Evaluación de la expresión de la subunidad p22 phox de la NADPH oxidasa (NOX) en cáncer de próstata e hiperplasia prostática benigna: estudio comparativo
Evaluation of the expression of p22 phox subunit of NADPH oxidase (NOX) in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia: A comparative study
E. Floriano-Sáncheza, M. Castro-Marínc, N. Cárdenas-Rodríguezb y E. Lara-Padillad
aDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular, Escuela Médico Militar, México D.F.
bLaboratorio de Neuroquímica, Instituto Nacional de Pediatría, México D.F.
cServicio de Urología, Hospital Central Militar, México D.F. ]]>
dSección de Estudios de Posgrado e Investigación, Escuela Superior de Medicina, Instituto Politécnico Nacional, México D.F.
Dirección para correspondencia
RESUMEN
Introducción y objetivo: Recientes reportes ubican que el cáncer de próstata es el segundo cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres.
Métodos y resultados: Se obtuvieron 62 muestras (30 de pacientes con cáncer y 32 de pacientes con hiperplasia) colectadas desde enero de 2004 a diciembre de 2007. Se llevó a cabo un estudio clínico, experimental, transversal, comparativo y descriptivo. Se cumplieron los criterios de inclusión (diagnóstico de cáncer o hiperplasia), exclusión (pacientes que no autorizaron a participar en el estudio o no candidatos a la resección prostática) y de eliminación (tejidos dañados). Se detectó por inmunohistoquímica la presencia de la subunidad p22 phox de la NADPH oxidasa en pacientes con cáncer de próstata e hiperplasia prostática a partir de la formación del complejo avidina-biotina en presencia de diaminobenzidina como colorante de contraste. El análisis estadístico fue determinado con la prueba t de student (software Graph Prism 3.0) considerando una p<0,05 para diferencias estadísticas. Los resultados de la inmunorreactividad de p22 phox en estroma y glándula de la próstata mostraron un incremento en el cáncer de próstata (8,45±3,6 y 25,08±7,5% p<0,0001, respectivamente) en comparación con los resultados encontrados para hiperplasia prostática (4,8±2,8 y 6,7±3,1% p<0,0001, respectivamente).
Conclusiones: La sobreexpresión de NADPH oxidasa se encuentra involucrada en el cáncer de próstata. Además, sugerimos que la NADPH oxidasa, en combinación con otros marcadores clásicos, podría funcionar como un indicador para el monitoreo postoperatorio de pacientes diagnosticados con hiperplasia u otras patologías menores de la próstata.
Palabras clave: Cáncer de próstata. Hiperplasia prostática benigna. Especies reactivas de oxígeno. p22 phox. NAPH oxidasa.
ABSTRACT
]]> Introduction and objective: Recent reports found that prostate cancer is the second most common cancer and second leading cause of cancer death in men.Key words: Prostate cancer. Benign prostatic hyperplasia. Reactive oxygen species. p22 phox. NADPH oxidase.
Introducción
La próstata es el órgano masculino que con mayor frecuencia padece procesos benignos o malignos tal como el cáncer o la hiperplasia. El número de hombres con cáncer de próstata (CaP) se ha incrementado en las últimas 2 décadas como resultado del envejecimiento de la población a nivel mundial1-3.
Se sabe que el estrés oxidante interviene en el desarrollo del CaP. El estrés oxidante es un desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y las defensas antioxidantes que puede presentarse por una producción excesiva de las ERO, por disminución de las defensas antioxidantes o combinación de ambas4. Algunas ERO, tal como el radical superóxido (O2•-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), se encuentran en una gran cantidad de tumores y en altos niveles pueden inducir muerte celular, apoptosis, senescencia y angiogénesis5.
La NADPH oxidasa (NOX) está compuesta por un complejo anclado en la membrana (proteína glucosilada gp91 phox y no glucosilada p22 phox) y 3 componentes citosólicos (p47 phox, p67 phox, p40 phox). Esta enzima juega un importante rol en el mantenimiento del balance celular de ERO ya que es una de las principales fuentes de O2•-. El radical O2•-, a su vez, puede convertirse más tarde en otras ERO aunque la mayor parte dismuta hacia H2O2, principalmente por acción de la enzima mieloperoxidasa5.
Por otro lado, existen varios estudios donde se ha demostrado el papel de la NOX en cáncer de ovario y colon y únicamente en líneas celulares de CaP. Xia et al, Brar et al y Lim et al encontraron que células de cáncer de ovario, en cáncer de colon y en la línea celular de carcinoma prostático DU145 presentaron una sobreexpresión de la NOX por lo que los autores concluyeron que las ERO desempeñan un papel importante para inducir la angiogénesis y el crecimiento tumoral6-8. Además, Arnold et al demostraron que la sobreexpresión de NOX1 en la línea DU145 inducen los factores de transcripción c-fos y la citosina IL-8 y con ellos, un incremento en la producción de ERO9.
]]> Actualmente, los únicos estudios realizados sobre CaP son los reportados por Chaiswing et al, Kumar et al y Jajoo et al. En ellos demostraron que el uso de inhibidores de la NOX (apocinina, difeniliodonio y cloruro de dibenziodolio) y en algunos casos la inducción de la sobreexpresión de enzimas antioxidantes (Cu/Zn-superóxido dismutasa) disminuyen la habilidad invasiva, la producción de H2O2 y O2•-, la activación de mitógenos como ERK1/ERK2, p38, NF-κB, MAP cinasas y AKT en diferentes líneas celulares de CaP (DU145, PC3, LNCaP, PC3-MM, ALVA y AT6.1)10-12.De acuerdo con lo anterior, el objetivo del presente estudio fue evaluar, comparar y analizar por primera vez la expresión protéica de la subunidad p22 phox de la NOX en el estroma y glándula de la próstata en pacientes diagnosticados con cáncer e hiperplasia.
Materiales y métodos
Sujetos de estudio: la recolección de muestras se llevó a cabo del mes de enero de 2004 a diciembre de 2007. Se realizó un estudio clínico, experimental, transversal, comparativo y descriptivo. Se seleccionaron las muestras de los pacientes registrados en la libreta de cirugía del servicio de urología del Hospital Central Militar y que cumplieron con los criterios de inclusión, exclusión y eliminación.
Criterios de inclusión: a) pacientes con diagnóstico de CaP con síndrome obstructivo urinario bajo de la vía urinaria con diagnóstico de prostatectomía radical; b) pacientes con diagnóstico de hiperplasia prostática (HPB) con indicación de resección transuretral prostática (RTUP).
Criterios de exclusión: a) pacientes que no autorizan participar en el procedimiento; b) pacientes que no sean candidatos a RTUP.
Criterios de eliminación: a) pacientes cuyo tejido sufriera daño durante su traslado.
Los pacientes fueron sometidos a análisis clínicos, tacto rectal digital, un ultrasonido transrectal de la próstata (UTRP) y se determinaron los valores de antígeno prostático específico.
Por el análisis de tacto rectal se obtuvo que los pacientes sospechosos de HPB presentaron una glándula aumentada de tamaño pero con forma redondeada y simétrica, consistencia elástica, superficie y bordes regulares y los pacientes sospechosos de CaP presentaron una glándula aumentada de tamaño con nódulos o áreas induradas, consistencia pétrea, superficie irregular y poco movible además de asimetría en los lóbulos. En ambos casos no se presentó dolor al tacto.
]]> Para la realización del UTRP, los pacientes asistieron con retención de orina y ayuno de no menos de 6h y administración de ciprofloxacina 500mg/12h iniciando el día anterior al estudio y manteniéndola por 4 días posteriores al mismo. A los pacientes se les acostó en decúbito lateral izquierdo con flexión de ambas rodillas en 90 grados, con doble cobertura del transductor con condones y entre ambos una película de gel acústico. De acuerdo con Rifkin et al se consideraron por UTRP los siguientes patrones ecográficos13.Próstata normal: próstata de ecoestructura homogénea, de bordes regulares, que no sobrepasara un volumen de 20ml.
Próstata nodular: próstata con nódulos hipoecoicos, hiperecoicos o isoecoicos con bordes regulares e irregulares con calcificaciones o sin ellas con ecoestructura homogénea o heterogénea.
Además, para la evaluación de la próstata en busca de cáncer se tuvo en cuenta una serie de factores como son:
• La ecogenicidad y la simetría de la glándula
• Evaluación de los tejidos periprostáticos
• Evaluación de los haces neurovasculares
• Evaluación de las vesículas seminales
• Evaluación del ápex prostático ]]> • Evaluación de los conductos eyaculadores
• Evaluación de los ganglios linfáticos periprostáticos
En los pacientes sospechosos de HPB se encontró mayoritariamente una imagen isoecóica y en los pacientes sospechosos de CaP se encontró mayoritariamente una imagen hipoecóica, además de una próstata heterogénea, nodulosa y difusa, crecimiento y asimetría glandular y distorsión capsular pero no se observaron zonas de necrosis ni infiltraciones en la vejiga ni vesículas seminales. Estas observaciones correspondieron con lo reportado en la literatura15-19.
A todos los pacientes, según resultados del tacto rectal y UTRP, se les tomó una biopsia mediante punción espirativa con aguja fina según el método descrito por Kline14.
Finalmente se procedió a realizar un diagnóstico histológico de las biopsias obtenidas. Para estas muestras, se realizaron cortes los cuales fueron fijados con formaldehído tamponado al 10% (pH=7,4) e incluidos en parafina. Para el análisis histológico de cada una de los cortes incluidos, se prepararon laminillas (secciones de tejido de 3μm) los cuales fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H y E) para la identificación de las zonas con focos tumorales o con hiperplasia prostática. De este análisis se obtuvieron los siguientes resultados:
HPB: Se presentaron elementos epiteliales en forma de conglomerado, glándulas pequeñas revestidas de una capa regular de epitelio cilíndrico alto o cúbico aplanado con membrana basal intacta. Estas observaciones coincidieron con la naturaleza de la lesión y con las características histológicas ya reportadas para el HPB20.
CaP: se presentó estroma interpuesto y pérdida de la capa normal de células mioepiteliales que rodean a las células glandulares, la anaplasia nuclear fue mínima (bien diferenciado: escala 2-4 de Gleason). Se presentó desorganización en los elementos glandulares y anaplasia nuclear más pronunciada (moderadamente diferenciado: escala 5-7 de Gleason). Falta de glándulas formadas y presencia de masas sólidas de células individuales infiltrantes, anaplasia nuclear pronunciada (poco diferenciado: escala 8-10 de Gleason). Estas características coincidieron con las características histológicas ya reportadas para el CaP20. En todos los casos el tumor fue calificado como clínicamente localizado.
El urólogo basándose en el tacto rectal, en las imágenes vistas por el ultrasonido y en el análisis histológico de las biopsias confirmadas con el diagnóstico de CaP indicó una prostatectomía radical y se procedió a realizar una RTUP a los pacientes con diagnóstico de HPB.
En ambos casos, la próstata extraída y las muestras de tejido obtenidas por RTUP en los pacientes con CaP y HPB, respectivamente, se prepararon para el diagnóstico histopatológico por tinción de H y E para la búsqueda de zonas con focos tumorales o con hiperplasia como se mencionó anteriormente. Debe mencionarse que los análisis histopatológicos se realizaron por 3 uropatólogos en forma independiente.
Todos los análisis inmunohistoquímicos se realizaron sobre laminillas preparadas de secciones de tejido de tres micrómetros fijados en formalina al 10% e incluidas en parafina y obtenidas a partir de los fragmentos de tejido obtenidos de la zonas tumorales localizadas en la próstata extraída por prostatectomía radical y de los fragmentos de tejido obtenidos de zonas identificadas con hiperplasia del tejido extraído por RTUP de acuerdo con los resultados obtenidos de los análisis histopatológicos descritos anteriormente.
]]> Inmunohistoquímica: los cortes incluídos en las laminillas se desparafinaron y se calentaron para desenmascarar los sitios antigénicos; la actividad endógena de la peroxidasa fue bloqueada con 0,03% de H2O2 en metanol absoluto. Las secciones de tejido fueron incubadas toda la noche a 4oC a una dilución 1:100 de anticuerpo monoclonal contra p22 phox, en solución TRIS. Se removió el anticuerpo primario y se realizaron 2 lavados repetitivos con TRIS, los cortes fueron incubados con una dilución 1:500 de anticuerpo policlonal de conejo como anticuerpo secundario y se realizaron 2 lavados repetitivos con TRIS. Los anticuerpos unidos se detectaron con el complejo avidina-biotina (ABC-kit Vectatastain) y la diaminobenzidina como sustrato. Después de lavar repetidamente con TRIS los cortes fueron contrateñidos con hematoxilina. Todos los cortes fueron incubados bajo las mismas condiciones con la misma concentración de anticuerpo y en la misma corrida, por lo tanto, la inmunotinción fue comparable. Todos los especimenes fueron examinados por el microscopio de luz Axiovert 200M (Carl Zeiss, Jena, Germany). Para el análisis morfométrico automatizado, el porcentaje de células positivas (color marrón) se determinaron con un analizador de imágenes computarizado KS-300 3.0 (Carl Zeiss, Jena, Germany). Este equipo detecta automáticamente las células positivas determinando su porcentaje por campo. Cinco campos aleatorios fueron estudiados a una magnificación de 100 (área total 1.584.000μ2). Los resultados fueron expresados como porcentaje.Análisis estadístico: la significancia estadística de la inmunoreactividad de los niveles de expresión de p22 phox entre los grupos de cáncer de próstata e hiperplasia prostática en glándula o en estroma fue determinada utilizando el software Graph Prism 3.0 con la prueba «t de student». Los datos se expresaron como la media±desviación estándar. Se consideró una p<0,05 como diferencia estadística entre ambos grupos.
Resultados
De un total de 62 pacientes se obtuvieron 30 pacientes con diagnóstico histopatológico establecido de CaP (48,4%) y 32 pacientes con diagnóstico establecido de HPB (51,6%).
Dentro del grupo de pacientes con diagnóstico de CaP la edad promedio fue de 65,3 años y la concentración de antígeno prostático específico preoperatorio en este grupo fue de 8,6ng/ml; el puntaje en la escala de Gleason fue de 4 en 1 caso (3,3%), de 6 en 19 casos (63,3%), de 7 en 9 casos (30%), de 8 en 1 caso (3,3%).
En el grupo de pacientes con diagnóstico establecido de HPB, la edad promedio fue de 66,5 años, el promedio de concentración de antígeno prostático específico preoperatorio fue de 8,7ng/ml.
Los niveles de expresión de la subunidad p22 phox de la NOX obtenidos en el grupo de HPB se presentan en la tabla 1.
Como es posible observar, los niveles de expresión de NOX fueron 1,76 y 3,74 veces significativamente más altos en estroma y glándula, respectivamente en CaP en comparación con el grupo de HPB. Además, la expresión fue significativamente mayor en la parte glandular de ambos grupos de estudio (fig. 1).
Figura 1. Determinación por inmunohistoquímica de p22 phox en la glándula
y estroma en CaP y HPB. A) Glándula de CaP. B) Glándula de HPB.
C) Estroma de CaP. D) Estroma de HPB, respectivamente. En ambos grupos,
se determinó el % de área marcada por campo (400×). Se encontró un incremento
significativo en la inmunorreactividad de p22 phox en el grupo de CaP (p<0,0001).
]]> Discusión
Los resultados obtenidos, por primera vez, en este estudio muestran un aumento de porcentaje de área en la expresión de la subunidad p22 phox de la NOX en el estroma y la glándula de la próstata en pacientes diagnosticados con cáncer con respecto a los pacientes diagnosticados con hiperplasia encontrando, además, un incremento significativo en su expresión en la parte glandular en ambos grupos de estudio.
En estudios anteriores, se ha observado que la generación de ERO en la línea celular de CaP DU 145 se redujo con el uso de un inhibidor de flavoproteínas. También se demostró que la expresión de las tres principales subunidades de la NOX: gp91 phox, p47 phox y p67 phox se redujo, en consecuencia, los autores concluyeron que la NOX posee un papel como mecanismo de señalización que regularía el crecimiento y la apoptosis celular en el CaP21,22.
Por otro lado, parece que las células endoteliales expresan todos los componentes de la NOX incluída la gp91 phox, p22 phox, p47 phox y p67 phox y en las células de músculo liso vascular expresan p22 phox y p47 phox. Sin embargo, en la línea celular DU145 aunque fue identificada gp91 phox, la proteína de p22 phox no fue detectable aunque sí el ARNm21,23,24. La observación anterior es controversial con respecto a lo obtenido en este estudio ya que se logró cuantificar la expresión de la proteína de p22 phox en biopsias de CaP.
Debe mencionarse que el lugar exacto de las vías de señalización de la NOX actualmente permanece incierto y pueden ser tejido específicas aunque en estudios previos han sugerido que esta enzima puede tener un papel en el mecanismo de señalización que regula el crecimiento celular y la apoptosis en el CaP21. Cabe mencionar que ya se ha demostrado que la angiotensina II estimula la actividad de la NOX en músculo liso vascular vía proteína cinasa y en parte a través de NF-κB en las vías respiratorias y en los melanomas, pero aún no ha sido estudiado en pacientes con CaP25.
En otro estudio encontraron que altos niveles de ERO fueron producidas espontáneamente en CaP y en cáncer de ovario. Esta elevada producción de especies reactivas fue inhibida con el uso de un inhibidor de la NOX, el difenilen iodonio y el inhibidor de la cadena de electrones mitocondrial rotenona26. Además, ya está demostrado que la isoforma NOX1 induce al factor de crecimiento endotelial vascular así como la expresión de su receptor en varios tumores23. Por otro lado, se encontró que en células de cáncer de ovario existe un incremento en la producción de ERO el cual fue proporcional con la expresión de la NOX y con la expresión del factor HIF-1 (hipoxia inducida por factor 1)27. También se ha observado que en la línea celular DU145 transfectada con la NOX1 se incrementa el crecimiento tumoral y la producción de H2O223.
Todo lo anterior parece indicar que tanto los cambios del estado redox celular cuando las células pasan de normales a aberrantes, donde estaría implicada la producción de O2•- y las diferencias en la arquitectura de la próstata, estarían conduciendo la invasión de células cancerosas en este tejido.
Conclusiones
La sobreexpresión de la NADPH oxidasa se encuentra activamente involucrada en el CaP. Además, sugerimos que la NADPH oxidasa, en combinación con otros clásicos marcadores tal como antígeno prostático específico, podría funcionar como un indicador para el monitoreo postoperatorio de pacientes diagnosticados con hiperplasia u otras patologías menores de la próstata.
]]>Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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(N. Cárdenas-Rodríguez)
Recibido: 10 Septiembre 2009
Aceptado: 8 Febrero 2010