Cambios en la composición de la grasa y en la histomorfología del hígado tras resecciones intestinales parciales

Changes in the fat composition and histomorphology of the liver after partial intestinal resections

M^a I. Correa Antúnez¹, J. M. Morán Penco⁴, J. L. Amaya Lozano¹, A. Leal Macho¹, E. Maciá Botejara², J. Saenz Santamaría³

¹Servicio de Cirugía General. ²Servicio de Medicina Interna del Hospital Perpetuo Socorro.
³Servicio de Anatomía Patológica. "Complejo Hospitalario Universitario" de Badajoz.
⁴Departamento de Terapéutica Médico-Quirúrgica. Cirugía Pediátrica. Facultad de Medicina. Universidad de Extremadura. Badajoz. España.

Dirección para correspondencia

RESUMEN

Introducción y objetivos: Teóricamente, las resecciones intestinales parciales podrían afectar al hígado a través de la absorción de nutrientes y de la circulación enterohepática de los ácidos biliares, por las posibles alteraciones sobre el complejo hormonal duodeno-bilo-hepato-pancreático y por los efectos secundarios de la translocación bacteriana intestinal. Estos mecanismos fisiopatológicos pueden sumarse modificando la composición y la histomorfología hepática, específicamente la composición de la grasa hepática. El objetivo de este trabajo experimental es conocer mas profunda y concretamente las alteraciones secundarias a las resecciones intestinales parciales.
M & M: Utilizamos 26 cobayos divididos en 3 grupos: Grupo A (n=10), con resección yeyunal; Grupo B (n=10) con resección ileal y Grupo control (GCtr, n=6). Los animales fueron nutridos oralmente durante 21 días. Al final se obtuvieron muestras para analizar la bioquímica sérica y se homogeneizó el tejido hepático para estudio de la grasa hepática (grasa total, proporciones de lípidos neutros y polares y proporciones de fosfolípidos y de ácidos grasos). Se tomaron muestras para estudio histomorfológico. ]]> Resultados: Los animales con resección yeyunal e ileal presentaron disminución del colesterol sérico, del peso de la gota grasa/g tejido y del cociente w6/w3 y del C18-2/C18-3, sin alteraciones en la distribución de fosfolípidos. Se halló macroesteatosis y disminución de la densidad mitocondrial en los animales del G-B.
Conclusiones: las resecciones intestinales parciales, especialmente las ileales sí parecen influir a corto plazo en la composición de la grasa estructural del hígado. Estos cambios en los lípidos estructurales y en la histomorfología pudieran ser compensados a medio plazo. Estos hallazgos pueden ayudarnos a entender mejor la relación hepato-intestinal.

Palabras clave: Resección intestinal; hepatoesteatosis. Relación hepato-intestinal.

ABSTRACT

Background & Aims: The partial resection of the intestine could affect the liver through alteration in nutrient absorption, loss of the bile acids via the enterohepatic circulation, alterations in the hepato-duodenobilio-pancreatic hormonal complex as well as a bacterial translocation. All these factors could sum up and induce changes in the tissue composition and in hepatic histomorphology. The aim of this experimental study is to acquire a profound knowledge of these hepatic alterations after the partial intestinal resection.
M & M: 26 Dunkin Hartley guinea pigs were used: Group A with only jejunum resection, Group B with only ileum resection, and Group CtrG, the control group. They were monitored for 21 days. At the end, blood samples were taken for serum biochemical analysis. Samples of hepatic tissue were taken for histomorphological optical study. All the rest liver was homogenize and the fat liver composition was analysed (total fat, lipid fractions, phospholipids fractions and fatty acids of the liver).
Results: There was a significant decrease in serum cholesterol in both GA & GB. There was also a decrease of the total fat/g liver tissue, without changes in the phospholipids fraction and decreases in the C18-2/C18-3 and w6/w3 ratios. There was a minimal macrosteatosis and reduction of the number of mitochondries in GB.
Conclusions: the partial intestinal resection, specially ileum resections, looks like influence the structural fat liver composition. However, these changes could be compensated for by the liver and oral nutrition. These findings help us to improve the liver-intestinal relationships.

Key words: Intestinal resections. Liver steatosis. Liverintestinal relationships.

RIP: Resección Intestinal Parcial.
RI: Resección Intestinal
SIUC: Síndrome de Intestino Ultracorto
NA: Nutrición Artificial
NP: Nutrición Parenteral
AB: Ácidos Biliares
CCF: Cromatografía en Capa Fina
CG: Cromatografía de Gases
AG: Ácidos Grasos ]]> LP: Lípidos Polares
LN: Lípidos Neutros
FC: Fosfatidilcolina
FS: Fosfatidilserina
FI: Fosfatidilinositol
FE: Fosafatidiletanolamina

Introducción y objetivos

Las resecciones intestinales son los procedimientos más frecuentes en cirugía digestiva siendo las resecciones parciales de intestino delgado (RIP; yeyunales, ileales o mixtas) las que pueden tener más repercusiones nutricionales. Sigue prestándose mucha atención a los casos de Síndrome de Intestino Ultracorto (SIUC) existiendo mucha bibliografía al respecto (150 artículos en PubMed en el 2008), y se sigue estudiando la hepatopatía asociada a la Nutrición Artificial (NA) en estos enfermos con SIUC¹, pero poco se sabe sobre los posibles mecanismos de producción del daño hepático debido a las resecciones intestinales amplias o parciales. Creemos que sería interesante conocer mejor los mecanismos íntimos de estos daños, especialmente en los pacientes con hepatopatía previa y/o en aquellos pacientes que tuvieran que ser sometidos a NP por períodos cortos o a medio plazo.

Sabemos que el hígado no es un órgano aislado sino que está íntimamente relacionado con el intestino, a través de la circulación enterohepática de nutrientes y de Acidos Biliares (AB), del complejo hormonal enterohepático con las hormonas dudodeno-pancreatico-biliares (CCK, secretina, gastrina, VIP, GIP...) y del cociente portal de Insulina/Glucagón - I/G-². En los pacientes con RIP o con SIUC, a estos mecanismos de relación hepatointestinal alterados se podrían sumar los fenómenos derivados de la translocación bacteriana, tan frecuentes en estas circunstancias^3-5.

Material y métodos

El modelo experimental utilizado fue con cobayos Dunkin Hartley, con 563±22g de peso y criados en nuestro animalario de la Universidad de Extremadura. Fueron mantenidos en jaulas individuales homologadas para estudios metabólicos, de acuerdo a la legislación europea, con ciclos de luz/oscuridad de 12h, 14 renovaciones de aire/h y a 21^oC de temperatura ambiental. Cada animal fue asignado a cada uno de los tres grupos experimentales de forma ramdomizada^6,7:

- Grupo A (n = 10): sometidos a resección yeyunal (que supone las dos primeras quintas partes del intestino delgado).

- Grupo B (n = 10): con resección ileal, conservando la válvula ileo-cecal (supone la resección de las dos terceras partes distales del intestino delgado).

- Grupo control -GCtr- (n = 6): sometidos a una anestesia y laparotomía simulada, sin resección intestinal.

Tras 6 horas de ayuno, los animales fueron anestesiados con inyección intraperitoneal de Ketamina (100 mg/kg), Diazepan (20 mg/kg) y Atropina (0,2 mg/kg). También se infiltró la herida con anestesia local. La distinción entre yeyuno e íleon se hizo mediante el método de las arcadas vasculares (simples para el los vasos yeyunales) y múltiples para el íleon. Todos los animales fueron mantenidos las primeras 24 h con infusión subcutánea de solución glucosalina y acceso libre al agua, seguidas de una mezcla de solución oral con glucosa, aminoácidos y emulsión grasa durante 48h y, finalmente, de una alimentación oral con pienso específico intensivo para cobayo ("Panlab GP intensive"), con la siguiente composición: 88% de materia seca; 4% de grasa, 9% de fibra -celulosa-, 50% de nitrógeno libre, 7% de ceniza, 3,4 kcal/kg, 4.000 mg/kg de Vit. C, minerales, otras vitaminas y oligoelementos, de acuerdo con las especificaciones internacionales para cobayo⁷. Los animales se mantuvieron vigilados durante 21 días, recogiendo los datos de ingesta y el peso de las heces.

Al final del estudio los animales fueron nuevamente anestesiados y re-laparotomizados, extrayéndose 10ml de sangre de la vena cava, prefundiéndose el hígado con solución de Ringer hasta la exanguinación. Luego, se extrajo el hígado en su totalidad y se pesó. Dos porciones del lóbulo derecho fueron fijadas en formaldehído 4%. El resto del hígado fue homogeneizado y mantenido y mantenido a -70^oC, hasta su procesamiento final.

El estudio de la composición lipídica del tejido hepático homogeneizado y tras su descongelación, se hizo con los siguientes métodos: Para la valoración del peso de la gota grasa/g de tejido, usamos el método de Folch (Cloroformo/metanol 2/1), secado bajo flujo de N y pesaje con balanza de precisión⁹. Para la determinación de los lípidos polares (LP) y neutros (LN) y su relación, usamos la cromatografía en capa fina (CCF). El desarrollo se hizo con una fase móvil de éter dietílico y agua. Así, los lípidos polares quedan en el punto de partida o base de la placa y los neutros arriba¹⁰. El estudio de las fracciones lipídicas de los LP (fosfolípidos), también se hizo mediante CCF, con una fase móvil de Cloroformo/Metanol/H2O/Ac. Acético glacial en proporciones de 60/30/6/1. Identificamos la Fosfatidilcolina (FC), Fosfatidilserina (FS), Fosfatidilinositol (FI) y Fosafatidiletanolamina (FE). La cuantificación de los resultados obtenidos mediante la CCF (fracciones e LP y LN así como la FC, FS, FI y FE) se hizo con ayuda de un Apple Mcintosh, tras escanear las placas con un escáner Hewllet Packard, utilizando un programa Adobe Photoshop (Adobe System Inc, USA) y midiendo las manchas con el programa NIH-Image 1.61 del Nacional Institute of Health.

El análisis de los Ácidos Grasos (AG) del hígado se hizo mediante CG, bajo las siguientes condiciones: uso de un estándar interno de C17. Tras la metilación de la muestra de hígado mediante el método de Lepage¹¹, los ésteres metílicos fueron inyectados en un equipo Hewlett Packard 3396 con autoinyector y equipado con columnas capilares de Dietilenglicol (3% de chromosorb-SP y 2% SP2300). El programa de gradiente del detector de ionización estuvo entre 150 hasta 220^oC. Se determinaron los ésteres metílicos de los AG entre el C16 hasta C22-6w3 y todos los intermedios, comparando sus áreas con la del C17.

Se realizó un estudio estadístico inferencial utilizando la técnica del análisis de datos apareados, mediante un test de Mann-Whitney, comparando los datos finales respecto a los iniciales del peso en los grupos experimentales A y B. Para el resto de los parámetros, se compararon el grupo Control (GCtr) frente a los grupos A y B y estos entre sí, con ayuda de un test no-paramétrico de una sola vía -ANOVA-, mediante un programa estadístico Instat -1.2¹². Se aceptó como diferencia significativa, una "p" menor de 0,01.

Finalmente, hicimos el estudio histomorfológico del hígado con microscopía óptica (OM) utilizando la tinción de Hematoxilina-eosina, Tricrómico de Masson y tinción específica para mitocondrias.

Resultados

Previos al inicio de la experimentación final, utilizamos hasta 11 animales para conseguir un modelo animal idóneo (de anestesia y de técnica quirúrgica-laparotomía y RIP-). Aún así, obtuvimos una mortalidad experimental final de 1/7 animales para el GCtr, y de 2/22 para el total de los otros dos grupos, A y B (con un total del 9%). Las muertes se debieron a la anestesia en 1 caso y a la dehiscencia de sutura en los otros dos animales. De un total de 29 animales se estudiaron finalmente 26.

Los animales de los dos grupos experimentales, A y B, perdieron peso en los 8-10 primeros días (8% y 11% respectivamente), recuperando la media de la curva de peso hacia los 16 días de postoperatorio, a pesar de la pérdida del peso correspondiente al intestino resecado. Tras 21 días, las medias de incremento del peso en cada grupo de animales (r = peso final menos peso inicial) fueron: GA:+12 ± 5,9 g; GB: +11 ± 5,2g; y GCtr: +9 ± 1,3 g (tabla I).

Excepto en los tres primeros días, no hubo diferencias significativas en la ingesta oral de alimentos entre los animales de los distintos grupos, siendo de 27 ± 6 g/animal para el GA, de 31 ± 5 g para el GB, y de 25 ± 7 g para el GCtr (tabla I). A partir de la primera semana, no hubo diferencias en el aspecto ni en el número de defecaciones entre los grupos, siendo el número habitual de 12-15 heces por día y animal. No se observaron diarreas, esteatorreas u otros tipos de anomalías en la excreta.

En el estudio de la composición de la grasa hepática destacamos los siguientes resultados:

- Hubo una reducción en el peso de la gota grasa/g de tejido en los grupos experimentales A y B, respecto del GCtr, siendo aún mayor y estadísticamente significativa en los animales del GA (p < 0.01) (fig. 1).

- Aunque hay esta reducción en el total de grasa/g de tejido, no hubo cambios significativos en la relación o cociente LP/LN en ninguno de los grupos experimentales. Lo que parece indicar que este descenso cuantitativo no se acompaña de un cambio cualitativo.

- Respecto de los resultados obtenidos en el estudio de los LP, tampoco parece haber modificaciones pues, aunque hay un leve incremento en la tasa de FE en los dos grupos experimentales, esta reducción se ve compensada por un leve incremento en el FI (fig. 2).

- Finalmente, en el estudio de los AG hepáticos, encontramos una reducción significativa del cociente C18-2/C18-3, así como en la relación ω6/ω3 en los GA y GB (tabla II), siempre respecto del GCtr, sin que se acompañe de otras alteraciones significativas en los AG

En los hallazgos histomorfológicos, solo es posible observar una moderada macroesteatosis (de gota grande intracitoplásmica), fundamentalmente alrededor de la vena central, en los dos grupos con RIP, algo mayor en los del GB (fig. 3) y también una moderada reducción del número de mitocondrias pero solo en los animales del GB, con resección ileal (fig. 4).

Discusión

Respecto del animal de experimentación, elegimos el cobayo por tener una anatomía e histomorfología con diversas similitudes con ser humano, incluso en el metabolismo hepático, como el de los AB^13,14. Se trata de un animal muy parecido al cerdo, pero más barato y manejable, siendo igualmente reproducibles los experimentos. El modelo elegido fue esencialmente el de datos apareados, pero al existir varios factores intervinientes, como la anestesia, la laparotomía y los cuidados postoperatorios, nos obligaba a incluir un grupo experimental comparativo, por lo que el modelo es mixto, pero mas fiable y completo.

A priori, nos resultaba muy difícil determinar el tiempo de experimentación postoperatorio pues ni con la bibliografía existente y a pesar de nuestra experiencia teníamos asegurado el acierto en este aspecto. En estos estudios, los hallazgos dependen del tiempo experimental elegido y nos pareció que, una vez recuperado el peso corporal, el estado general y la fase catabólica postoperatoria del animal, que lo habíamos observado alrededor de tres semanas en los estudios previos, este período podía ser un buen momento para finalizar el experimento, sin arriesgarnos a que los mecanismos de compensación del hígado y del animal nos privaran de encontrar cambios de interés.

Desde luego, la absorción de nutrientes depende en parte del tramo intestinal resecado, influyendo más la resección yeyunal sobre la absorción del conjunto de los nutrientes pero de forma más específica la resección ileal sobre la absorción de las grasas poliinsaturadas, debido a las alteraciones que podrían darse en la circulación entero-hepática de los AB. Sin embargo, hay otros detalles importantes y que no parecen tenerse a veces en cuenta, como es la influencia de la resección del mesenterio que, a través de sus linfáticos influye en la absorción de los quilomicrones¹⁵, o como son las consecuencias que las translocación bacteriana puede producir en el hígado y en su composición estructural o en su histomorfología, sobre todo por los cambios secundarios a la elevación del TNF. Por eso, tratamos de ser lo más precisos posibles en las resecciones intestinales, y hacerlo por tramos fijos, pero sabiendo que los resultados pueden depender no solo del tramo intestinal resecado sino también de otros detalles asociados a las resecciones intestinales, pero no de otros factores externos.

En cuanto a los resultados analíticos séricos, queremos destacar que en los animales con RIP solo se produce una reducción del colesterol sérico, pero no de otros parámetros como las proteínas totales, la albúmina etc. que, tras tres semanas, podrían indicar una cierta desnutrición o alteraciones metabólicas. Pensamos que nuestros animales están bien cuidados y nutridos y que los cambios hallados en el hígado no deberían atribuirse a este tipo de origen nutricional o metabólico. Por otra parte, el descenso de colesterol total es bastante significativa y mayor en el GB, con resección ileal, por lo que probablemente sea debida a la resección intestinal y mas probablemente o con mayor intensidad cuando la RIP es del íleon. Seguramente por el déficit en la absorción de los AB, debiendo el hígado utilizar más colesterol para la síntesis hepática de los mismos. En teoría, en el caso de una significativa destrucción celular hepatocitaria, también se produciría una déficit de colesterol sérico pero, teniendo en cuenta los hallazgos histomorfológicos y funcionales en nuestros animales, debemos descartar esto como causa de una hipocolesterolemia sérica.

Respecto de los hallazgos en la composición grasa del hígado, pensamos que estos son mucho más cuantitativos que cualitativos, pues aunque se reduce moderadamente la cantidad de grasa por g de tejido, las proporciones entre los lípidos polares/neutros y las proporciones de los principales fosfolípidos analizados se mantienen constantes y similares a los del GCtr. Es decir, no parece que haya unos cambios de la composición grasa que puedan deberse a graves trastornos absortivos no compensados o ser secundaria a un daño hepatocitario grave, de tipo tóxico o por daño grave en la membrana celular. Sin embargo, disminuyen los cocientes 18-2/18-3 y ω6/ω3 en los dos grupos con RIP. Teóricamente, y con respecto a la relación entre una RIP y el hígado, esto pudiera deberse a una reducción en la absorción de nutrientes -máxime de proteínas y carbohidratos- en los animales del GA, con resección yeyunal, causando una mayor movilización y/o consumo de grasa hepática con fines energéticos y reduciendo su cantidad total, tal y como ocurre en los animales de este GA, aunque esto sigue siendo muy discutible^16,17. Ello también podría ser debido a una deficiente absorción intestinal de los TG de cadena larga, pero como esto sucede tanto en los animales del GA, con resección yeyunal, como en los del GB, con resección ileal, no nos atrevemos a pensar que se deba a trastornos específicos de la absorción de grasas. Quizá deberíamos interpretarlo más como consecuencia de otros déficit en la absorción general de nutrientes y en el consumo corporal de los mismos, teniendo en cuenta la situación metabólica a la que han sido sometidos los animales, de cicatrización y de compensación de déficit titulares. Sin embrago, es cierto que estos cambios en las proporciones de los AG podrían influir en la síntesis y saturación concreta de los diferentes fosfolípidos y, concretamente, en los fosfolípidos de membrana, influyendo a su vez en la permeabilidad de la membrana celular y también en el estado de hidro o liposolubilidad intracelular. Un aspecto concreto que debemos relacionar sería el posible existente entre estos cambios en la composición grasa y los hallazgos histomorfológicos. De hecho, encontramos una leve esteatosis perivenular y un descenso moderado de la densidad mitocondrial en los animales del GB, con resección ileal (ver figs. 3 y 4), lo que nos permite suponer que pudieran tener relación ambos resultados, aunque sin poder establecer por ahora una relación de causa - efecto. Por ejemplo, una alteración significativa en la composición lipídica de la membrana celular o de las organelas intracitoplásmicas, sobre todo la mitocondrial, podría originar cambios significativos de la permeabilidad y un daño celular o de la organela^18,19. En el caso de la mitocondria, recordemos que el metabolismo de los AG poliinsaturados se realiza en su interior, existiendo una relación directa entre la organela y su función y, por tanto, pudiendo se ver afectada, tal y como pudiera haber acontecido en esta experimentación. De hecho, la disminución significativa de la densidad mitocondrial hepatocitaria se ha demostrado en otras situaciones experimentales, como es en el déficit de Taurina en el hígado de conejo, también posiblemente por alteración de la permeabilidad de membrana^20,21.

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Dirección para correspondencia:
José M. Morán Penco
Cátedra de Cirugía. Facultad de Medicina
Avda. Elvas, s/n.
06071 Badajoz, España
E-mail: jmmoran@unex.es

Recibido: 20-IV-2010.
1^a Revisión: 30-V-2010.
Aceptado: 30-VI-2010.