Modelos animales para el estudio de la respuesta inflamatoria sistémica y de nutrición parenteral

Animal models for the study of systemic inflammatory response and parenteral nutrition

J. M. Morán Penco

Profesor de Cirugía. Departamento de Cirugía. Facultad de Medicina. U.Ex. Director del Servicio de Animalario. Universidad de Extremadura. España.

Dirección para correspondencia

RESUMEN

El Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SRIS) parece desencadenarse por la activación de un tipo de receptores llamados Toll-Like, propios de las células de respuesta inflamatoria y que, a través de señales citosólicas específicas, producen una cascada de reacciones que activan las Citocinas, Factores de Crecimiento y otros mediadores inflamatorios. En este trabajo, repasamos y discutimos varias clasificaciones de Modelos Animales para el estudio del SRIS y proponemos que estos modelos se dividan según los objetivos concretos a estudiar; que podrían ser los siguientes:
1º Para el estudio de los genes reguladores de los receptores Innatos y Adaptativos, de la respuesta inmunoinflamatoria.
2º Para el estudio de los receptores de señalización (Citocinas y Factores de Crecimiento).
3º Para el estudio de la respuesta frente a los señalizadores.
4º Para el estudio de tratamientos mediante bloqueo anti-inflamatorio específico (ILs, TNF y otros).
5º Modelos específicos de Sepsis.
6º Otros Modelos Inductores de SRIS.
7º Para el estudio de Modelos Terapéuticos diversos: -Tratamientos Anti-Inflamatorios. -Tratamientos Anticoagulantes: Inhibición de la Coagulación en ensayos Humanos-Fase II, con anticoagulantes: Antitrombina III, PCA y TFPI. -Tratamientos Antibióticos. -Tratamientos con Reposición de Volúmenes. -Tratamientos Quirúrgicos. ]]> En lo que respecta al apartado de Modelos animales para el estudio de la Nutrición Parenteral, podríamos hacer la siguiente clasificación y resumen de lo tratado:
1. Modelos Animales para el estudio de la Vía Parenteral de Administración.
2. Modelos para el estudio de la viabilidad, absorción y tolerancia locales en la vía de administración.
3. Modelos para el estudio de las Complicaciones.
4. Modelos animales para el estudio de la farmacodinamia, metabolización e investigación de la tolerancia de nuevas moléculas o substratos.

Palabras clave: Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica.

ABSTRACT

The systemic inflammatory response syndrome (SRIS) seems to be due to the activation of the toll-like receptors, specific of the inflammatory response cells, through concrete cytosolic signals which lead to a cascade of reactions acting cytokins, growing factors and others inflammatory mediators. This kind of work revewes and discusses several classifications of animals models to study the SRIS, and propose to divide these models according to concrete goals, which can be the following ones:
1º To study innate and adaptative receptors of regulatory gens in the SRIS.
2º To study signals receptors (cytokines and growing factors). ]]> 3º To study the answer to signals.
4º To study treatments through specifics antinflammatory blockage.
5º Specific models of sepsis.
6º Others inducing models of SRIS.
7º Others therapeutical models. -Antinflammatories.-Antiacoagulans: Coagulations inhibition in human assays.-Phase II Anticoagulans: Antitrombine III, PCA y TFPI. -Antibiotics. -Replacing Volume Treatments.-Surgical Treatments.
As to the animals models to study Parenteral Nutrition, we could make the next classifications and sum it up:
1. Animal models to study the parenteral via of administration.
2. Models to study viability, absorption and local tolerance of the administration via.
3. Study models for complications.
4. Animal models to study pharmacodynamic, metabolization and to investigate the tolerance of new molecules or substrates.

Introducción

Desde tiempos prehistóricos se han usado diversos tipos de animales para comprobar la toxicidad de múltiples alimentos, venenos naturales y extractos. Desde luego, en la medicina egipcia (la mejor y más avanzada de su época), posteriormente en la del medio oriente (asiria, persa, etc) y en la Árabe y Judía españolas, se efectuaban ensayos de toxicidad farmacológica y otros ensayos quirúrgicos con diversos tipos de animales. En Europa, se usa el ratón por primera vez en el siglo XVI y, en el siglo XVIII, se usan animales para observar la inyección de productos alimenticios. E. Jenner, en 1798, logra la primera vacuna de la viruela, tras experimentar en varios animales. Especialmente importantes fueron los avances logrados en fisiología, a lo largo del siglo XIX, con el uso del animal de experimentación por el gran fisiólogo francés Cl. Bernard y de otros fisiólogos Franceses, Rusos, Ingleses, Alemanes o de otras nacionalidades. L. Pasteur, en 1885, logra la vacuna antirábica y luego se logran las antidiftéricas, las de la polio, etc. Todas ellas por experimentación animal^1-3. Finalmente, merecen reseñarse la introducción de los experimentos en primates No-humanos a principios del siglo XX^1,4 y los enormes avances logrados con la cirugía experimental y la experimentación con animales transgénicos, durante los siglos XX y el actual^1,5,6. No cabe duda que, con el uso de animales transgénicos, hemos aprendido mucho acerca de la genética, de los mediadores y de la fisiopatología de la respuesta inflamatoria, así como de la cicatrización de las lesiones titulares^7,8.

En lo referente a la Nutrición Artificial (NA), esta fue precisamente iniciada por Christopher Wren, en el siglo XVIII, en un modelo experimental con perros, tratando de administrarles vino en la vena, mediante una caña de ave. Posteriormente, a finales de los años 60’, Dudrick y cols., desarrollaron también en perros el método de NP prolongada, a través de un catéter central y su primera aplicación clínica⁹. La NA, la podemos dividir en: Nutrición Enteral (NE), que a su vez podría ser subdividida en tramos anatómicos de administración digestiva (gástrica, duodenal, yeyunal) o por tipos de preparados (elementales, semielementales…) y en Nutrición Parenteral (NP), que a su vez podríamos subdividirla según la vía de infusión (Vía venosa Central, Periférica o Peritoneal), por la carga de substratos administrados (Parcial o Completa) o por el tiempo de administración (corto o a largo plazo). Pues bien, en el caso de la NA y, mas concretamente de NP, además de requerirse modelos animales para el estudio de la vía de administración, como en todos los estudios nutricionales, los objetivos pueden ser muy diversos: estudios para conocer las necesidades cualitativas y cuantitativas de los substratos, sus concentraciones, variedades concretas de los mismos, formas y ritmos de administración, estudios de farmacodinamia, farmacogenética, fisisopatología y de tolerancia, o de todas las posibles complicaciones tras su administración, etc.^10,11.

Objetivos

Intentaremos demostrar la necesidad del uso del animal de experimentación para el estudio y tratamiento del Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SRIS), así como ofrecer unas guías prácticas de los modelos animales más útiles.

Respecto de los Modelos Animales para el estudio de la Nutrición Parenteral (NP), pretendemos indicar cuales animales, útiles o arneses y condiciones de estabulación que puedan ser más adecuadas y, más aún, concretar los diseños experimentales así como los modelos idóneos para los diferentes aspectos de la investigación en NP (vías, metabolismo de los substratos, interferencias, nutrigenómica, complicaciones etc.).

Hemos revisado la literatura de los últimos veinticinco años, tanto de tratados actuales como de artículos especializados sobre el uso de los animales de experimentación, del diseño experimental y de los modelos animales para los estudios del Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica y para los estudios en Nutrición Artificial y Parenteral. También hemos estudiado la legislación actual, Internacional y española, sobre el animal de experimentación^12-13.

Finalmente, hemos revisado nuestra experiencia en la experimentación animal para estos estudios, iniciada en 1981.

Resultados y discusión

Modelos experimentales para el estudio de la respuesta inflamatoria sistémica

Desde el punto de vista histórico, para llegar al actual concepto del SRIS, podríamos destacar las siguientes etapas¹⁴:

- El primer concepto que asociar al SRIS, sería el de "Colapso periférico" (post-febril, hemorrágico, cardíaco...), establecido por Frank en 1896 y mas desarrollado por Starling en 1905. Este fue el primer punto de vista termodinámico o de transferencia térmica entre sistemas y/u órganos; desde la piel y músculos hacia los órganos centrales.

- El siguiente paso fue el de Shock, con sus grados y tipos de Shock (infeccioso, cardiogénico, hipovolémico, post-traumático, gran quemado, neurogénico…). Esta teoría fue desarrollada entre los años 1920 a 1960.

]]> - Siguió el de Fallo orgánico, mejor expresado en el de Fallo Multiorgánico o de múltiples órganos. Establecida en la década de los 70’

- Finalmente, en estos últimos años se ha recuperado de nuevo el concepto termodinámico. Desde entonces, se acepta definitivamente la fisiopatología inflamatoria como un proceso que puede finalizar en un Fallo Multiorgánico^15,16.

Las posibles etiologías del Fallo Multiorgánico y del Shock, podríamos dividirlas en¹⁷:

- Clínicas: Pancreatitis, Gran quemadura, Infección por Gran-negativos (endotoxinas) o por algunos Gran-positivos (exotoxinas), Virus/hongos, Politraumatismo o Traumatismo grave (especialmente con contusión pulmonar), Isquemia/Reperfusión (en cirugía vascular o de otro origen… "siempre fue mas grave la isquemia que la hipoxia relativa de un órgano").

- Experimentales: Sépsis Peritoneal inducida (LPS, inyección IP de gérmenes, ADN viral…), Isquemia/Reperfusión quirúrgica-experimental, Administración de endotoxinas (LPS, PAMPs), Administración de Citocinas, Síndrome Compartimental, Ventilación Artificial Anómala (Vt altos...), otros, incluyendo los inmunológicos y los genéticamente determinados (Nock-out, Transgénicos)...

Clínicamente, el SRIS se diagnostica cuando el paciente tiene más de uno de los datos clínicos referidos a continuación y en el caso del adulto. Estos mismos signos (de respuesta inflamatoria), pueden también observarse en ausencia de causas infecciosas:

• Temperatura corporal > 38 °C or < 36 °C.

• Frecuencia Cardíaca > 90/min.

]]> • Hiperventilación, evidenciada por una frecuencia respiratoria > 20/min o una PaCO2 de < 32 mmHg.

• Leucocitosis de > 12.000 células/μl o < 4.000 celulas/μl.

Pues bien, una vez visto lo anterior, podríamos hacernos las siguientes preguntas: ¿Hay etiopatogenias comunes a esos procesos?, ¿hay mecanismos fisopatológicos compartidos?, ¿existe una respuesta inflamatoria sistémica que conecte a todos esos fenómenos clínicos y fisopatológicos? La respuesta es SÍ: En muchos de estos procesos, no en todos, existen unos mecanismos moleculares e inmunológicos que, ante las diversas etiopatogenias, configuran una respuesta de tipo inflamatorio, y que pueden llevar a un fallo multi-orgánico.

Y, ¿cuales serían esos mecanismos bioquímicos e inmunológicos primarios que, ante las diversas etiopatogenias, configuran una respuesta tipo inflamatorio, y que pueden llevar a un fallo orgánico? Pues nuestra respuesta podría ser la siguiente:

1º: La activación de la Familia de Receptores de Membrana (especialmente los de tipo Toll-Like receptors), al inicio del proceso patogénico, y la producción celular de los Factores de Señalamiento, son los eventos moleculares comunes. Independientemente de la etiopatogenia o delórgano inicialmente afecto.

2º: Las alteraciones de la Microcirculación (Capilar/Intersticio), constituyen el proceso final que pueden llevar al Fallo multiorgánico y a la muerte del paciente.

Recordemos que el sistema Inmunológico o de respuesta inmune se distribuye, anatómicamente, en órganos encapsulados (Timo, Bazo, Médula ósea, Ganglios linfáticos) y en áreas difusas (Anillo de Waldeyer, Placas de Peyer, Lámina propia intestinal, Tejidos linfoides pulmonar y urogenital, Hígado etc.), encargados a su vez de originar dos tipos de respuesta:

1. La Innata, dividida a su vez en:

]]> • Inmediata (segundos), originada por Macrófagos y Mastocitos, a través de la activación del Complemento y la Lisozima.

• Inducida (Horas y días), originada por los Linfocitos NK, Eosinófilos, Basófilos, Endoteliecitos y neutrófilos, a través de mediadores como Citocinas, Interferones, Proteínas de fase aguda y otros mediadores inflamatorios. En estas dos, intervienen las barreras anatómicas locales, de las áreas infectadas o agredidas, además de la Sangre, Hígado y Médula Ósea.

2. La Adquirida o Adaptativa (en semanas): Aquí intervienen también la Sangre, el Bazo, el Timo, Médula Ósea y Linfa, a través de los Linfocitos T y B y las Células Dendríticas que originan Anticuerpos, Citocinas, Citolisinas y Moléculas HLA.

Pues bien, en 1991 Spaetzle y cols. descubrieron que en la Mosca del Vinagre el mecanismo de activación de sus defensas inmediatas era a través de la activación de unos Receptores característicos que fueron llamados Toll-Like (TLR). Posteriormente, en 1997, Medzhitov y cols.¹⁸ clonaron en el ser humano un receptor homólogo, llamado también Toll-Like y que, posteriormente se ha subdividido en subtipos TLR-2, 4, 5, 9. Todos ellos reconocerían a subproductos bacterianos, llamados PAMPs, fundamentalmente los Lipopolisacáridos (LPS), más propios de la bacterias Gram-. Estos activadores externos (LPS para los Gram- y, según parece actualmente, otros activadores endógenos¹⁹: Ac. Hialurónico, Fibronectinas, Surfactantes, Complejos IgG, Ac. Laúrico y muchos otros), activarían a los diferentes subtipos de TLR de los Macrófagos, Mastocitos y sus derivados. A través de señales citosólicas (IRAK, NFb etc.), originarían en el núcleo la producción de una cascada de mediadores, llamados Citocinas, Factores de Crecimiento (GF) y otros productos Pro-Inflamatorios (Metabolitos del O2, Metabolitos del Ac. Araquidónico, Enzimas hidrolíticas, ON etc.), desencadenando la respuesta sistémica en la Sepsis o el SRIS. Esto explica: 1) Como puede iniciarse el SIRS, en ausencia de PAMPs/LPS (SRIS estéril). 2) Como los TLR unen la respuesta inmunitaria innata y adaptada frente a virus, tumores, transplantes…

El esquema más actualizado sería, en mi opinión el representado en la figura 1, y propuesto por Brunn & Platt en el 2006²⁰. En este esquema, la teoría anterior esta señalada en gris.

Por otra parte y para nuestros objetivos, nos interesa destacar que las Citocinas son los principales mediadores de señalamiento y diferentes a los Factores de Crecimiento. Las citocinas son Péptidos o glucoproteinas reguladores, con PM de 5 a 30 kd, liberados por casi todas las células nucleadas (especialmente los Leucocitos, Linfocitos y Fibroblastos) y muy potentes a concentraciones de pico a nanomolares. Actúan a corta y larga distancia y controlan o modulan la respuesta inmune y/o la reparación celular (crecimiento, diferenciación, metabolismo y síntesis proteica). Las principales son: Interleucinas (IL1 a IL18), Interferones, Factores estimulantes de colonias: GM-CSF. G-CSF, Quimiocinas (CXC, CXXC…), Los Factores Estimulantes de Colonias (GM-CSF. G-CSF) y TGFβ y TNFα. Los Factores de Crecimiento tienen como blanco a células NO-Hematopoyéticas y las citoquinas a las inmunitarias y hematopoyéticas. Los principales serían: Hormonas como la Insulina, Progesterona, Somatomedina etc., los VEGF, EGF, FGF, IGF, PDGF y también los TGF y TNF. En la figura 2 las representamos en su relación con el SRIS²¹.

Así pues, podríamos resumir el proceso de Respuesta Inmune e Inflamatoria en los siguientes Mecanismos Patogénicos:

1. Activación de los Receptores innatos (Toll-Like Receptors): reconocen DNA, lipoproteínas, LPS… mejor si están opsonizados con complemento o PCR.

2. Liberación de Citocinas: TNF-α, IL-1β, IL-6… y de Factores de Crecimiento.

]]> 3. Activación de Péptidos de la Coagulación y de Plaquetas (Antitrombinas, Tromboxanos, PCR, Factores plaquetarios…).

4. Activación de Mediadores metabólicos y Endocrinológicos: (PUFAs/eicosanoides, leucotrienos, RL-O3-.., Péptidos adrenérgicos-NAd-Ad-5HT,…).

5. Activación de la respuesta Inmune específica o adaptativa.

6. Activación de otros Mediadores Vasculares y de la Microcirculación: (ON, CO y otros específicos de algunos órganos).

En la figura 3 se expone un esquema de todo ello. Además, en el SRIS se producen las siguientes alteraciones metabólicas²²:

- En el Metabolismo de los Carbohidratos: 1) Hiperglucemia y alta disponibilidad sistémica de glucosa. 2) Glicolisis. Resistencia Periférica a la Insulina. 3) Gliconeogenesis (desde lactato -Ciclo de Cori-).

- En el Metabolismo Lipídico: 1) Actividad Lipolítica. Hipertrigliceridemia (Síntesis). Cetogénesis. 2) Infiltración grasa del hígado (Macroesteatosis/Microesteatosis).

- En el Metabolismo Proteico: 1) Catabolismo proteico: Hueso, Músculo, Intestino y Tejido Conectivo. 2) Síntesis de proteínas de proteínas viscerales de la homeostasis (Ej. albumina). 3) Síntesis de proteínas de fase-aguda (en la última fase de Sepsis o SIRS). También se produce una Hiperlactatemia y una Acidosis Metabólica.

Las siguientes preguntas serían: ¿por qué debemos utilizar modelos animales y, en este caso, cuales modelos?, y, a estas, trataremos de darle respuesta en las próximas líneas.

Las especies animales mas utilizadas para el estudio del Shock, Sepsis y SRIS podemos resumirlas en la tabla I, incluyendo las especies primates NO humanos. A lo anterior, hemos de añadir las actuales variedades transgénicas, que han permitido el estudio pormenorizado de la genética de los receptores, citocinas y otros mediadores implicados en el SRIS^23-25. Se utilizan como prueba definitiva para conocer las funciones de un gen y sus efectos. O bien se expresa exageradamente dicho gen (en un organismo), y/o bien se suprime el mismo, pero siempre es más fácil sobre-expresarlo que suprimirlo. Resumimos a continuación los pasos esenciales para lograrlo:

A. El proceso de sobre-expresión es el siguiente:

1º Se construye el fragmento de ADN que nos interesa, mediante técnicas de ADN recombinante (Trans-gén). Incluyendo todas las zonas que contiene el gen (con las regiones de promoción y la reguladora. Dependiendo del promotor utilizado, podremos expresar el gen en más o menos tejidos).

2º Se introduce el trans-gén en un pronucleo masculino de un huevo fecundado, mediante microinyección (alrededor de un 5% integrarán el transgén).

3º Se investiga en los animales la expresión del trans-gén.

B. Para conseguir expresar los efectos No-dominantes de un gen, hay que crear animales transgénico"anulados" mediante la supresión del gen a estudiar, lo que resulta mucho más difícil. Para ello se procede de la siguiente manera:

1º Se modifica el ADN del gen hasta hacerlo afuncional.

2º Se introduce este gen en un vector y en líneas celulares germinales.

3º Estas células germinales originan animales heterocigotos pero, cruzándolos entre sí, se consiguen animales homocigotos para ese gen mutado y anulado.

Es obvio que hay diferencias entre los resultados obtenidos entre las diferentes especies así como entre estas y la especie humana. Pero es también cierto que, en la especie humana no hay un solo modelo y que también influyen múltiples factores, como la edad, sexo, condición fisiológica o patológica, etc. (ver Fig. 4). Por ello, nunca se insistirá lo suficiente en que, los modelos animales se utilizan para entender "lo que sucede" y elaborar hipótesis que sean dignas de considerarse, con la suficiente seguridad para los ensayos humanos más definitivos.

En la tabla II, resumimos los modelos animales utilizados y comparados con las características de la sepsis humana. Observense las importantes diferencias, ya señaladas por otros autores²⁵.

Respecto de los modelos, creo necesario exponer dos clasificaciones posibles. La primera es la de los colegas Ramos y Lorente, de la unidad de investigación del HU Getafe y publicada en el 2005²⁵ y la segunda sería una propia. En ambas, resulta obvio que, para estudiar todos los aspectos implicados en el SRIS, máxime para realizar la transferencia clínica de resultados, hay que realizar muchos modelos.

A continuación exponemos la clasificación modificada de modelos animales para el estudio de la Sepsis y del SRIS, propuesta recientemente por este experto grupo de estudio español. (Tomado y modificado de N. Ramos y J. Lorente/2005)²⁵.

1. Elección del modelo: formulación de la pregunta de investigación.

1.1. Sobre los Mecanismos Compensadores: Hiper o hipodinamia²⁶.

1.2. Sobre la Progresión de la Disfunción de losÓrganos: efecto del tiempo²⁷.

1.3. Sobre la Activación de la Respuesta Inflamatoria²⁸.

1.4. Sobre las posibles Intervenciones Terapéuticas²⁹.

2. Modelos de endotoxinemia (sobre todo LPS, vía i.v.)^25,28,30-35.

2.1. Modelos de endotoxinemia en roedores (Las Ratas son + resistentes).

• Efecto de la dosis.

]]> • Efecto de la duración de la administración.

• Vía de administración.

• Modelos de sensibilización.

2.2. Modelo de Endotoxinemia en ovejas (pues los Perros son + resistentes).

2.3. Modelo de Endotoxinemia en humanos (pues los Primates son + resistentes).

3. Modelos de infección bacteriana.

3.1. Modelo de Infección bacteriana en Roedores: E. Coli en Cobayo³⁶.

3.2. Modelo de bacteriemia: E. Coli en el cerdo y P. Aeruginosa en la Oveja³⁷.

3.3. Modelo de bacteriemia: E. Coli en Primates³⁸.

4.1. Peritonitis inducida mediante implantación de bacterias vivas o material fecal³⁹.

4.2. Modelo de ligadura y punción del ciego: en Ratas para las peritonitis localizadas y Cobayo, Conejo y Perro para las difusas⁴⁰.

5. Modelos que reciben tratamiento^41-47.

5.1. Tratamientos Anti-inflamatorios.

5.2. Tratamientos Antibióticos.

5.3. Tratamientos Anticoagulantes.

5.4. Tratamientos Hemodinámicos.

]]> 5.5. Tratamiento Ventilatorio.

5.6. Tratamiento Quirúrgico.

Por nuestra parte, y considerando otros aspectos, como el tipo de animal, y en aras de concretar más el tipo u objetivo del estudio, así como la opinión de otros expertos internacionales, nos atrevemos a proponer otra clasificación o guía práctica siguiente:

Modelos animales para el estudio de la respuesta inflamatoria (local y sistemica):

1. Para el estudio de los genes reguladores de los receptores Innatos y Adaptativos^18-20,48-52:

- Mosca Drosophila Melanogaster (mosca del Vinagre y de la fruta): tipo Toll-Like.

- Cepas de Ratones Transgénicos: Tipo Sultzermice transgénicos (CH3/HeN: TLR4+ y -). Para la genética de los receptores IFN-γR, JAK-STAT. Ratones deficientes en RelA, IRF5, MyD88, TLR9,7 y 3, así como los TBK1 deficientes.

- Cepas de Ratas Trangénicas resistentes a Endotoxina: Rata CH3/HeN y variantes.

- Estudios de Expresión/Sobreexpresión de TLR en Pacientes con Sepsis/SRIS.

- Ratones transgénicos uni y doblemente defectivos.

- Embriones de aves, ratón y otros pequeños animales (Gerviles etc, más raros).

- Ratones Nock-Out Endogámicos C3H/HeJ, resistentes (para estudios de estimulación).

3. Para el estudio de la respuesta frente a los señalizadores (Citocinas, Hormonas -Ins., Progest., Somatom.-, Leucotri., Trombox., Prostagland., Cinina/Calicreina, FAP, eicosanoides, ON, CO…): Se incluyen Modelos Murinos con Quemaduras y Extractos de Escaras de Quemadura^57-59.

- Modelos en Roedores: Ratones, Ratas, Cobayos y Conejos.

- Modelos Caninos, Bovinos, Ovinos y Cerdos.

- Modelos en Primates No-Humanos.

]]> - Modelos en Humanos sanos.

4. Para el estudio de los tratamientos mediante bloqueo antiinflamatorio especifico (ILs, TNF y otros): Glucocorticoides, Anticuerpos-TNF e ILs (Infliximab, Etanercept), con Drotrecogin-α (PcR), con Antisueros anti-MIP (antiquimiocinas) ^60-63:

- Modelos con Pequeños Roedores (Ratones manipulados, y Transgénicos) e Inmunodeprimidos.

- Modelos en Primates NO-Humanos.

- Modelos de Ensayos Clínicos en Pacientes con Sepsis, SRIS o Inmuno-deprimidos.

5. Modelos específicos de Sepsis^64-68:

- Mediante infusión de gérmenes (bacteriemia).

• Vía Intravenosa:

]]>

+ E. Coli, en Cobayas.

+ P. Aeruginosa en Ovejas. Ideal para el estudio del Pulmón de Shock.

+ E. Coli en Primates NH (varios Modelos).

• Vía Intraperitoneal:

+ Implantación de Materia fecal, con Gelatina o Bario, en Ratas.

+ Implantación de Coagulo Infectado, en Perros.

- Mediante ligadura/punción del ciego (LPC): Clásico y útil para el estudio de las peritonitis: usar Ratas para las peritonitis localizadas y Cobayo, Conejo y Perro para las difusas.

6. Otros Modelos Inductores de SRIS^69-70:

- Pancreatitis: Inyección de AB/Enteroquinasa en conducto pancreático en Cerdos.

- Mediante Hemorragia/Cirugía Abdominal + Ventilación en Ratas y otros animales.

- Mediante Isquemia/Reperfusión Intestinales, en Roedores, Cerdos y Primates NH.

7. Modelos Terapeúticos^71-77:

- Tratamientos Anti-Inflamatorios: Ensayos en Humanos tratados con Antag. IL-1, PC-activada y Ac Monoclonales anti TNF.

- Tratamientos Anticoagulantes: Inhibición de la Coagulación en ensayos humanos-Fase II, con anticoagulantes: Antitrombina III, PCA y TFPI.

- Tratamientos Antibióticos: Todos los ensayos pre-clínicos/Farmacológicos de Eficacia, en animales y Ensayos Humanos en Fases II y III.

- Tratamientos con Reposición de Volúmenes:

]]>

Tipos Hiper o Hipodinámicos.

+ Ensayos de hipotensión mediante iNOS, en ensayos humanos, Fase II.

+ Ensayos de la L-N-Metil-Arginina (LNMMA) en Shock Séptico en Humanos. Fase III

- Tratamientos Ventilatorios: Con Vt. Alto/baja PEEP: Conejos, Ovejas y Primates.

- Tratamientos Quirúrgicos: Todos los ensayos de Profilaxis. Los de Drenaje y los de Técnicas de Lavado y Limpieza en Procedimientos Quirúrgicas de Contaminación. Los de Infección del campo quirúrgico: Primates y Humanos.

8. Métodos alternativos^78,79:

1. Métodos celulares e "in vitro":

]]> • Para el estudio de los genes reguladores de los receptores Innatos y Adaptativos.

• Para el estudio de los receptores de Señalizadores (Citocinas ILs, TNF, y F.C: VEGF, EGF, FGF, IGF, PDGF) y de Apoptosis (activación de Caspasas).

• Para el estudio de la respuesta frente a los señalizadores.

2. Experimentación en humanos^80-82:

• Para el estudio de tratamientos mediante bloqueo antiinflamatorio específico (ILs, TNF y otros): Glucocorticoides, Anticuerpos-TNF e ILs (Infliximab, Etanercept), con Drotrecogin-α (PcR), con Antisueros anti-MIP (antiquimiocinas)…

• Modelos Terapéuticos y su traslación a la clínica.

Conclusiones, para los modelos animales en el SRIS

1. No hay modelos animales capaces de reproducir de forma completa ni la sepsis ni el cuadro de sris.

2. Cada modelo animal debe ser elegido específicamente para el estudio de un aspecto concreto: genético, etiopatogénico, fisiopatológico, terapeútico etc.

3. En los aspectos terapeúticos, deben separarse los estudios hemodinámicos, pulmonares o ventilatorios, farmacológicos cardi-vasculares, de terapia anti-inflamtoria etc.

4. Las revisiones sistemáticas de estudios en animales han permitido alcanzar conclusiones que se asemejan a los resultados de ensayos clínicos.

5. Los actuales tratamientos de la sepsis y del SRIS, están basadas en ensayos clínicos que fueron diseñados en base a un gran cuerpo de conocimiento procedente de estudios pre-clínicos.

6. El estudio del SRIS en modelo pre-clínicos continúa siendo extraordinariamente necesario para avanzar en el conocimiento de la biología de la sepsis y del SRIS humanos y en el diseño de estrategias terapéuticas eficaces.

Modelos animales para el estudio de la nutrición parenteral

La Nutrición Parenteral (NP) es un tipo de nutrición muy especial pues, aunque llegásemos a administrar exactamente la misma composición en tipo y concentración de nutrientes en una bolsa y por vía Parenteral (Intravenosa o Intraperitonealmente), nunca será igual que la vía oral, ni en forma ni bioquímica, fisiológica, bromatológica ni psicológicamente. Y ello es así, en primer lugar, porque la vía influye decisivamente para la digestibilidad y metabolización de los substratos por parte del tubo digestivo e hígado y, por tanto, para su posterior uso y corporal^83,84 (ver figs. 5 y 6).

1. Las especies animales a utilizar, deben estar bien definidas como animales de laboratorio y ser genéticamente homogéneas⁸⁵.

2. Los animales transgénicos utilizados deben ser estabulados en condiciones SPF y usados para objetivos muy concretos⁸⁶.

3. La cantidad de animales a utilizar y el diseño experimental deben estar estadísticamente bien definidos -con antelación- y en función de los objetivos principales (main goals), evitándose el utilizarlos para otros "objetivos secundarios"^85,87.

4. Recordar que los tiempos de Infusión parenteral son siempre "relativamente" cortos, pero no pudiéndose "trasladar" los tiempos de vida de unas especies a otras. Es decir: 2 semanas de NP en un perro, no quieren decir, necesariamente, un equivalente a 3-4 meses de NP en un humano^87,88.

5. La experimentación en NP exige del uso de arneses muy específicos y homologados que permitan la movilidad adecuada del animal y la reducción del estrés. Además, los experimentos que exijan un balance metabólico completo, deben hacerse en jaulas específicas, que permitan una mensuración precisa de dicho balance. Finalmente, en lo referente a procedimientos tecnológicos, la administración de dicha NP, exige la colocación de catéteres intravenosos (o intraperitoneales), que han de hacerse en condiciones asépticas y dejarlos en condiciones de adecuada estanqueidad y, en caso de la vía venosa, en anticoagulación^87,89(ver figs. 7, 8 y 9).

6. La extrapolación de resultados extraídos de los modelos animales debe ser progresiva, en escala y muy acotada a los resultados obtenidos. Los resultados sirven para entender los fenómenos etiopatogénicos, fisiopatológicos, bioquímicos, farmacológicos o de otro tipo, y programar los correspondientes proyectos de estudio en humanos, pero no para extrapolaciones y aplicaciones directas⁹⁰.

Pasaremos ahora a valorar la importancia del diseño experimental en los modelos animales para estudios de la NP. Es decir, los diseños experimentales recomendables y previamente definidos que, en nuestra opinión pueden resumirse en dos^87,88,91,92:

]]> A. De Muestras Apareadas (lineales), donde comparamos la evolución de la variable a lo largo del tiempo. Por ejemplo, tomando datos de la misma a lo largo de 24 h o de días o semanas. En ellas se comparan los datos evolutivos, con los niveles "basales" (el control es el Tº cero). Estos estudios ahorran animales y son mas "fiables". Ej. curvas metabólicas, de absorción….

B. De Muestras Independientes (o de Grupos frente al Control): son necesarios cuando comparamos la variable y parámetros analizados en diferentes condiciones experimentales. Los resultados obtenidos en los "grupos experimentales" los comparamos frente a los de un Grupo Control. Gastan más animales y el diseño tiene menos fiabilidad. Han de usarse cuando, por el objeto de estudio, no se pueden usar los de Muestras Apareadas.

Existen otros, pero o son de excepcional aplicación o pueden evitarse.

Hacemos la siguiente "Propuesta de Clasificación", para estudios de la NP.

• Modelos Animales para el estudio de la Vía Parenteral^85,93,94: Deben ser los animales más parecidos anatómicamente al ser humano: primates y, en casos de agotamiento de vías, las pruebas en los propios pacientes.

• Modelos Animales para el estudio de la absorción y tolerancia locales en la vía de administración (central, periférica, peritoneal…)^95-98: Inicialmente, Roedores: Rata, Cobayo, Conejo (de tipos Standard), para los estudios individuales con cada preparado y también para los estudios de posibles interferencias entre estos y con otras medicaciones. Posteriormente, podemos pasar a Perros, cerdos (¿o primates?).

• Modelos para el estudio de las Complicaciones: (complicaciones mecánicas, infecciosas, metabólicas o viscerales asociadas a la NP)^99-106: Modelos de grandes animales, como cánidos, cerdos, (¿primates?). Para conocer muy en detalle estas posibles complicaciones es necesario pasar a la fase de ensayos clínicos con pacientes. Para el estudio de las complicaciones hepato-biliares asociadas a la NP, deben desecharse la rata y el ratón.

• Modelos para el estudio de la Farmacodinamia, Metabolización y de la Tolerancia de nuevas moléculas o substratos (Nutrigenómica)^107-110: Roedores genéticamente similares (Rata/ratón), transgénicos. Aquí podríamos también incluir aquellos modelos animales para reproducir enfermedades o déficit enzimáticos (Favismo, Aminoacidosis, Diabetes, Hipertrigliceridemias y Colesteronemias etc.), que pudieran padecer algunos pacientes y que obligarían a estudios con substratos muy específicos: En este caso, sería casi obligado el uso de Roedores transgénicos.

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Dirección para correspondencia:
José M. Morán Penco
Dpto. Cirugía
Facultad Medicina Universidad de Extremadura
Av. Elvas, s/n
06071 Badajoz
E-mail: jmmoran@unex.es