, p16 y ciclina D1 con la recurrencia y progresión tumoral y la supervivencia

En cuanto a la relación de los marcadores con la recurrencia, progresión tumoral y supervivencia, sólo la expresión de p21 y p16 mostraron asociación significativa (Tabla 3).

Expresión de p21

Las curvas de Kaplan-Meier mostraron que cuando la expresión de p21 era < al 10%, estado alterado, el tiempo medio de recurrencia era de 17 meses, mientras que cuando la expresión de p21 era >10%, p21 positiva, el tiempo medio de recurrencia era de 43 meses.

Así, de los 96 casos con expresión de p21 alterada, 64 (66,7%) presentaron recidiva tumoral y 32 (33,3%) no. En contraposición, de los 66 casos con expresión de p21 positiva, 33 (50%) presentaron recidiva tumoral y 33 (50%) no. La asociación resultó estadísticamente significativa (p= 0,035).

De los 96 casos con expresión de p21 alterada, 27 (28,1%) presentaron progresión tumoral y 69 (71,9%) no. De los 66 casos con expresión p21 positiva, 7 (10,6%) presentaron progresión tumoral y 59 (89,4%) no. La asociación resultó estadísticamente significativa (p=0,008).

En cuanto a la supervivencia, de los casos con expresión de p21 alterada, 16 (16,7%) presentaron muerte enfermedad-específica y 80 (83,3%) no. De los casos con p21 positiva, 4 (6,1%) presentaron muerte enfermedad-específica y 62 (93,9%) no. La asociación también resultó estadísticamente significativa (p= 0,034) (Figs. 2a, 2b y 2c).

Expresión de p16

Las curvas de Kaplan-Meier mostraron que cuando la expresión de p16 era < al 15%, estado alterado, el tiempo medio de recurrencia era de 23 meses, mientras que cuando la expresión de p16 era >15%, p16 positiva, el tiempo medio de recurrencia era de 53 meses.

De los 114 casos con expresión de p16 alterada, 75 (65,8%) presentaron recidiva tumoral y 39 (34,2%) no. De los 48 casos con expresión de p16 positiva, 22 (45,8%) presentaron recidiva tumoral y 26 (54,2%) no. La asociación resultó estadísticamente significativa (p=0,048).

De los casos con expresión de p16 alterada, 18 (15,8%) presentaron muerte enfermedad-específica y 96 (84,2%) no. De los casos con expresión de p16 positiva, 2 (4,2%) presentaron muerte enfermedad-específica y 46 (95,8%) no. La asociación resultó estadísticamente significativa (p=0,047).

No existió asociación estadísticamente significativa entre la expresión de p16 y la progresión tumoral (p=0,116) (Figs. 3a, 3b y 3c).

Finalmente, p21 y p16 fueron incluidas en el análisis multifactorial que se realizó con un modelo de riesgos proporcionales de Cox, pero se perdía la significación de ambos parámetros.

Discusión

Existe gran discrepancia e incluso posturas enfrentadas en la valoración de los resultados obtenidos, en los distintos estudios publicados en los que se realiza un análisis inmunohistoquímico de la expresión de p53, p21, p16 y ciclina D1 en el cáncer superficial de vejiga. Este hecho puede ser debido a la variabilidad de las cohortes tumorales estudiadas (tumores no invasivos, invasivos o ambos) y a las distintas técnicas inmunohistoquímicas utilizadas¹¹. Otros motivos de discrepancia se deben fundamentalmente a la diversidad metodológica utilizada tanto en el proceso de inmunotinción como en su posterior valoración¹². Estas controversias limitan la comparación entre estudios.

Respecto al proceso de inmunotinción, constituyen factores de perturbación los distintos medios en los que está fijada la muestra (congelada, formalina, etc.) así como la calidad de la fijación, los métodos de recuperación del antígeno (calentamiento en microondas, autoclave, recuperación enzimática, etc.) y el tipo de anticuerpo empleado (monoclonales o policlonales, de distintas clonas y calidades, etc.)^13,14.

A la hora de valorar el resultado de la lectura de un estudio inmunohistoquímico deben tenerse en cuenta también la existencia de diferencias inter- e incluso intra-observador, así como los distintos criterios de evaluación aplicados.

En función de cual sea el umbral que se establezca para considerar como positiva la expresión inmunohistoquímica de un antígeno, existen diferencias muy dispares en la expresión según el grado y estadio. Es por ello, que existen trabajos en los que los autores ofrecen resultados cuyos análisis estadísticos muestran índices significativamente diferentes y en cambio en otros trabajos los autores no hallan diferencias.

Una pequeña muestra, a modo de ejemplo, de los distintos puntos de corte utilizados por algunos autores para considerar la expresión positiva o alterada de p53 son >10%^{2 ,8,15}, >5%¹⁶ y 40%^13. Para p21, se ha considerado inmunorreactividad nuclear negativa o estado alterado las expresiones al 10%^2,3,8,15, <5%¹⁶ y 20%¹³. Para p16, el punto de corte es <10%^7,11 o > 50%^5,8 y finalmente el punto de corte para inmunorreactividad positiva de ciclina D1 ha sido de >10 %^17,18, >25%⁹ y >5%¹⁹ entre otros.

Shariat et al, concluyen que la expresión alterada de p53 se relaciona con el grado y estadio, mientras que la expresión de p21 alterada se asocia al grado, pero no tiene relación con el estadio tumoral⁸. Por el contrario, Chatterjee et al, concluyen que la expresión de p53 alterada está relacionada con el estadio, pero no con el grado tumoral y que la expresión de p21 se relaciona con el estadio tumoral pero no con el grado².

Stein et al, objetivaron la pérdida de tinción para p21 en tumores de vejiga de alto grado y estadio³.

Shariat et al, de nuevo, concluyen que p16 se asocia al estadio tumoral aunque no al grado⁸. Krüger et al, no encuentran en su estudio asociación ni con el grado, ni con el estadio tumoral¹¹.

Liukkonen et al, observaron que la expresión de ciclina D1 se asociaba de forma inversa con el estadio pT¹¹. Sin embargo, Sgambato et al, concluyen en su estudio que la expresión de ciclina D1 no se asocia ni al grado ni al estadio tumoral⁹ y los resultados de Tut et al, indican que la expresión de ciclina D1 es significativamente mayor en pacientes con estadios bajos y en tumores bien diferenciados²⁰.

En nuestro estudio sólo la ciclina D1 se ha asociado al grado tumoral, y ninguna de las moléculas estudiadas se ha asociado al estadio.

Debemos mencionar que inicialmente se seleccionaron tumores grado 2 y 3 de la clasificación OMS de 1973. De ellos sólo 22 eran de bajo grado tras revisión y estadificación según criterios de la OMS del 2004. En este sentido, nuestra serie presenta una proporción relativamente menor de lo habitual en el número de tumores superficiales de bajo grado o de bajo potencial de malignidad. El objetivo fundamental de nuestro estudio, no obstante, se centraba en la relación entre la expresión de moléculas relacionadas con el ciclo celular (p53, p21, p16 y ciclina D1) y la recurrencia, la progresión tumoral y la supervivencia.

Pfister et al, utilizando la expresión de p53 y p21 junto a otros marcadores como factores predictivos de recurrencia del tumor vesical superficial, no encontraron asociación entre la presencia de p21 negativa y mayor recurrencia¹⁶.

Queipo et al, observaron que los pacientes que presentaban expresión de p53 positiva tuvieron un tiempo libre de progresión significativamente menor que aquellos con p53 negativa, sin apreciar diferencias en el tiempo libre de recidiva ni en el tiempo de supervivencia. Por otra parte, para p21 no obtuvieron diferencias significativas en ninguno de los análisis¹³.

Malats et al, en un reciente metanálisis en que se realizan una revisión de 168 publicaciones correspondientes a 117 estudios, concluyen que no existe suficiente evidencia para afirmar que la expresión de p53 se relacione con la recurrencia, la progresión tumoral ni la supervivencia²¹.

Krüger et al, concluyeron que existe una correlación estadísticamente significativa entre la pérdida de expresión de p16 y progresión tumoral en el CU estadio pT1¹¹.

En cambio hay otros estudios que no encuentran asociación entre la expresión de p16 y la progresión tumoral^22-24.

Liukkonen et al, en un estudio realizado con pacientes afectos de cáncer de vejiga superficial, observaron que la expresión de ciclina D1 no tenía significación pronóstica¹⁸. En cambio Sgambato et al, concluyen en su estudio que la expresión elevada de ciclina D1 supone de manera significativa un mayor tiempo libre de progresión tumoral⁹ y a la misma conclusión llegan López-Beltrán et al, en un estudio realizado con tumores G3T1¹⁰. También Tut et al, indican que la expresión de ciclina D1 es un factor pronóstico independiente en la supervivencia de estos pacientes²⁰. Otros estudios tienen resultados dispares en cuanto a supervivencia en tumores uroteliales pTa y pT1^10,25.

En nuestro estudio sólo la expresión de p21 muestra relación con la recurrencia, progresión tumoral y supervivencia enfermedad-específica. Una expresión negativa o reducida implica un peor pronóstico. También hemos observado una asociación estadísticamente significativa entre la expresión de p16, la recurrencia tumoral y la supervivencia, pero no con la progresión tumoral. En cuanto a la expresión de p53 y ciclina D1, tampoco nosotros hemos observado relación estadísticamente significativa con la recurrencia, la progresión tumoral ni la supervivencia.

Una característica especial de nuestro estudio es que se ha llevado a cabo no en secciones completas de todo el tumor, sino en varias pequeñas muestras de cada tumor, obtenidas con un cierto margen de azar (selección en el bloque de parafina a partir de marcas de las áreas representativas sobre la preparación microscópica correspondiente) y que representan una proporción baja del volumen total del tumor. Este diseño, que podría suponer que las muestras fueran menos valorables, obvia este inconveniente incluyendo varias muestras de cada caso y, por otro lado, permitiendo estudiar con máxima rapidez y eficacia un gran número de tumores. Cuando hay que hacer una valoración semicuantitativa de positividades, el empleo de micromatrices tisulares, en las que se tiñen todas las muestras por igual, supone una mayor homogeneidad en los resultados de la inmunohistoquímica. Por otro lado, con un diseño basado en micromatrices tisulares, se está analizando también la aplicabilidad de las moléculas estudiadas a biopsias de muy pequeño tamaño, de las que el TMA puede considerarse en cierto modo una simulación.

Conclusiones

En el presente estudio, utilizando micromatrices tisulares preparadas a partir de biopsias por resección transuretral de carcinomas superficiales de vejiga, sólo los marcadores p21 y p16 contribuyen a identificar a pacientes con alto riesgo y pueden ser de utilidad en el manejo de los tumores vesicales superficiales, ya que ayudan a predecir la supervivencia en pacientes con estadios Ta y T1.

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Dirección para correspondencia:
Dr. F.R. Vallmanya Llena ]]> Pla de Monsó nº 6
25110, Alpicat (Lleida)
E-mail: fvallmanya@imas.imim.es

Trabajo recibido el 6 de febrero de 2006