Modelos experimentales in vivo de enfermedad inflamatoria intestinal y cáncer colorrectal. Conceptos, modelos actuales y aplicabilidad

In vivo experimental models of inflammatory bowel disease and colorectal cancer

J. Mañé Almero

Servicio de Aparato Digestivo. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Barcelona. España.

Dirección para correspondencia

RESUMEN

No existe un modelo animal ideal para el estudio de patologías humanas como la EII o el CCR. En la última década, a los modelos inducidos por agentes exógenos se han incorporado los animales manipulados genéticamente. Los modelos experimentales de EII reproducen procesos inflamatorios intestinales heterogéneos, al igual de sucede en el ser humano. Mientras que los modelos de CCR remedan las mutaciones halladas en el hombre aunque con repercusiones fenotípicas diferentes. En ambos casos, estos sistemas experimentales son influidos por la genética y el ambiente. Hoy por hoy, los modelos animales son unos valiosos bioensayos, complejos y completos, para el estudio de nuevas estrategias terapéuticas en la EII (IL-10, anti-IL-12, probióticos) y agentes protectores de la CCR (ácidos grasos n3, AINES y inhibidores de COX-2).

Palabras clave: Modelo animal ideal.

ABSTRACT

There is no ideal animal model for the study of human pathologies such as IBD or CRC. For the last decade, genetically engineered animal models have been incorporated to models induced by exogenous agents. Experimental models of IBD reproduce heterogeneous intestinal inflammatory conditions, as it occurs in the human being, whereas CRC models imitate those mutations found in man although with different phenotypic repercussions. In both cases, these experimental systems are influenced by genetics and the environment. Today, animal models represent valued, complex, and complete bioassays for the study of new therapeutic strategies in IBD (IL-10, anti-IL-12, probiotics) and protective agents in CRC (n-3 fatty acids, NSAIDS, and COX-2 inhibitors).

Key words: Ideal animal model.

Introducción

Los mecanismos implicados en la iniciación y perpetuación de la Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) no se conocen con exactitud, aunque se ha sugerido como principales componentes patológicos la susceptibilidad genética, el sistema inmunológico y el ambiente, principalmente la flora bacteriana intestinal. A pesar que no existen modelos animales que reproduzcan con fidelidad la etiopatogenia de la EII, el conocimiento adquirido a través de estos estudios experimentales nos ha permitido comprender aspectos relacionados con la aparición del brote inflamatorio y con el curso de la patología humana. Además, la mayoría de modelos experimentales de inflamación intestinal permiten hacer aproximaciones a nuevas estrategias terapéuticas en fase preclínica.

En las últimas décadas la introducción de técnicas de manipulación genética en los laboratorios de fisiología animal ha permitido crear nuevos modelos experimentales. Hoy en día disponemos de modelos en ratas y ratones que pueden sobreexpresar o silenciar una proteína concreta. Existen interesantes modelos experimentales de EII con animales transgénicos que sobreexpresan proteínas como la HLA-B27 humana, el STAT4 o la IL-7 y que muestran una elevada susceptibilidad a cambios en la ecología bacteriana del intestino^7-9. Por otra parte, la delección del gen APC genera un modelo experimental en ratones que remeda a la Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF)². En los nuevos modelos en ratones de EII con mutaciones homozigotas y heterozigotas (knock-out, KO) se da la circunstancia que una alteración genética favorece una inadecuada respuesta inmunológica a diferentes estímulos ambientales. A pesar de las diferencias sustanciales entre la enfermedad humana y la patología animal, existen similitudes a tener en cuenta. Los diversos polimorfismos del gen NOD2/CARD15 predisponen a padecer la Enfermedad de Crohn (EC) y afectan a la funcionalidad de proteínas relacionadas con el reconocimiento antigénico¹⁰. Al igual que sucede en los estudios sobre la EII en humanos, aspectos como la alteración de la flora bacteriana intestinal o la pérdida de hábitos dietéticos saludables pueden agravar la enfermedad inflamatoria intestinal en animales. Los modelos de ratones KO son una poderosa herramienta que nos permiten estudiar las repercusiones biológicas de una mutación concreta. Por ello, las líneas de ratones con mutaciones en genes relacionados con los mecanismos de reparación de errores de replicación del ADN (Msh, Mlh) son un excelente modelo para el estudio del Cáncer Colorrectal Hereditario No Polipoide (CCHNP)^11-13. También existen modelos de ratones dobles mutantes como IL-10 (-/-)/iNOS (-/-) o Apc (+/-)/ COX-2 (-/-) que nos permiten estudiar el papel de ciertas proteínas en el proceso inflamatorio o tumoral¹⁴.

Por otra parte, los modelos con ratones atímicos a los que se les inoculan células tumorales o inmunes, de diversa procedencia, constituyen un elegante modelo in vivo que recrea las condiciones de un sistema tan complejo como el humano. En estos modelos de ratones inmunodeprimidos se intenta esclarecer las interacciones entre diferentes estirpes de linfocitos o caracterizar la capacidad invasiva de tumores xeno o alotrasplantados^3,15,16.

De forma similar a lo que sucede en humanos, en algunos modelos experimentales de EII aparecen fenómenos oncogénicos en las fases más tardías de la colitis. Existen modelos inducidos, como la administración de Sulfato de Dextrano Sódico (DSS), o combinados, DSS/carcinógeno, que representan una aproximación al estudio de la secuencia inflamacióncáncer en el intestino^17,18. Asimismo, muchos modelos de colitis natural o espontánea presentan una elevada incidencia de adenocarcinomas intestinales en las fases más avanzadas de la enfermedad (Tití de cabeza de algodón o los ratones KO de IL-10, Rag2, G_αi2, o dobles mutantes como Rag2/TGFβ1, TCRβ/p53, IL-2/β2M)^19-22.

Básicamente los modelos animales para el estudio de la EII o del CCRh los podemos clasificar en dos categorías: modelos inducidos y modelos espontáneos. Sin embargo, bajo la denominación de modelos espontáneos se engloban modelos con rasgos bien diferenciados entre ellos. En particular, los modelos producidos por manipulación genética, los de trasplante tumoral o celular en ratones inmunodeficientes y los modelos naturales. Los modelos inducidos por la administración diversos agentes químicos adquirieron relevancia por ser relativamente baratos, fácilmente manipulables y razonablemente reproducibles. Estos modelos inducidos han contribuido indudablemente al conocimiento de la patogénesis de la enfermedad humana. Con la llegada de los animales manipulados genéticamente, a pesar de encarecer el modelo experimental, se ha producido un paulatino abandono de algunos modelos inducidos. El hecho de presentar rasgos genotípicos y fenotípicos parecidos a los mostrados por la patología humana es uno de los motivos del auge de modelos experimentales con ratones KO.

Los ratones KO no son la única posibilidad experimental para bloquear la expresión de un gen determinado. La administración de ARN de interferencia atenúa la transducción proteica en ratones. Este procedimiento experimental, a la vez, puede contribuir a la búsqueda y desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas sobre modelos in vivo de EII y CCRh^23,24. Además, los modelos animales no pueden ceñirse exclusivamente a la experimentación en roedores. Contribuciones importantes al conocimiento de la patología inflamatoria y neoplásica humana han surgido a partir de trabajos realizados con invertebrados. Estudios desarrollados en Drosophila melanogaster nos han permitido conocer la implicación de los receptores como toll-like en la respuesta inmune innata o el reconocimiento de proto-oncogenes (β-catenina) en la vía de señalización Wnt o MutS^25-28. Aunque estos modelos animales no encajan en la clasificación anterior, representan unos sistemas excelentes para el estudio de los mecanismos moleculares ligados a la patología humana.

A pesar del amplio abanico de posibilidades para el estudio de la EII o CCRh en los modelos in vivo actuales, la elección de este ha de contemplar varios aspectos experimentales claves. Un hecho relevante es la variabilidad intra e interespecie en la susceptibilidad y curso de la patología intestinal en los animales²⁹. Por otra parte, un agente inductor dado puede mostrar diferencias en la iniciación y progresión de la enfermedad animal en función de la dosis, la cadencia, la vía de aplicación e incluso entre diferentes lotes de producto. Las patologías intestinales se encuentran claramente influenciadas por el ambiente. Así pues, los criterios de estabulación de los animales han de considerar el control de las condiciones ambientales. Un ejemplo de ello lo constituye la ausencia de lesiones intestinales en ratones IL-10 (-/-) mantenidos en condiciones de completa esterilidad, a diferencia de los KO estabulados en condiciones libres de patógenos que presentan lesiones restringidas al colon distal y que pueden agravarse en animales mantenidos en condiciones ambientales convencionales o con infecciones por enteropatógenos^20,21,30.

Los modelos experimentales in vivo nunca pueden llegar a sustituir al ser humano como modelo paradigmático para el estudio de la EII y la CCRh, pero consideracioneséticas obvias hacen que, hoy por hoy, estos modelos animales tengan una gran vigencia.

Desde diferentes organismos se han regulado los estudios con animales de experimentación atendiendo a consideraciones éticas sobre bienestar animal. Es importante que estos sistemas experimentales se ajusten a dichas Normativas³¹. Además, la unificación de los procedimientos con el objetivo de mitigar el impacto que puedan tener sobre el animal, facilitan la equiparación de los resultados obtenidos entre laboratorios diferentes.

Actualmente, se están definiendo diferentes componentes que contribuirían a la iniciación y perpetuación de la EII³². No obstante, en ningún caso los modelos animales de los que disponemos muestran un completo grado de coincidencia etiológica y patológica con la enfermedad humana. Por tanto, es fundamental conocer las cualidades y limitaciones de cualquier modelo in vivo de EII. De esta forma, la idoneidad del modelo elegido será determinada por sus características y por los objetivos del estudio.

Modelos inducidos de colitis experimental

Estos modelos están siendo utilizados desde la década de los 80 en el estudio de la fisiopatología de la EII³³. Entre las diferentes substancias inductoras podemos distinguir agentes químicos, polisacáridos sulfatados e inmunocomplejos microbianos, así como elementos farmacéuticos (tabla I). Los estudios llevados a cabo mediante estos modelos experimentales han focalizado su atención en mecanismos de inmunidad innata (células presentadoras de antígeno, neutrófilos, moléculas del complemento y citotoxicidad), inflamación no específica (eicosanoides, mieloperoxidasa, citocinas y radicales libres de oxígeno) y reparación (fibrosis y factores de crecimiento)²⁹. En general son modelos influenciables por la flora bacteriana intestinal y por diversos componentes dietéticos^34-40. Suelen ser altamente reproducibles y las especies animales empleadas, principalmente rata y ratón, fácilmente manipulables. La colitis experimental puede inducirse mediante la administración de enemas intracolónicos de ácido acético, ácido trinitrobenzenosulfónico (TNBS)/Etanol y Oxazolona. Otras vías de administración son la oral para los polímeros y polisacáridos sulfatados y la subcutánea para la ciclosporina e indometacina. Las colitis inducidas de forma oral cursan con una fase aguda que puede durar entre una y varias semanas, mientras que las colitis inducidas por enemas la fase aguda se limita a unos 3 días post-inducción²⁹. En este instante se observa un aumento de ciertos marcadores inflamatorios que se correlacionan con la gravedad del proceso inflamatorio intestinal. Estos mediadores inflamatorios provienen del metabolismo del ácido araquidónico (eicosanoides, COX), del metabolismo oxidativo (metabolitos reactivos de oxígeno, iNOS, mieloperoxidasa, etc.) y de reacciones inmunológicas a nivel intestinal (citoquinas, factores de crecimiento). En general, el proceso inflamatorio intestinal evoluciona sin aparición de nuevos brotes llegando a resolverse de forma espontánea.

Tradicionalmente, la colitis inducida por inmunocomplejos, carragenina o péptidoglicano-polisacárido se ha empleado en el estudio de las alteraciones inmunológicas intestinales. En el primero se ha demostrado la capacidad lesiva de neutrófilos y macrófagos activados por el complemento en el intestino de ratas⁴¹. En la colitis inducida por carragenina se produce una lesión cecal y colónica que reviste características crónicas. Las bacterias anaeróbicas luminales y Bacteroides vulgatus se han implicado en la patogénesis de esta colitis experimental³⁹. Por otro lado, los péptidoglicanos-polisacáridos procedentes de la pared de bacterias gram-positivas y gram negativas inyectados en diferentes tramos del intestino de la rata provoca después de 9 o 11 días la aparición de una enterocolitis granulomatosa, discontinua y transmural^42,43. Este modelo muestra una elevada variabilidad del proceso inflamatorio intestinal en función de la cepa de rata empleada y la implicación de linfocitos T, macrófagos, IL-1, TNF, la molécula de adhesión MadCAM-1 y elóxido nítrico en la fisiopatología inflamatoria^42-45.

Algunos de los modelos de colitis inducida se basan en características farmacológicas de los agentes empleados. La indometacina puede ser administrada a los animales de forma oral o subcutánea, el mecanismo patogénico se basa en la inhibición de la síntesis de prostaglandinas, lo que repercute negativamente en el mantenimiento de la función barrera mucosa intestinal⁴⁶. Los animales genéticamente más susceptibles pueden prorrogar el proceso inflamatorio crónico hasta 11 semanas (ratas Lewis) con la aparición de úlceras que se distribuyen de forma discontinua a lo largo del intestino delgado. Otra colitis medicamentosa que, al igual que la anterior, puede ser inducida vía subcutánea o vía oral es la que se consigue con ciclosporina A. Concretamente, los ratones previamente irradiados reciben médula ósea libre de células T maduras y son tratados con ciclosporina A. La finalización del tratamiento inmunosupresor reactiva la susceptibilidad del injerto contra el huésped y esto se traduce en la aparición de un síndrome inflamatorio que afecta, entre otros órganos, al intestino⁴⁷. En estos modelos se ha observado la determinante influencia de la flora intestinal en el desarrollo de esta colitis experimental^48,49. Estos modelos han proporcionado un acercamiento en el conocimiento de los mecanismos patogénicos de las células T⁴⁹.

Entre los modelos de colitis experimental más empleados en la actualidad destacan la colitis inducida por TNBS y la inducida por DSS. A diferencia de la colitis inducida por enemas diluidos de ácido acético⁵⁰, en la colitis inducida por TNBS o DSS se puede distinguir una fase aguda inicial que puede evolucionar hacia un proceso inflamatorio de características crónicas con presencia de estenosis, adherencias, engrosamiento de la pared intestinal, diarrea sanguinolenta y una significativa pérdida de peso de los animales.

Colitis inducida por TNBS

La colitis inducida por instilación intrarrectal de un enema de TNBS con etanol diluido fue descrito por primera vez en ratas por Morris y cols.⁵¹. Este modelo se ha reproducido en otras especies animales como en ratones y conejos²⁹. En general, existe una variabilidad en el curso clínico de esta patología entre cepas de animales de la misma especie y entre diferentes especies. Un sólo enema de TNBS llega a provocar una colitis de hasta 8 semanas de duración en las líneas de ratas más susceptibles, mientras que los ratones se muestran más resistentes a la inducción de la lesión intestinal^29,51. El enema de TNBS/etanol provoca una lesión continua, restringida al colon distal, con importantesáreas de necrosis y de afectación transmural (fig. 1). Se ha sugerido un mecanismo patogénico basado en la capacidad del etanol en debilitar la barrera mucosa, lo que facilitaría el contacto entre antígenos luminales colónicos y la lamina propria⁵¹. Consecuentemente, se iniciaría una fase inicial con la participación de macrófagos y neutrófilos activados por una gran variedad de estímulos que generan grandes cantidades de metabolitos altamente reactivos de oxígeno^51,52. Los efectos deletéreos pueden verse agudizados por la causticidad propia del TNBS que puede generar sustancias poderosamente citotóxicas como O₂- y H₂O₂⁵³. Adicionalmente, el TNBS (hapteno) puede modificar la estructura de proteínas de la superficie celular por su capacidad de unirse covalentemente a residuos de lisina y tirosina. Esto provoca una inmunoreactivación por parte de macrófagos y linfocitos T semejante a una reacción de hipersensibilidad retardada por alérgeno^53,54.

Colitis inducida por DSS

A diferencia de la colitis experimental inducida por TNBS, más semejante a la EC por el carácter transmural de las lesiones intestinales^29,51, la administración de concentraciones variables de DSS en el agua de beber provoca en ratones, ratas y hámsters lesiones colónicas que remedan a la Colitis Ulcerosa (CU). Las lesiones afectan a la mucosa y submucosa intestinal con presencia de ulceraciones, más evidentes en el colon izquierdo y que progresan distalmente. Cuando la administración oral de DSS se lleva a término de forma cíclica, los ratones llegan a desarrollar una colitis crónica que se puede prolongar varias semanas después del cese de la administración. Las lesiones crónicas suelen caracterizarse por la presencia de prominentes folículos linfoides y presencia de displasia epitelial. Consecuentemente, en las fases más avanzadas de este proceso inflamatorio intestinal, los animales tratados con DSS muestran una elevada incidencia de cáncer colónico¹⁷. El DSS es un polímero sulfatado con capacidad citotóxica sobre las células epiteliales intestinales y los macrófagos. Además, el DSS enteral favorece el aumento de bacterias anaeróbicas gram-negativas, lo que junto con el potencial erosivo sobre la barrera intestinal y la inapropiada respuesta de los macrófagos propiciaría la aparición de las lesiones intestinales^29,33.

En este modelo se ha observado la decisiva influencia de la flora intestinal en el desarrollo de las lesiones intestinales. En general, los tratamientos con antibióticos, prebióticos y probióticos consiguen mitigar la capacidad lesiva del DSS³⁴. La administración dietética de sustancias antioxidantes como vitaminas o inclusoácidos grasos dietéticos n3 disminuyen la lesión colónica paralelamente con un descenso en la producción local de LTB4, óxido nítrico y de citocinas proinflamatorias^35-37.

Modelos animales de colitis espontánea

A diferencia de los modelos animales anteriores, los modelos espontáneos representan una aproximación razonable al estudio de los factores que predisponen a padecer la EII. En estos modelos experimentales mutaciones en genes clave del sistema inmune conducen a procesos inflamatorios intestinales de diversa índole. En general, la sintomatología inflamatoria se intensifica progresivamente hasta la muerte del animal. El Tití de cabeza de algodón (Sanguinus oedipus) desarrolla de forma natural una colitis crónica, recurrente e influenciada por el estrés que sufren en cautividad. En su patogénesis se han implicado alteraciones del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y en genes relacionados con la producción de mucina¹⁹. De forma parecida, ratones C3H/HeJ cruzados de forma selectiva desarrollan un proceso inflamatorio espontáneo en el colon derecho, con presencia de ulceraciones perianales y coincidente con la colonización bacteriana del intestino⁶². Por otro lado, en las ratas transgénicas HLA-B27/β2m se ha puesto de manifiesto la participación de moléculas de clase I del MHC en un síndrome inflamatorio sistémico que provoca colitis y artritis principalmente⁶³.

Delecciones homozigotas en genes que codifican para receptores a de células T (TCRα), TCRβ, TCRβδ y proteínas de clase II del MHC provocan una inflamación colónica crónica con prolapso anorrectal y sin ulceraciones ni diarrea sanguinolenta hacia los 3 ó 4 meses de vida64. Se ha sugerido un mecanismo patogénico basado en el descenso en la tolerancia a antígenos dietéticos o microbianos debido a la incapacidad de las células CD4+ [TCRα (-/-) o TCRβ (-/-)] de suprimir la actividad de las células B productoras de inmunoglobulinas que, eventualmente, producirían un ataque de características autoinmunes contra el propio epitelio colónico⁶⁵. De forma parecida, los ratones KO de Gα_i2 desarrollan una pancolitis entre las semanas 8 y 12 de vida⁶⁶. Las lesiones intestinales son más graves en el colon distal y en las etapas más avanzadas pueden aparecer perforaciones y adenocarcinomas intestinales. La familia de proteínas G es esencial en la transmisión citoplasmática de señales extracelulares capaces de regular la maduración de células inmunocompetentes y la producción de TNF⁶⁷. En el colon de ratones Gα_i2 (-/-) se ha observado un aumento de células CD4⁺ y una elevada producción de inmunoglobulinas G y M⁶⁸.

Se han generado varios modelos de ratones con mutaciones en genes de citocinas para el estudio de sus funciones biológicas in vivo. Entre estos modelos de ratones KO destacan los deficientes para la IL-2 y para la IL-10 por desarrollar una enterocolitis espontánea altamente reproducible e influenciable por el ambiente^30,69. Asimismo, ratones portadores de mutaciones que afectan a moléculas de la vía de señalización de la IL-10 (STAT3 y CRF2-4) o a la producción de TGFβ₁ o TNFα también cursan con inflamación intestinal. En los primeros, existe un cierto grado de similitud fenotípica con la enterocolitis de los ratones IL-10 (-/-), mientras que las mutaciones en TGFβ₁ o TNFα provocan un proceso inflamatorio multiorgánico^70-73.

Los ratones IL-2 (-/-) sufren un progresivo proceso inflamatorio intestinal con una elevada mortalidad entre los dos y los tres meses de vida. La colitis se desarrolla con diarrea crónica, intermitentemente sanguinolenta, y con prolapso rectal. Las lesiones se distribuyen de forma continua en el colon distal principalmente, afectando a la mucosa y submucosa. Histológicamente, presentan importantes áreas de ulceración, depleción de células mucilaginosas, hiperplasia y abscesos en las criptas intestinales⁶⁹. La etiología de la inflamación intestinal en ratones IL-2 (-/-) es similar a la de los ratones con mutaciones en TCR⁶⁵, aunque en los ratones IL-2 (-/-) la estimulación antigénica por parte de la flora intestinal no patógena es esencial para la aparición de colitis⁷⁴, Los animales deficientes para la IL-2 muestran similitudes patológicas con la CU. En ambas patologías, la mucosa colónica contiene un elevado número de células T (no TCRγδ⁺) y B activadas y un patrón similar de citocinas^69,75.

Diferentes aproximaciones terapéuticas se están llevando a cabo en estos modelos de colitis experimental espontánea. El bloqueo de ciertas citocinas pro-inflamatorias (p. ej.: IL-12) se han mostrado eficaces en el tratamiento de la colitis en los ratones IL-10 (-/-)⁷⁸. Contrariamente, los antiinflamatorios no esteroidales contribuyen a exacerbar la inflamación intestinal en este modelo⁷⁹. En estos modelos, altamente sensibles a las alteraciones de la flora bacteriana, el tratamiento con Lactobacillus sp. tiene un efecto preventivo en la aparición de la colitis.⁸⁰ Resultados recientes de nuestro laboratorio relacionan la disminución de los ácidos grasos n6 dietéticos con una mejor evolución de la colitis en ratones IL-10 (-/-)⁸¹.

Colitis inducida mediante transferencia de linfocitos

Los ratones inmunodeficientes SCID y Rag2(-/-) tienen una mutación que les provoca la deficiencia de células T y células B^15,82, mientras que la cepa de ratones transgénicos Tγε23 carecen totalmente de células T y células NK⁸³. En estos sistemas experimentales aceptan la transferencia de ciertas estirpes celulares y permiten estudiar su papel fisiopatológico en la EII.

Los ratones Tγε23 desarrollan colitis al ser trasplantados con médula ósea procedente de ratones normales⁸³. La patogénesis de esta colitis experimental se basa en la maduración aberrante de células T (células T TCRαβ⁺ y TCRγδ⁺) y células NK que provoca en los huéspedes un proceso inflamatorio de características Th-1⁸⁴. Por otro lado, la colitis inducida en ratones SCID al reconstituirlos con células T CD4⁺RB^high no se produce si se co-administran con células T CD4⁺RB^low y CD8⁺¹⁵. De la misma manera, las células productoras de IL-10 y TGFβ también pueden prevenir la colitis por transferencia de células T reactivas en estos ratones atímicos^76,85. Además, el tratamiento de los animales inmunodeprimidos con anti-TNF o anti-IFN consigue atenuar la colitis inducida por trasferencia de células CD4+RB^high86. Los linfocitos de la lamina propria CD4+TCRαβ⁺ se han relacionado con la patogénesis de la enfermedad inflamatoria en ratones IL-10 (-/-) y en humanos por inducir un proceso inflamatorio intestinal de tipo Th-1 en ratones Rag2(-/-) y SCID^87,88. En cualquier caso, una característica destacable de estos animales atímicos es la necesidad de la presencia de la flora intestinal para activar el proceso inflamatorio¹⁵.

Modelos animales de CCRh

Existe una larga trayectoria en el estudio de potenciales agentes protectores frente a la CCRh en modelos animales inducidos por carcinógenos, en ratones KO de diferentes oncogenes y en ratones inmunodeficientes xeno o alotrasplantados con células tumorales^1-6. La incidencia de tumores colónicos es el principal parámetro evaluado en estos sistemas experimentales. Si bien, otros marcadores intermediarios han permitido determinar los mecanismos de progresión y promoción tumoral. Se ha sugerido que el equilibrio entre proliferación y apoptosis es crucial en el mantenimiento de la homeostasis intestinal⁵. El aumento en la actividad de la Ornitina Decarboxilasa y de la PKC-β2, así como la expresión de diversos proto-oncogenes (c-myc y ciclina D1) se ha relacionado con un aumento de la proliferación del epitelio intestinal^5,90,91. Del mismo modo, el metabolismo del ácido araquidónico (COX-2, prostaglandina E₂ y sus receptores) y oxidativo (Nitritos/Nitratos, iNOS) se ha implicado en etapas de promoción y progresión tumoral en modelos animales de CCRh^3,90,92. Por otra parte, los focos de criptas aberrantes (FCA) son lesiones intestinales preneoplásicas que aparecen después de la administración de carcinógenos en las ratas. Los FCA contienen criptas con una abertura luminal alterada y la capa epitelial engrosada. Destacan sobre el resto de criptas normales por su mayor tamaño y por la existencia de una separación pericriptal⁹¹. En los FCA aparece una elevada actividad proliferativa, en algunas ocasiones fenómenos de displasia y mutaciones frecuentes en Kras (tabla II)^89,91. Además, estas lesiones premalignas se consideran precursoras del desarrollo adenoma-carcinoma intestinal en humanos⁹¹. Recientemente, se han descrito otras lesiones pre-cancerígenas como las criptas con acúmulos de β-catenina que también pueden considerarse biomarcadores específicos de la carcinogénesis colorectal⁹³.

Entre los modelos experimentales de cáncer colorectal no espontáneo destacan los inducidos por derivados de 1,2-dimetilhidrazina como el azoximetano (AOM). La administración subcutánea de AOM induce la formación de tumores predominantemente en el colon distal de ratas y ratones. El metabolismo de este carcinógeno genera sustancias citotóxicas para los colonocitos a las pocas horas de la inducción⁸⁹. Esta etapa de iniciación se caracteriza por cambios en la homeostasis del epitelio intestinal que conducen al aumento de la proliferación. Paralelamente, el AOM puede introducir mutaciones que confieren un elevado potencial de transformación neoplásica a las células intestinales que escapan de la apoptosis. Se ha observado un progresivo aumento en la formación de FCA, la aparición de mutaciones en K-ras y β-catenina, e inestabilidad de microsatélites en el colon de animales inducidos con AOM. Estas características fenotípicas de progresión oncogénica por administración de AOM son similares histopatológicamente a la progresión de la CCRh^90,91,93. No obstante, a diferencia de lo que sucede en humanos, los tumores inducidos por AOM muestran una baja frecuencia en mutaciones de APC (< 10%) e inexistente para p53 y DCC (tabla II)⁹⁰. Otros carcinógenos procedentes de la cocción de carnes y pescados, menos empleados en el estudio de la carcinogénesis colorrectal, son las nitrosaminas y aminas heterocíclicas como 2-amino-1-metil-6-fenilimidazol[ 4,5-b]piridina (PhIP). El PhIP induce un proceso carcinogénico con aparición de lesiones preneoplásicas (FCA), sin mutaciones en K-ras ni p53, pero con una frecuencia de mutaciones en APC cercana al 15% e inestabilidad de microsatélites (tabla II)^2,94. Una de las particularidades de los modelos inducidos de CCRh en los estudios de quimioprevención es que los tratamientos pueden iniciarse antes de la inducción con el carcinógeno, en la etapa de iniciación, a través de la fase de promoción-progresión tumoral o durante todos los períodos.

En la década de los 90 se generó un ratón KO (Min) que desarrolla de forma espontánea un rápido y múltiple proceso neoplásico intestinal similar a la PAF y a la mayoría de cáncer colorrectal esporádico humano⁹⁵. El ratón Min es portador de una mutación dominante que consiste en una delección inactivadora del gen Apc (codón 850), homólogo del gen APC humano. La alteración del gen Apc impide la degradación de la β-catenina citoplasmática a través de la vía señalizadora Wnt²⁷. La estabilización de la β-catenina en el citoplasma conlleva la activación de factor de transcripción nuclear β-catenina/Tcf que puede activar diversos genes diana relacionados con el control del ciclo celular. Actualmente existen ratones viables Apc (+/-), los Apc (-/-) no lo son, con alteraciones en los codones 580, 716, 1309 y 1.638 del gen Apc y con mutaciones adicionales en oncogenes o protoncogenes (Mlh1, Msh2, iNOS y COX-2)^2,3,13. De forma similar a los humanos, las delecciones en diferentes codones de Apc implican fenotipos heterogéneos en el proceso neoplásico intestinal. Los ratones Apc(+/-)^Δ850 desarrollan menos pólipos adenomatosos intestinales que el doble mutante Apc(+/-)^Δ850Msh2 (-/-) y que Apc (+/-)^_716 [40 ± 20 vs 165 ± 145 vs 250 ± 95, respectivamente], mientras que los dobles mutantes Apc (+/-)/COX-2 (-/-) o iNOS (-/-) muestran menos pólipos intestinales que la línea Apc (+/-)^Δ850. No obstante, existen diferencias sustanciales entre el modelo de ratones Min y la CCRh. En humanos, los adenomas suelen encontrarse tanto en el colon como en el duodeno, mientras en los ratones Min se disponen principalmente a lo largo del intestino delgado⁹⁵. Además, a diferencia de lo que sucede en la CCRh y en los modelos inducidos, los microadenomas presentes a las pocas semanas de vida en los ratones Apc (+/-) limitan su crecimiento, lo que comporta una baja incidencia tumoral en edades más avanzadas y sugiere que la mutación en Apc es condición necesaria pero no suficiente para el desarrollo de tumoral⁹³. Tampoco han sido detectadas mutaciones en K-ras y p53 en este modelo de neoplasia intestinal espontánea, contrariamente a lo que se observa en los tumores colónicos humanos^2,91. Aunque los mecanismos implicados la aparición de las lesiones intestinales no se conocen con exactitud, recientemente se ha observado la presencia de mutaciones adicionales bialélicas del gen Apc en los adenomas intestinales de los ratones Apc (+/-)⁹³.

Los ratones inmunodeficientes (SCID) pueden ser inyectados o xenotrasplantados subcutáneamente con líneas inmortalizadas de células cancerígenas (HCT-116 y HCA-7), tumores sólidos o células tumorales aisladas humanas³. En estos sistemas experimentales se ensayan potenciales terapias anticancerígenas en fase preclínica donde se evalúa el volumen de los tumores y el tiempo de vida de los animales tratados con nuevos compuestos farmacológicos respecto a los no tratados (fig. 2)⁹⁶. Sin embargo, la localización subcutánea de estos injertos no se corresponde con la localización intestinal inicial. En consecuencia, el cambio de ubicación puede alterar el comportamiento de las células cancerígenas y tumores intestinales injertados frente a las diferentes terapias estudiadas. En este sentido, el trasplante ortotópico de tumores humanos histológicamente intactos, incluyendo tumores extraídos directamente del paciente, supone un modelo más adecuado para el estudio de nuevos fármacos inhibidores del crecimiento tumoral en el intestino de estos ratones atímicos¹⁶.

Prácticamente en todos los modelos animales de CCRh se ha demostrado el carácter protector de los antiinflamatorios no esteroidales (Aspirina, Ibuprofeno, Piroxicam, Sulindac, etc.) y los inhibidores de la COX-2 (Celecoxib)^1-3,89. Asimismo, en estos modelos in vivo de cáncer intestinal se ha puesto de manifiesto los efectos perjudiciales de ciertos hábitos no saludables del estilo de vida occidental. En este sentido, el elevado consumo de grasa, principalmente de origen animal y ácidos grasos n6, y el descenso en la ingesta de los ácidos grasos n3, Calcio, vitamina D, ácido fólico y celulosa se han asociado a un aumento de los procesos neoplásicos intestinales tanto en los modelos experimentales como en los estudios epidemiológicos sobre la CCRh^1,4-6,92.

Consideraciones finales

En la actualidad, los modelos experimentales in vivo inducidos de EII y CCRh se han visto complementados con la aparición de los modelos genéticos. Esto ha supuesto una indudable mejora en la comprensión de los mecanismos moleculares y celulares relacionados con estas patologías intestinales humanas. Además, el uso de modelos combinados o con dobles mutantes reproducen situaciones experimentales fenotípicamente cercanas al modelo humano. Hoy por hoy, estos modelos in vivo suponen una aproximación razonable al estudio de nuevas dianas terapéuticas y al conocimiento de hábitos no saludables de nuestro estilo de vida. A pesar de ello, los sistemas experimentales in vivo actuales no consiguen reproducir completamente la complejidad de la EII y la CCRh. En el futuro aparecerán nuevos modelos genéticos viables de ratones KO y animales con modificaciones en la funcionalidad de proteínas concretas (knock-in) que nos permitirán mejorar los actuales. Estos modelos, junto con la tecnología de microarrays para expresión génica y la proteómica, constituirán poderosas herramientas para profundizar en el conocimiento fisiopatológico de la EII y la CCRh.

Agradecimientos

A las licenciadas E. Pedrosa, V. Lorén por aportarme datos recientes de sus últimas investigaciones y a la Diplomada P. Milke por ayudarme en los aspectos formales del texto.

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Dirección para correspondencia: ]]> Josep Mané Almero
Servicio de Aparato Digestivo
Hospital Universitari Germans Trias i Pujol
Fundació Institut d’ Investigació en Ciències de la Salut GTiP
Ctra. Canyet, s/n (Camí de les Escoles)
08916 Badalona (Barcelona)
E-mail: j_manye@yahoo.es
udpde@yahoo.es

Recibido: 2-XI-2006.
Aceptado: 9-XI-2006.