Modelos animales de fallo hepético fulminante
Animal models of fulminant hepatic failure
M. J. Tuñón*, M. Álvarez**, J. M. Culebras*** y J. González-Gallego*
*Ciberehd e Instituto de Biomedicina. Universidad de León. **Departamento de Sanidad Animal. Universidad de León. ***Complejo Asistencial de León. Sacyl. León. España.
Este trabajo ha sido subvencionado en parte por los proyectos de investigación concedidos por el FIS (Ref. PI021121) y la Junta de Castilla y León (Ref. LE61/03 y LE04/04).
Dirección para correspondencia
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RESUMEN
El fallo hepático fulminante (FHF) es un síndrome clínico muy grave, asociado con alta mortalidad, a pesar de los grandes avances que se han producido en los últimos años en la terapia tanto del manejo de los cuidados intensivos mediante diversos soportes hepáticos bioartificiales como del trasplante hepático. Tanto el conocimiento como el tratamiento del FHF han estado limitados por la falta de modelos animales satisfactorios. Así, han sido muchos los intentos de desarrollar un modelo adecuado, entre los que se incluyen los modelos quirúrgicos, tales como la hepatectomía y desvascularización total y/o parcial, la utilización de sustancias químicas con toxicidad hepática tales como el acetaminofeno, azoximetano, galactosamina, tioacetamida, entre otras. Ahora bien, la mayor parte de estos modelos no reflejan de modo idóneo el patrón de la enfermedad humana de FHF y todos ellos presentan importantes limitaciones. A pesar de que la hepatitis vírica es una de las etiologías más frecuentes de FHF, el uso de agentes víricos para desarrollar modelos animales ha sido escaso y desafortunado. Nuestro grupo ha desarrollado recientemente un modelo animal mediante la inoculación de conejos con el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo que presenta características bioquímicas, histológicas y signos clínicos compatibles con el FHF del hombre. En el trabajo se resumen los modelos animales más utilizados asi como las ventajas e inconvenientes más reseñables de cada uno de ellos.
Palabras clave: Fallo hepático fulminante. Modelos quirúrgicos. Modelos químicos. Modelos víricos.
ABSTRACT
Fulminant hepatic failure (FHF) is a very serious clinical síndrome that, in spite of the important therapeutical advances that have taken place in the last years by means of bioartifical hepatic support devices and hepatic transplantation, is still associated to a high mortality. Knowledge and treatment of the FHF have been limited by the lack of satisfactory animal models. Among the attempts to develop a suitable model are surgical models, such as hepatectomy and total and/or partial devascularization, or the use of chemical substances with hepatic toxicity, such as acetaminophen, azoximethane, galactosamine or thioacetamide, among others. However, most of these models do not adequatly reflect the pattern of the human disease and all of them present important limitations. Although viral hepatitis is one of the most frequent causes of FHF, the use of viral agents to develop animal models has been little and unfortunate. Our group has recently developed a viral animal model of FHF by means of the inoculation of rabbits with the virus of the rabbit hemorrhagic disease. This model displays biochemical, and histological characteristics, and clinical signs that ressemble those in human FHF. In the present article, the most widely used animal models of FHF, together with their main advantages and disadvantages, are presented.
Key words: Fulminant hepatic failure. Surgical models. Chemical models. Viral models.
Introducción
]]> El fallo hepático fulminante (FHF) es un síndrome clínico muy grave asociado con una alta mortalidad1 a pesar de los grandes avances que se han producido en los campos tanto del manejo de los cuidados intensivos como del trasplante hepático2,3. Desde que en 1970 Trey y Davidson4 propusieron una definición del FHF, algunos autores han aportado distintas clasificaciones con el objetivo de establecer un pronóstico y una acción terapéutica en cada caso basándose fundamentalmente en la duración del periodo de tiempo transcurrido entre el inicio de los síntomas clínicos o la aparición de ictericia y el desarrollo de encefalopatía. Así, en el King’s College Hospital de Londres, O’Grady y Williams5 propusieron tres categorías: fallo hepático hiperagudo, agudo y subagudo, mientras que, en el Hospital Beaujou de París se clasificó en fallo hepático fulminante, cuando la encefalopatía se desarrolla dentro de las dos semanas de iniciada la ictericia, y en fallo hepático subfulminante cuando se desarrolla entre las dos y doce semanas6,7. Estos criterios siguen utilizándose en la actualidad en clínicas de reconocido prestigio8.El FHF se caracteriza por un rápido deterioro de la función hepática con desarrollo de encefalopatía hepática en pacientes sin historia previa de enfermedad hepática o con alteraciones hepáticas crónicas9 que produce un desequilibrio en el que se ven involucradas una gran cantidad de señales de citocinas y de muerte celular en el contexto del daño hepacelular10. La etiología del FHF es muy diversa e incluye: hepatitis víricas, hepatotoxinas, lesiones vasculares, hepatitis autoinmune, alteraciones metabólicas y deformidades anatómicas hepáticas, si bien, en una gran proporción de pacientes es desconocida. En un estudio sobre su etiología realizado en España durante un período de 6 años (1992-1998), se indicó que los principales agentes etiopatogénicos del síndrome eran: hepatitis víricas (39%), causa desconocida (30%), tóxicos o fármacos (21%) y otros (10%). El estudio puso de relieve que el 15% de los pacientes se recuperó con las medidas convencionales, el 56% precisó trasplante hepático urgente y el 29% murió antes del trasplante11.
La hepatitis vírica aguda constituye una causa frecuente de FHF6,12,13. Los virus causantes de las hepatitis A, B, D y E son capaces de desencadenar FHF. El virus de la hepatitis B es la principal causa a escala mundial, llegando a ser responsable del 70% de los casos de origen vírico14. El virus de la hepatitis E provoca FHF sobre todo en mujeres en el tercer trimestre de embarazo con gran incidencia en diferentes zonas de Africa y Asia15. Otros virus implicados son: herpes simple, varicela-zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, herpes humano tipo 6, adenovirus y paramixovirus, principalmente en estados de inmunosupresión16.
Los anti-inflamatorios no esteroideos, analgésicos y antibacterianos se encuentran entre los fármacos que con mayor frecuencia pueden desencadenar FHF6,17,18. En la actualidad, se considera que el paracetamol, los antirretrovirales y los fármacos anti-tuberculosos son los principales implicados en ocasionar daño hepático agudo; de hecho, aunque la incidencia de FHF de etiología farmacológica sigue siendo baja, se ha observado en España y en Suecia que la ictericia hepatocelular aguda inducida por fármacos se asocia con la muerte o con la necesidad de un trasplante en al menos un 10% de los casos19,20.
Existen otras causas poco frecuentes de FHF como las asociadas al embarazo (ruptura hepática espontánea), enfermedad veno-oclusiva, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, metástasis tumorales, sepsis, isquemia y fracaso de trasplante hepático21,22.
El FHF es un síndrome que se produce como consecuencia del fallo funcional de una gran parte del parénquima hepático y cuya gravedad es proporcional al grado de daño hepático. El FHF causa profundas alteraciones fisiológicas caracterizadas por encefalopatía, trastornos hemodinámicos y coagulopatía con desarrollo frecuente de edema cerebral y fallo renal16,23,24. Su diagnóstico se basa en datos bioquímicos y hematológicos que evidencian la hipofunción celular hepática. La investigación sobre los mejores índices predictivos es un campo en continuo desarrollo25. En este sentido, se considera un buen índice predictivo el alargamiento del tiempo de protrombina que no se corrige con vitamina K y la disminución del factor V26. Finalmente, uno de los campos que reciben mayor interés es el estudio de todos los factores que influyen en la apoptosis y la regeneración hepática en este complejo síndrome27.
La fisiopatología de todas estas alteraciones es unárea de enorme interés. Parece obvia la existencia de una interrelación entre distintos mecanismos patogénicos que desencadenan los desequilibrios circulatorios. De hecho, la interacción entre el endotelio, el músculo vascular, las toxinas bacterianas, las citocinas, los radicales libres y otros componentes de la cascada de la respuesta inflamatoria provoca la pérdida del control vascular y la lesión local con pérdida de la integridad endotelial y las alteraciones en el flujo sanguíneo de la microcirculación28. El endotelio parece ser el primero en liberar agentes vasoactivos que afectarían al modelo de flujo sanguíneo local y distal en la fase crítica de la enfermedad, siendo componentes esenciales el NO, las prostaciclinas y las endotelinas.
Las manifestaciones clínicas y los análisis laboratoriales son comunes en el FHF de diferentes etiologías, salvo peculiaridades específicas. La encefalopatía hepática constituye un criterio diagnóstico y se debe probablemente a la acumulación de amonio y mercaptanos, alteraciones en las vías glutamatonérgicas, serotoninérgicas y noradrenérgicas, producción de neurotransmisores falsos, activación de receptores centrales del ácido gamma-aminobutírico/benzodiazepina y la alteración del metabolismo energético29-31. La hiperbilirrubinemia es casi siempre de tipo conjugado y la ictericia es un signo precoz y rápidamente progresivo. Se producen graves trastornos de la coagulación por diferentes mecanismos. El consumo del factor V refleja un daño hepático independientemente de los niveles de vitamina K. La insuficiencia renal aparece en el 30-75% de los casos y se asocia a un peor pronóstico. También es frecuente la trombocitopenia32.
El aumento de las concentraciones plasmáticas de aminoácidos aromáticos (AAA) y los valores normales o ligeramente aumentados de los aminoácidos de cadena ramificada (ACR) son hallazgos típicos en los pacientes con FHF30; de hecho un parámetro clínico fundamental en el FHF es el índice de Fischer, es decir, la relación molar entre los ACR/AAA, que disminuye con el incremento de gravedad de la alteración hepática33. Así se ha descrito en diversos modelos animales, tanto quirúrgicos34 como utilizando galactosamina35, un aumento significativo de los aminoácidos fenilalanina y tirosina y una disminución del índice de Fischer.
El estudio de la patogénesis del fallo multiorgánico en el FHF y en particular los mecanismos moleculares de regeneración hepática son investigaciones que gozan de un enorme interés36. En animales de experimentación con hepatectomía parcial se han estudiado los mecanismos de regeneración hepática, desde la activación de factores de transcripción hasta la entrada y progresión de los hepatocitos vía el ciclo celular con la eventual síntesis de ADN y división celular37. Aunque se sabe poco acerca del proceso regenerativo hepático en el FHF, es obvio que hay un variable, aunque marcado, grado de pérdida y daño celular en el hígado junto con una ausencia de actividad regeneradora38. Los niveles plasmáticos del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) y del factor de crecimiento transformador beta (TGF-β) se elevan. Así, el nivel del HGF es inversamente proporcional a la prognosis39. También es evidente un incremento en la actividad del sistema fibrinolítico que es responsable de la activación tanto del HGF como del TGF-β40. Se ha indicado que el suero de personas afectadas de FHF tiene un efecto negativo sobre el crecimiento de células en cultivo comparado con el suero control debido a la inhibición de la proliferación celular y no a un aumento de la necrosis y/o de la apoptosis celular41. Recientemente, se ha demostrado, en diversos modelos animales de FHF, que la sobreexpresión de calpastatina, un inhibidor endógeno de la calpaína, evita la progresión del daño hepático cuando la regeneración hepática está comprometida42.
]]> En resumen, nuestro conocimiento de las bases patofisiológicas del síndrome neurológico del FHF ha avanzado considerablemente y se están utilizando nuevas terapias para reducir el amonio y su captación cerebral, alterar el metabolismo del glutamato y posiblemente utilizar una terapia frente a las citocinas proinflamatorias. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre las bases patofisiológicas de la alteración hemodinámica, la disfunción inmunológica y el fallo multiorgánico se encuentra en un estado muy rudimentario por lo que es fundamental una profundización de sus bases moleculares43. Por otro lado, aunque en losúltimos años se han propuesto y aplicado una gran cantidad de opciones terapéuticas para el FHF, solamente el trasplante hepático ha sido ampliamente aceptado por los especialistas clínicos, pero no siempre resulta posible por la falta de donantes, su elevado coste, la dificultad técnica, viabilidad y la desventaja de requerir tratamiento farmacológico inmunosupresor durante toda la vida, con la dificultad añadida de que los inmunosupresores utilizados actualmente producen efectos secundarios adversos en riñón, hígado y otros órganos38. Los métodos de soporte artificial tales como la destoxificación extracorpórea a través de sistemas de recirculación por absorbentes (MARS)44 y las terapias basadas en células reciben cada vez más atención25,45,46pero aún son técnicas que requieren demostrar de forma fehaciente su eficacia y viabilidad47. En términos de aplicación clínica son absolutamente necesarios estudios funcionales en modelos animales2.
Modelos animales de fallo hepático fulminante (FHF)
Existen pocas condiciones en medicina que sean más graves y desalentadoras que el FHF. Tanto el conocimiento como el tratamiento de este síndrome han estado limitados por la falta de modelos animales satisfactorios. Así han sido muchos los intentos de desarrollar un modelo adecuado y reproducible utilizando una gran variedad de especies y de modalidades, desde los modelos inducidos por manipulación quirúrgica, entre los que se incluyen la isquemia hepática la hepatectomía completa y la utilización de sustancias hepatotóxicas tales como acetaminofeno, azoximetano, concanavalina A, sulfoximina butionina, galactosamina y amatoxina-endotoxina, entre otras. Sin embargo, hasta el momento actual no se ha descrito un modelo sencillo que refleje de modo idóneo el patrón de la enfermedad humana de FHF y los que se utilizan presentan importantes limitaciones48,49.
El modelo ideal debería presentar criterios clínicos y bioquímicos bien definidos que, como los criterios pronósticos del King College para el FHF12, sean capaces de lograr una estimación acertada de prognosis. Sin embargo, ninguno de los modelos desarrollados hasta ahora cumple estas premisas. Además, los criterios clínicos y bioquímicos utilizados para indicar la existencia de FHF en modelos animales a menudo tienen poco parecido con los usados en la práctica clínica. Así, por ejemplo, la estimación de la presión intracraneal en modelos animales se suele realizar indirectamente mediante la medida del amonio o el electroencefalograma. A pesar de todo ello, y dado el estado de conocimiento del FHF y las dificultades que supone la investigación en pacientes, los modelos animales tienen un papel fundamental en los estudios futuros. Por tanto, aunque se están realizando progresos, la búsqueda debe continuar en este campo con objeto de obtener un modelo animal potente, idóneo, con las mínimas desventajas y que sea capaz de reflejar con precisión el síndrome clínico de humanos27,41.
Un modelo ideal de FHF, según criterios ampliamente reconocidos por la comunidad científica (tabla I)50, debería cumplir una serie de requerimientos entre los que se incluyen: que el modelo pueda ser reversible en el sentido de que algunos animales puedan sobrevivir al proceso si se utiliza un tratamiento adecuado; los resultados obtenidos deben ser reproducibles, esto es, conducir a la muerte en un intervalo de tiempo determinado y que la extensión del daño hepático pueda ser medible y estandarizable. Además, la muerte debe producirse por fallo hepático, es decir, los acontecimientos producidos tras el daño tienen que reflejar el patrón clínico típico del hombre y la muerte debe ser el resultado directo del daño producido al hígado; por consiguiente, los animales no tratados deberían morir con signos de fallo hepático progresivo en un período de tiempo conocido. Además, el animal debe ser de un tamaño suficiente como para permitir una adecuada toma seriada de muestras sanguíneas y de diversos tejidos mientras se llevan a cabo los tratamientos adecuados. Y, finalmente, todos los métodos utilizados deben presentar el menor riesgo para las personas involucradas en los estudios.
Aunque, la mayoría de los casos de FHF son de etiología vírica, la mayor parte de los modelos animales se basan en técnicas quirúrgicas o en daño producido por diversas sustancias químicas (tabla II). Así, se han llevado a cabo numerosos estudios con el fin de lograr modelos aplicables de FHF, unos denominados"modelos quirúrgicos" incluyen la utilización de isquemia hepática y hepatectomía parcial y/o total, y los denominados "modelos químicos" que se basan en la utilización de diversas drogas, toxinas y venenos tales como acetaminofeno, azoximetano, concanavalina A, butionesulfoximina, galactosamina, halotano, tioacetamida, amatoxina-endotoxina, etc. sin que hasta el momento ningún modelo refleje de manera apropiada el patrón humano de FHF y con frecuencia posean limitaciones muy significativas.
Modelos quirúrgicos
Los modelos quirúrgicos de FHF pueden ser catalogados en tres categorías: la hepatectomía (total o parcial), la desvascularización (total o parcial) y aquellos que resultan de la combinación de los dos anteriores.
]]> Hepatectomía total y parcialLos modelos quirúrgicos de eliminación total y/o parcial del hígado se han desarrollado con éxito en diversas especies animales después del primer intento realizado en perros por Mann en 192151. En cerdos se describió un modelo, potencialmente reversible, que combina la hepatectomía parcial (70%) con la derivación portocava y produce la muerte por FHF después de un período de tiempo suficientemente largo como para permitir estudios sobre soportes hepáticos; el animal es de tamaño adecuado y la técnica no presenta peligro52.
Se ha podido establecer en ratas que una resección del 95% del hígado es un buen modelo de FHF53, mientras que en ratones una hepatectomía de menos del 90% es el límite de seguridad como modelo de estudio de regeneración hepática ya que por encima de dicho valor se encuentra en un nivel de fallo hepático mortal54.
La hepatectomía total del hígado presenta los inconvenientes de la ausencia de productos de la necrosis hepática y transmisores de señales tan fundamentales en el mecanismo patogénico del fallo hepático. Por otro lado sus ventajas se limitan a la reproductibilidad y a su utilidad para el estudio de diversos soportes artificiales in vivo en ausencia de los productos tóxicos eliminados o producidos por el hígado dañado. A pesar de los inconvenientes reseñados la hepatectomía total se ha utilizado en ratas para estudios de regeneración hepática55 y en cerdos como modelo reproducible para comprobar la eficacia y función de diversos sistemas temporales de soporte hepático56.
Se ha podido demostrar en ratas sometidas a diversos grados de hepatectomía parcial, mediante análisis de ADN, que el FHF inducido es consecuencia tanto del incremento en la apoptosis como de la disminución de la regeneración hepática57.
En los últimos años se han realizado diversos avances sobre las técnicas originales, como la utilización de diversas modalidades de prótesis58 o el trasplante intraperitoneal de células de la médula ósea bioencapsuladas en ratas con un 90% de hepatectomía59.
Desvascularización
La desvascularización completa del hígado se ha utilizado con éxito para inducir un fallo hepático reproducible en cerdos que pueda ser utilizable para el estudio de diversos sistemas de soportes hepáticos artificiales y/o bioartificiales60-62 o para la constatación del efecto de sustancias antioxidantes tales como la Nacetilcisteína63. Así, por ejemplo se desarrolló un modelo reproducible en minicerdos por la desvascularización reversible mediante ligadura de la arteria hepática y anastomosis portocava en el que se monitorizó la presión intracraneal además de otros parámetros clásicos indicativos de FHF. Este modelo presenta una ventana terapéutica de unas 8 horas lo que podría permitir la realización pruebas con diversos soportes de hígado bioartificiales64.
Para comprobar la eficacia de diversos sistemas de soporte tanto bioartificiales como artificiales se utilizan con frecuencia modelos animales de mayor tamaño como el cerdo al que se le induce un fallo hepático mediante la isquemia del órgano por derivación portocava y ligadura de la arteria hepática65 o mediante desvascularización total60.
En un modelo realizado en perros mediante el pinzamiento total de la tríada portal se comprobó que el daño producido por la isquemia-reperfusión ocasionado por el procedimiento quirúrgico era menor tras la administración de un antagonista del receptor B2 de la bradiquinina66. También se ha utilizado un modelo de FHF en perros mediante una derivación portocava combinada con ligadura del conducto biliar para comprobar un nuevo sistema de hígado bioartificial mediante la inoculación de hepatocitos porcinos en biorreactores67. Recientemente, se ha desarrollado un modelo porcino en el que se combina una resección del 75-80% del hígado después de un periodo de isquemia68.
]]> En estudios realizados sobre el tiempo de supervivencia, la facilidad técnica, seguridad y reproductibilidad de los dos principales tipos de modelos quirúrgicos de FHF, se puso de manifiesto que la desvascularización parece más útil para estudiar el desarrollo y tratamiento del FHF causado por la isquemia y sus efectos secundarios, mientras que la hepatectomía parcial parece superior en la investigación del estatus de la falta del hígado y el tratamiento del FHF mediante sistemas de soportes hepáticos bioartificiales69.Modelos inducidos por sustancias químicas
El uso de agentes químicos tales como el acetaminofeno/sulfoxinina butionina o galactosamina aunque en algunos casos pueden reproducir un número de importantes características clínicas tales como la hipoglucemia, encefalopatía y aumento de enzimas hepáticos, requieren la administración repetida, una monitorización estrecha de sus concentraciones o una terapia de soporte y existen un gran número de factores que pueden causar variabilidad entre distintos experimentos. Además, la constatación de hipertensión intracraneal, una de las características principales del FHF en el hombre, no siempre se produce y, en otros casos, tampoco se ha demostrado el aumento de las toxinas implicadas en la encefalopatía hepática y el edema cerebral del FHF del hombre. A pesar de ello el uso de sustancias químicas hepatotóxicas se ha utilizado y se utiliza con frecuencia como modelo de FHF.
Acetaminofeno
El acetaminofeno (paracetamol) es un fármaco de uso común que puede causar daño hepático; de hecho, es el agente utilizado con mayor frecuencia para el suicidio en el Reino Unido, a pesar de la existencia de un antídoto, la acetilcisteína. La toxicidad del acetaminofeno es dosis-dependiente, pero su efecto puede ser exacerbado por el ayuno, fármacos inductores del sistema citocromo P-450 y de forma especial por el alcohol. Recientemente, se ha indicado, tanto en cultivos de hepatocitos como en ratones, que la vía de las c-jun quinasas terminales (JNK) juegan un papel fundamental en el efecto tóxico del fármaco70.
Los resultados de numerosos estudios en modelos animales en los que se utiliza el acetaminofeno para inducir fallo hepático agudo reflejan resultados no muy homogéneos debido a la existencia de importantes variaciones en el metabolismo hepático de destoxificación del fármaco relacionadas con la especie y con la edad71,72. El metabolismo de biotransformación hepática del acetaminofeno se produce en condiciones normales por reacciones de glucuronización y sulfatación para ser después eliminado por la vía renal. Cuando el fármaco se encuentra en exceso, se saturan las vías normales de destoxificación y es metabolizado por el sistema enzimático del citocromo P-450 a Nacetil-p-benzoquinoneimina que, a no ser que se conjuge con el tripéptido glutatión, es capaz de inferir daño hepático mediante la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial, la depleción de ATP y el estrés oxidativo y nitrativo que conducen a la apoptosis y necrosis celular73. Por ello, con el fin de potenciar la toxicidad del acetaminofeno se administran diversos inductores del sistema citocromo P-450, se produce la depleción de glutatión74 o bien se combinan ambos factores72.
Otro aspecto importante que no se ha estandarizado en estos modelos y que conlleva resultados diferentes es la dosis óptima del fármaco, la vía más adecuada de administración y la necesidad o no de la inducción previa del sistema enzimático citocromo P-45074,75. Aspectos que se traducen en alguno de los inconvenientes más importantes de estos modelos como son la falta de reproductibilidad y la variabilidad en el tiempo que transcurre entre el daño infringido y la muerte de los animales48,50. Además, en algunos modelos en roedores se han señalado importantes diferencias en las concentraciones de las principales proteínas de la coagulación respecto a las encontradas en el FHF del hombre76.
A pesar de los inconvenientes reseñados, los modelos animales de FHF inducido por acetaminofeno siguen siendo utilizados para estudiar aspectos tales como la implicación de diversos mediadores de la respuesta inflamatoria77, la regeneración hepática42 y la terapéutica con hepatocitos humanos inmortales78.
Galactosamina
La D-galactosamina es una sustancia que metabolizada por la vía de la galactosa en el hígado, mediante la depleción de diversos intermediarios intracelulares de uridina, produce graves alteraciones en el metabolismo del ARN de los hepatocitos y finalmente la necrosis hepática48,79 por lo que se ha utilizado para desarrollar modelos de FHF. En uno de los primeros modelos en conejos80 se produjo la muerte entre las 21 y las 44 horas precedida por un periodo de coma de 2,6 horas de media y con hallazgos bioquímicos e histológicos compatibles con el FHF; además, se pudo comprobar en esta misma especie que la hepatotoxina no atravesaba la barrera hematoencefálica81. Más recientemente se ha utilizado la galactosamina en perros anestesiados, modelo en el que también se ponen de manifiesto los efectos característicos del fallo hepático humano como son el aumento en las enzimas marcadoras de daño hepático, bilirrubina, amonio, lactato y la coagulopatía asociada, hipoglicemia, coma y aumento de la presión intracraneal34; sin embargo, en perros sin anestesiar los efectos no fueron semejantes probablemente por el efecto añadido del anestésico en el primer caso. Ahora bien, en otros estudios o bien faltan datos significativos, especialmente los aumentos en la presión intracraneal, o bien los resultados no son muy homogéneos ya que existe una importante diferencia en la sensibilidad a la galactosamina en diferentes especies. Además, el intervalo existente entre el daño infringido a los animales y la muerte presenta muy poca uniformidad, es un agente que resulta caro para su uso en modelos grandes y finalmente carece de inocuidad49.
]]> En cerdos se ha desarrollado un modelo reproducible que puede ser utilizado por su tamaño para la evaluación de diversos sistemas de soporte diseñados para el tratamiento del FHF en humanos82. En cualquier caso son numerosos los estudios relacionados con el uso de galactosamina en diversas especies animales con el fin de mejorar el conocimiento del daño renal que acompaña al FHF83 y de las vías metabólicas hepáticas durante el mismo84. También ha merecido atención el estudio de los posibles efectos de diversas sustancias como la proteína quimérica hiper-IL-685, la cardiotropina 186 o la fructosa 1,6 difosfato en ratas87. Asimismo, estos modelos se han utilizado para comprobar diversos sistemas de asistencia hepática extracorpórea88y sistemas bioartificiales tales como el uso de hepatocitos transfectados con el gen humano del antagonista del receptor de la interleucina 1 en ratas89o el uso de biorreactores con hepatocitos porcinos en cerdos46 así como los efectos potenciales del drenaje del líquido cefaloraquídeo y la craneotomía descomprensiva en la rata90.Tetracloruro de carbono
El uso de tetracloruro de carbono ha sido ampliamente utilizado como inductor de daño hepático crónico, especialmente como modelo de cirrosis hepática primaria91. Ahora bien, como agente inductor de FHF su uso ha sido muy restringido por ser muy poco reproducible y muy variable interespecíficamente49,92. Su mecanismo de acción se lleva a cabo en el retículo endoplasmático por la formación de intermediarios reactivos mediante su metabolismo a través de diversas isoenzimas del sistema citocromo P-45093. Este mecanismo también involucra importantes alteraciones en la homeostasis del calcio mitocondrial y es dependiente de la dosis utilizada94.
En cerdos se realizó un modelo relativamente uniforme que indujo coma y muerte en un período de entre 12 y 52 horas mediante la combinación de pretratamiento con fenobarbital y dos horas de interrupción del flujo sanguíneo arterial seguido de la administración de la toxina por vía intragástrica95.
En ratas se ha comprobado que la inyección de tetracloruro de carbono induce de modo concomitante tanto los procesos de daño agudo como los de regeneración hepática96. El tetracloruro de carbono se utiliza como una sustancia modelo para dilucidar el mecanismo de acción de efectos hepatotóxicos tales como la degeneración grasa, fibrosis, muerte hepatocellular y carcinogénesis. En relación con la dosis utilizada, el tiempo de exposición, la presencia de agentes potenciadores, o la edad del organismo afectado pueden producirse la regeneración y llevar a la completa recuperación del hígado dañado97,98.
En ratas se ha utilizado para el estudio del trasplante intraesplénico de hepatocitos99, para comprobar diversos tratamientos farmacológicos100, así como para el estudio de los mecanismos por los que la regeneración compensatoria del hígado evita la progresión del daño tóxico42.
Como críticas cabe destacar que aunque el daño producido por el tetracloruro de carbono se produce principalmente en el hígado, afecta principalmente a la zona central del acino hepático y no se produce una necrosis masiva como en los casos de FHF en el hombre; no se metaboliza completamente en el hígado de forma que parte de la toxina no metabolizada afecta y daña otros órganos, especialmente los pulmones y los riñones50 y, por último existe una gran variación en la sensibilidad interespecífica y etaria debida fundamentalmente al diferente grado de desarrollo y eficacia del sistema de destoxificación hepático del citocromo P-450.
Otros modelos químicos
También se ha inducido FHF mediante el uso de venenos tales como el derivado de la Amanita phalloides, que aunque sea una intoxicación poco frecuente sus efectos son bien conocidos en humanos. De hecho, el efecto de las amatoxinas se debe a la inducción de la ARN polimerasa provocando toxicidad celular en hepatocitos, células de la mucosa intestinal y células tubulares renales y se ha utilizado para desarrollar un modelo animal de fallo hepático en cerdos en combinación con lipopolisacárido101. También se han desarrollado modelos en los que combinan la amanitina con lipopolisacáridos en cerdos con el fin de estudiar la supervivencia con trasplante ortotópico de hígado y tacrolimus102.
La tioacetamida causa necrosis hepatocelular después de su biotransformación mediante la vía de las monooxigenasas103 y ha sido utilizada para explorar la neurobiología de la encefalopatía hepática en el FHF34, el papel de las especies reactivas del oxígeno104 así como la acción protectora de sustancias antioxidantes como la curcumina105, sustancias pro-regenerativas106, el empeoramiento de la encefalopatía con el tratamiento crónico de sustancias como la indometazina107o la contribución relativa de las isoenzimas de laóxido nítrico sintetasa (NOS) en la encefalopatía asociada al FHF en ratas108.
]]> La administración de azoximetano en ratones induce parámetros similares a los encontrados en el FHF del hombre109; de hecho, recientemente, se ha demostrado que es un modelo animal sencillo y reproducible muy útil para el estudio de los efectos de la manipulación génica sobre las complicaciones cerebrales que acompañan al FHF110.Otros modelos emplean la administración parenteral de Propinebacterium acnes y lipopolisacárido para estudiar las diferentes expresiones de moléculas estimuladoras111; la combinación de D-galactosamina y lipopolisacárido en ratas para comprobar la disminución de la mortalidad de los animales a los que se administraba el factor de crecimiento endotelial vascular112 y la administración intraportal de alfa-amanitina y lipopolisacárido en cerdos para estudiar soportes de hígado bioartificial113.
Modelos víricos
A pesar de que la hepatitis vírica es la causa más importante de FHF, el uso de agentes infecciosos para desarrollar modelos animales de FHF ha sido en general muy desafortunado47 y solamente ratones transgénicos que sobreexpresan las proteínas del virus de la hepatitis C (HBV) o ratones BALB/cj infectados con el MHV-3114,115 han ofrecido alguna luz sobre los mecanismos del FHF inducido por virus. Sin embargo, estos modelos murinos tienen limitaciones significativas en lo que hace referencia a la ausencia de medida de la presión intracraneal, la principal causa de muerte en el FHF humano, o en los datos sobre las toxinas implicadas en la encefalopatía hepática y el edema cerebral además del pequeño tamaño de los modelos que hacen imposible la prueba de nuevos sistemas de soporte hepático48,49.
Más recientemente, nuestro grupo de investigación ha descrito un nuevo modelo animal de FHF producido por la infección experimental de conejos con el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV)116. El RHDV es un miembro de la familia de los Caliciviridae que causa en los conejos una enfermedad altamente mortal, descrita por vez primera en China en 1984117.
La enfermedad hemorrágica del conejo (RHD, del inglés rabbit haemorrhagic disease) es una hepatitis vírica que presenta con algunas hepatitis víricas humanas de tipo fulminante (B, C, y E) un parentesco sorprendente clínico, anatomopatológico y de su modo de transmisión116,118. El virus no se replica en ningún otro vertebrado119 y no se ha señalado hasta la fecha su transmisión al hombre, aún entre las poblaciones más expuestas al virus.
Se ha demostrado que el antígeno viral puede encontrarse en los hepatocitos ya a las 12 horas posinfección (p.i.) y que a las 36 y 48 p.i. se localiza en el 60-80% de los hepatocitos; así mismo es posible detectarlo en localizaciones extrahepáticas, tales como los linfocitos y los macrófagos del bazo aunque no en el cerebro120.
La RDH se caracteriza por su alta morbilidad y una mortalidad cercana al 90%116,121. Los conejos mueren en un rango de tiempo definido, entre las 36 y las 54 horas p.i. con signos clínicos característicos de un FHF progresivo y coma. Además, el intervalo existente desde la infección hasta el momento en que mueren la mayor parte de los animales aporta una amplia ventana terapéutica que hace que nuestro modelo cumpla otro de los requisitos imprescindibles que es la existencia de un período de tiempo suficiente entre agresión y muerte para poder investigar adecuadamente diversas pautas de tratamiento o tecnologías de soporte hepático50. Por otra parte, al tratarse de una especie de tamaño medio es posible tomar con facilidad muestras seriadas de sangre, lo que permite una monitorización relativamente sencilla de la presión intracraneal y de las alteraciones bioquímicas producidas en el curso de la infección y hace factible un seguimiento adecuado durante los experimentos116.
En este modelo se reproducen los parámetros bioquímicos e histológicos y los signos clínicos más representativos del FHF del hombre116. Así, detectamos aumentos significativos en las actividades plasmáticas de las transaminasas, lactato deshidrogenasa y la concentracción de bilirrubina. Además, se produce un aumento en la concentración plasmática de los aminoácidos aromáticos con una disminución significativa del índice de Fischer e hipoglucemia, al igual que en el FHF humano. Los trastornos de la coagulación observados en este modelo son la disminución de los factores V y VII y la prolongación del tiempo de protrombina. El alargamiento del tiempo de protrombina es un elemento pronóstico en el FHF. Estas alteraciones podrían ser una consecuencia de la síntesis disminuida de los factores de la coagulación por el hígado dañado y el desarrollo de coagulación intravascular diseminada (CID). En las últimas etapas de la enfermedad los animales presentan signos neurológicos de encefalopatía hepática, coma y muerte cerebral. La encefalopatía hepática se encuentra invariablemente asociada con el FHF en el hombre, y se considera un criterio esencial para que un modelo animal de FHF sea relevante desde el punto de vista clínico. Este hecho constituye una limitación muy importante en algunos modelos, tales como los basados en la hepatectomía parcial, en los cuales las complicaciones neurológicas, la encefalopatía o la hipertensión intracraneal están raramente presentes. El aumento de la presión intracraneal en los animales infectados por el RHDV se acompañó de incrementos de las concentraciones plasmáticas de amonio. El examen histológico e inmunohistoquímico reveló por un lado, áreas de necrosis en el hígado asociadas con hemorragias e infiltración de neutrófilos y, por otro, amplias zonas de apoptosis con una elevada expresión de caspasa 3 especialmente en las zonas periportales del acino hepático122.
Asimismo, se observaron incrementos significativos en la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y del TNF-alfa, al igual que se ha descrito en pacientes con FHF123. El TNF-alfa es un agente que puede conducir tanto a la proliferación celular como la apoptosis; su sobreexpresión se correlaciona tanto con el índice de apoptosis en el FHF como con la regeneración hepática124.
]]> El equilibrio entre la proliferación y la apoptosis puede dirigirse de acuerdo con la presencia de un exceso de especies reactivas del oxígeno (EROs) que si no son neutralizadas por acción del glutatión o diversas actividades enzimáticas antioxidantes, causan daño mitocondrial y liberación de citocromo c hacia el citosol disparando la activación de las caspasas y la muerte celular125. Esta situación se produce en nuestro modelo animal, pues hemos descrito tanto una reducción del glutatión y las principales actividades enzimáticas antioxidantes, como la presencia de estrés oxidativo126 así como una importante implicación de los mecanismos de apoptosis122. Por tanto, el conjunto de análisis y observaciones recogidas en los animales infectados por el RHDV refuerza su posible utilización para el estudio de la patogenia y el tratamiento del FHF.
Conclusiones
Existen pocas entidades en medicina que sean más graves y desalentadoras que el FHF. Tanto el conocimiento como el tratamiento de este síndrome han estado limitados por la falta de modelos animales satisfactorios. Las desventajas potenciales de los modelos quirúrgicos son que adolecen de reversibilidad potencial o recuperación, son poco reproducibles, dependen de la pericia quirúrgica, muchos de los parámetros clínicos y bioquímicos típicos del FHF del hombre no se presentan siempre y no reproducen un ambiente complicado por la liberación de mediadores de la respuesta inflamatoria y productos de la necrosis celular hepática. Por ello, su utilidad se limita a la evaluación de diversos sistemas de soporte hepático. Los modelos que utilizan hepatotoxinas no tienen tales restricciones pero también presentan diversos inconvenientes como son la necesidad de ajustar la dosis y las variables susceptibilidades tanto interespecíficas como etarias, sin olvidar el peligro potencial que en la mayoría de los casos presentan tales agentes químicos. En cuanto alúnico modelo vírico que hasta el momento ha demostrado su viabilidad, inducido en conejos mediante el RHDV, es altamente reproducible, presenta carácterísticas similares al FHF del hombre y presenta como limitación que la única especie susceptible es el conejo lo que lejos de ser un inconveniente se convierte en ventaja al no ser, por tanto, peligroso para las personas involucradas en los estudios.
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Dirección para correspondencia:
María Jesús Tuñón
Departamento de Ciencias Biomédicas
Universidad de León
24071 León
E-mail: mjtung@unileon.es