ORIGINAL / Investigación animal

Papel inmunomodulador de las dietas lipídicas en un modelo murino inmunosuprimido e infectado con Listeria monocytogenes

Immunomodulatory role of dietary lipids in an immunosuppressed mouse model and infected with Listeria monocytogenes

José María Cerón Rodríguez¹, M.^a Ángeles Puertollano Vacas¹, M.^a Elena Puertollano Vacas² y Gerardo Álvarez de Cienfuegos López¹

¹ Área de microbiología. Departamento de ciencias de la Salud. Facultad de Ciencias Experimentales. Universidad de Jaén. España.
² Department of Food and Nutritional Sciences. University of Reading. Inglaterra.

Dirección para correspondencia

RESUMEN

Introducción: La capacidad inmunomoduladora de los ácidos grasos de la dieta en situaciones de inmunosupresión puede diferir de acuerdo con el tipo de ácido graso presente.
Objetivo: Analizar el efecto de diferentes tipos de dietas lipídicas, en la resistencia de animales inmunosuprimidos o no, frente a una infección experimental con Listeria monocytogenes.
Métodos: Ratones Balb/c fueron divididos en cuatro grupos experimentales, según su tratamiento inmunosupresor: control (PBS), Ciclofosfamida (CPA), GK 1.5 y RB6-8C5. Cada grupo fue subdividido en cuatro subgrupos según la dieta lipídica utilizada: control con aceite de maíz 5% (BG); aceite de oliva 20% (AO); aceite de pescado 20% (AP) y aceite de girasol 20% (AG). Los animales se alimentaron durante un mes antes del tratamiento y posteriormente infectados con L. monocytogenes.
Resultados: Mostramos incrementos en el número de bacterias viables en bazo e hígado, y bajos porcentajes de supervivencia en todos los grupos de ratones inmunosuprimidos y también en el grupo PBS alimentado con AP. Además, se observaron incrementos en la linfoproliferación, de bazos de ratones alimentados con AO y tratados con CPA.
Discusión: La dieta AP, produce una disminución en la resistencia del hospedador en situaciones de inmunosupresión. Por el contrario, las dietas AO y AG muestran mayor eficacia en la eliminación de L. monocytogenes y mayores ventajas en animales inmunosuprimidos. El tratamiento con RB6-8C5, produce una reducción en la supervivencia de los ratones de los grupos estudiados, lo que induce a establecer que los granulocitos juegan un papel fundamental en el control de la infección.

ABSTRACT

Introduction: Dietary fatty acids immunomodulatory capacity in immunosuppression conditions may differ according to the type of fatty acid present in the diet.
Objective: To analyze the effect of different types of dietary lipids on the immune resistance of immunosuppressed and immunocompetent animals, against experimental infection with a virulent strain of Listeria monocytogenes.
Methods: Balb/c mice were divided into four experimental groups, according to their immunosuppressive treatment: control (PBS), cyclophosphamide (CPA), GK 1.5 and RB6-8C5. Each group was subdivided into four groups according to the lipid diet used which: control, with corn oil 5% (BG); olive oil 20% (AO); fish oil 20% (AP) and sunflower oil 20% (AG). The animals were fed for a month before treatment and subsequently infected with L. monocytogenes.
Results: We show increases in the number of viable bacteria in spleen and liver, and low survival rates in all groups of immunosuppressed mice and also in the PBS group and fed with AP. Furthermore, increases in the lymphocyte proliferation were observed, in the spleen of mice fed with AO and treated with CPA.
Discussion: The AP diet produces a significant decrease the host resistance in situations of immunosuppression. On the contrary, the AO and AG diets show major efficiency in the elimination of L. monocytogenes and major immunological advantages in immunosuppressed mice. Treatment with RB6-8C5, produces a reduction in the survival of the mice in all groups studied, which leads us to establish that granulocytes play a key role in the control of infection.

Key words: Immunity active. Fatty acids. Bacterial infection.

Abreviaturas
CPA: (ciclofosfamida) ]]> PBS: (phosphate buffer saline, tampón fosfato salino)
BG: (baja en grasas)
AO: (aceite de oliva)
AP: (aceite de pescado)
AG: (aceite de girasol)
TSA: (triptona-soja agar)
UFC: (unidades formadoras de colonias)
ConA: (concanavalina A)
DO: (densidad óptica)

La inmunonutrición, tanto en humanos como en animales, es actualmente uno de los campos de mayor relevancia e interés. La influencia de la ingesta de grasas sobre las funciones inmunes es un hecho constatado por multitud de estudios y aplicado hoy día en la nutrición hospitalaria^1,2. Un aspecto importante a considerar es que, según el tipo y cantidad de ácido graso de la dieta, la modulación ejercida sobre las funciones inmunes puede ser diferente³, dependiendo del estado inmune del individuo y de multitud de factores biológicos, lo que provoca que la modulación pueda presentar ciertos beneficios en unos casos o desventajas en otros. Por este motivo actualmente, la composición de las fórmulas empleadas en nutrición enteral y parenteral se ajusta según las necesidades fisiológicas del paciente y la patología a tratar. Existen diversos trabajos que explican el mecanismo de acción mediante los cuales, los ácidos grasos de distinta naturaleza son capaces de influir en las funciones inmunes^4-6. Los mecanismos a través de los cuales, el componente lipídico de la dieta ejerce la modulación del sistema inmune son: apoptosis, expresión génica, estrés oxidativo, fluidez de membrana, modulación de la microbiota intestinal, presentación de antígenos, producción de eicosanoides y transducción de señales⁷.

Uno de los inconvenientes asociados a los ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3, presentes en el aceite de pescado (AP), es una disminución de la resistencia inmune del hospedador frente a infecciones con microorganismos patógenos⁴. Además, en los últimos años existen numerosas investigaciones que muestran que dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3, producen un empeoramiento en el desarrollo de la respuesta inmune de ratones experimentalmente infectados bacterias patógenas como Samonella enteritidis⁸ o Mycobacterium tuberculosis⁹.

El aceite de girasol presenta una alta concentración ácido linoleico, ácido graso poliinsaturado de la serie n-6 y presente en el aceite de girasol, es uno de los ácidos grasos esenciales y por tanto, no puede ser sintetizado por nuestro organismo. Aunque las emulsiones lipídicas más ampliamente utilizados en la alimentación parenteral, se basan en aceite de soja que contiene una concentración muy alta de ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-6, sin embargo, una administración excesiva de este tipo de ácidos grasos puede producir efectos perjudiciales, ya que puede conducir a un patrón de ácidos grasos en las membranas celulares desequilibrado, y a una alteración en la síntesis de eicosanoides¹⁰.

Los ácidos grasos monoinsaturados de la serie n-9 presentes mayoritariamente en el aceite de oliva, también son capaces de modular el sistema inmune. Presentan una menor capacidad inmunosupresora que los de la serie n-3 y además no incrementan la susceptibilidad del individuo a enfermedades infecciosas^11,12.

Los procesos de inmunosupresión pueden ser consecuencia de una patología, o estar inducidos como consecuencia de un tratamiento de determinadas patologías (inmunosupresión iatrogénica). Uno de los fármacos inmunosupresores ensayados, la ciclofosfamida, (CPA), es un agente neutropénico que produce leucopenia y reducciones en los niveles de monocitos¹³. Otros agentes inmunosupresores ensayados fueron el GK 1,5 (anti-L3T4, que produce la depleción de linfocitos T CD4+) y el RB6-8C5 (anti-Gr1, que elimina a los granulocitos).

En este estudio analizamos como los ácidos grasos presentes en las dietas lipídicas son capaces de modular las funciones inmunes tanto en ratones inmunosuprimidos como inmunocompetentes y sometidos a una infección experimental con la bacteria patógena intracelular Listeria monocytogenes.

Material y métodos

Animales y dietas experimentales

Tratamiento inmunosupresor

Transcurrido el periodo de 30 días de alimentación con las respectivas dietas lipídicas, al grupo control se le inyectó 100 de PBS por vía intraperitoneal a las 72, 48 y 24 h horas previas a la infección con L. monocytogenes. Otro grupo fue tratado con una dosis de CPA de 100 mg/kg de peso en 100 µL de PBS estéril; en un total de tres dosis a las 72, 48 y 24 h horas previas a la infección con L. monocytogenes. Los agentes inmunosupresores GK 1.5 y RB6-8C5 se inyectaron por vía intraperitoneal 24 h antes de la infección experimental, ambos a una concentración de 2,5 mg/Kg (0,05 mg/ratón) en 100 µL de PBS estéril.

Infección experimental con Listeria monocytogenes

Una cepa virulenta de L. monocytogenes fue sembrada en medio agar triptona-soja (TSA) con un 7% de sangre, se incubó a 37 ^oC durante 24 h. Para los ensayos de supervivencia se inyectó por vía endovenosa a través del plexo retro-orbital ocular en cada ratón, una dosis infectiva de 10⁴ unidades formadoras de colonias (UFC) en 100 µL de PBS estéril. Para la recuperación de bacterias viables y la proliferación de linfocitos, la dosis infectiva por ratón fue de 10³ UFC de L. monocytogenes.

Cuantificación de bacterias viables procedentes de bazo e hígado de ratones experimentalmente infectados con L. monocytogenes.

A las 24 y 48 horas de la infección, los bazos e hígados procedentes de los ratones infectados fueron extraídos, se homogenizaron asépticamente por separado y sus células fueron recogidas por centrifugación. Se realizaron seis diluciones seriadas en solución salina estéril al 0,9 % (p/v) y se transfirieron 10 µL a placas de agar TSA-sangre. Después de la incubación de las placas durante 24 h a 37^o C, el número de colonias se contó en cada muestra triplicada. La técnica llevada a cabo fue la misma para ambos órganos. Los resultados se expresan como log₁₀ de las bacterias viables recontadas.

Determinación de la proliferación de linfocitos en bazo y timo

Las proliferaciones linfocitarias de células esplénicas y tímicas se cuantificaron mediante la técnica colorimétrica con 3-(4,5-dimethyithiazol-2 yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)¹⁴. Este compuesto es metabolizado por las mitocondrias de células vivas que lo transforman en cristales de formazán, de un color magenta característico. Esplenocitos y timocitos se dispusieron por triplicado en placas de 96 pocillos a una concentración de 10⁵ células/pocillo y se incubaron en presencia de concanavalina A (Con A) a una concentración de 5 μg/mL, durante 24 h a 37^o C y en atmósfera de 5% de CO₂. Posteriormente se incubó la placa en iguales condiciones con MTT durante 3 h y por último se añadió 150 µL de HCl 0,04 N en isopropanol para la disolución de los cristales de formazán. La densidad óptica (DO) se cuantificó en un lector de microplacas a 550 nm y 620 nm, como longitudes de onda de medida y referencia respectivamente. Los resultados se expresan como incremento de porcentaje del índice de estimulación respecto al control (dieta baja en grasas).

Índice de estimulación= (DO estimulados / DO sin estimular) x 100

En el ensayo de supervivencia cada grupo de tratamiento estaba compuesto de 40 ratones, los grupos se dividieron en 4 subgrupos de 10 ratones alimentados con las diferentes dietas. La muerte después de la infección experimental con una dosis virulenta de L. monocytogenes (10⁴ UFC/ratón), se registró cada 8 h y los resultados se expresaron como porcentaje de supervivencia.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como la media ± el error estándar asociado a la media; la comparación entre los efectos de las dietas y el control se realizó mediante análisis de la varianza (ANOVA) y el test de significación estadística de Student-Newman-Keuls al 95% de intervalo de confianza. Las diferencias significativas se presentaron con *P < 0,05.

Resultados

Recuentos de bacterias viables a partir de bazo e hígado

Los recuentos de bacterias viables en bazo e hígado de ratones alimentados con la dieta AP mostraron en la mayoría de los grupos, incrementos estadísticamente significativos con respecto a los grupos alimentados con otros tipos de dietas (P< 0,05) con independencia del tipo de tratamiento inmunosupresor. El menor número de bacterias viables lo muestran los ratones alimentados con la dieta control, mientras que los grupos alimentados con las dietas de AO y AG reflejan recuentos similares entre ellos, pero siempre inferiores a los ratones alimentados con la dieta AP. Con respecto a los grupos tratados con los agentes inmunosupresores RB6-8C5 y GK 1.5, aquellos ratones alimentados con la dieta de AO, muestran recuentos similares a los encontrados en el grupo control, mientras que los ratones alimentados con la dieta AG tienden a incrementarse a las 48 h. Los datos ausentes de los ratones alimentados con la dieta AP y tratados con RB6-8C5, se debe a la incapacidad de los mismos de superar la infección experimental con L. monocytogenes (Tabla I y Fig. 1).

Proliferación de linfocitos procedentes de bazo y timo estimulados con Con A

La figura 2 muestra la proliferación en linfocitos de bazo y timo estimulados con el mitógeno Con A. En bazo, los ratones alimentados con AP reflejan incrementos estadísticamente significativos respecto a las demás dietas ensayadas en los tratamientos control y GK 1.5; en cambio en el tratamiento con CPA los ratones alimentados con AO se incrementan significativamente sobre los demás grupos de dieta tanto a las 24 h como a las 48 h. El tratamiento con RB6-8C5 produce en los esplenocitos de ratones alimentados con AG una significativa reducción en comparación a grupo de ratones alimentados con AO, en los que se puede observar un ligero incremento con respecto al resto de grupos.

Supervivencia

El porcentaje de supervivencia de ratones sometidos a inmunosupresión o no, alimentados con dietas lipídicas e infectados experimentalmente con L. monocytogenes puede observarse en la figura 3. Los ratones alimentados con la dieta de AP muestran reducciones importantes en el porcentaje de supervivencia en todos los casos a partir de las 48 h desde el comienzo de la infección experimental, y a los 4 días solo sobreviven un 10% de los animales en todos los tratamientos. En el tratamiento control (PBS) se debe destacar los altos índices de supervivencia del 90%, en los ratones alimentados con AO durante una infección con L. monocytogenes. En ratones sometidos al tratamiento inmunosupresor con CPA, además del escaso porcentaje de supervivencia del grupo de ratones alimentados con la dieta AP, también se produce un efecto similar, aunque no tan acusado en los ratones alimentados con la dieta AO, mientras que la supervivencia del grupo alimentado con la dieta AG, muestra porcentajes incluso superiores que los alimentados con la dieta control (BG). El tratamiento con el agente GK 1.5 no afecta al grupo de ratones alimentados con la dieta AO, que a los 10 días, presentan una tasa de supervivencia del 90%, por el contrario en el grupo de ratones alimentados con la dieta AG, el porcentaje de supervivencia disminuye dramáticamente a partir del día 6. Finalmente en grupo tratado con RB6-8C5 a los 4 días mueren el 100% de los ratones alimentados con AP, mientras que los alimentados con las dietas control, AO y AG presentan porcentajes de supervivencia entre el 10-20%. En todos los casos de inmunosupresión los ratones alimentados con las dietas de AO, AG y control viven más tiempo que los alimentados con AP.

Discusión

Estudios recientes, han analizado desde el punto de vista experimental y epidemiológico la inmunomodulación ejercida por los diferentes tipos de ácidos grasos contenidos en las dietas lipídicas^15,16. Los resultados de estos trabajos muestran una mayor capacidad inmunosupresora en los ácidos grasos poli-insaturados de la serie n-3 presentes mayoritariamente en el AP. Este efecto inmunomodulador que se traduce en una disminución de los síntomas inflamatorios ha sido propuesto para su incorporación en la dieta de pacientes afectados por diversos tipos de enfermedades autoinmunes como puede ser la artritis reumatoide¹⁷ o el lupus eritematoso sistémico¹⁸. Sin embargo, este efecto inmunosupresor incrementa la susceptibilidad del hospedador a las infecciones microbianas debido a una disminución en la resistencia inmune frente a ellas, tal como se ha descrito con diversas bacterias patógenas como Borrelia burgdorferi¹⁹, Pseudomonas aeruginosa²⁰, Salmonella enteritidis⁸, Mycobacterium tuberculosis²¹ y Listeria monocytogenes^22,11. Sin embargo, existen otras investigaciones que demuestran incrementos en la resistencia inmune de animales alimentados con ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3 frente a infecciones bacterianas^23,24. Estas discrepancias que pueden encontrase en la bibliografía podrían deberse a variaciones en el tipo de patógeno utilizado y a la metodología usada para inducir la infección experimental.

Los ácidos grasos monoinsaturados de la serie n-9 mayoritarios en la composición del AO, no ejercen una inmunosupresión tan profunda en el organismo como en el caso del AP, por lo que tiene claras ventajas, por tanto, en situaciones de infección. Anteriores investigaciones de nuestro grupo de investigación, mostraron que durante una infección experimental con L. monocytogenes²⁸, ratones alimentados con AO poseen una menor carga bacteriana en bazo que la que presentan ratones alimentados con una dieta de AP, datos que posteriormente fueron corroborados por otros autores en modelos similares a los utilizados por nosostros²⁹.

Por otro lado, las investigaciones en las que se estudia la influencia de la ingesta de ácidos grasos poliinsaturados en ratones infectados y en los que previamente se deplecciona determinadas poblaciones de células inmunes no son muy abundantes, aunque se han ensayado distintos tipos de patógenos (bacterias, virus, parásitos...) y además existe una gran variabilidad en los resultados consultados^25-27.

Aunque los esplenocitos de ratones alimentados con AP mostraron incrementos significativos en la respuesta proliferativa con los tratamientos GK 1.5 y control (PBS); en los tratamientos con CPA y RB6-8C5, los porcentajes respecto a controles se redujeron en comparación a ratones alimentados con AO (Fig. 2). Esta disminución de la linfoproliferación de esplenocitos podría explicarse porque al desaparecer, por la acción de los agentes CPA y RB6-8C5, las poblaciones celulares responsables de la síntesis de citoquinas activadoras de la linfoproliferación, esta no llega a producirse. En la respuesta linfoporliferativa de timocitos, debemos destacar una reducción significativa en los ratones alimentados con AP y tratados con GK 1.5 a las 24 h de la infección (Fig. 2). Todas estas evidencias ratifican el hecho que una dieta rica grasas en las que los ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3 son el componente mayoritario, provocan una importante disminución de los mecanismos de defensa frente a infecciones bacterianas, tanto en situaciones de inmunocompetencia como en estados de inmunosupresión, siendo los granulocitos, las células más directamente implicadas en la defensa frente a este tipo de infecciones.

La acción inmunomoduladora del ácido oleico componente mayoritario del aceite de oliva, es la responsable de los efectos asociados a las administración de dietas que contienen como componente lipídico mayoritario, este tipo de grasa^5,30. La capacidad de eliminar en hígado y bazo la bacteria experimentalmente inoculada en ratones alimentados con las dietas AO y AG, nos muestra que estos tipos de dieta no provocan de forma tan acusada una disminución de los mecanismos de defensa frente a este tipo de agresiones (Tabla I y Fig. 1), lo que se traduce en tiempos de supervivencia que en ocasiones llegan incluso a superar a los que presenta los ratones alimentados con la dieta control (BG) (Fig. 3), tanto en casos de inmunocompetencia como en los casos de tratamiento con los agentes inmunosupresores CPA y GK 1.5, aunque con el tratamiento con el agente RB6-8C5, que provoca la eliminación de los granulocitos, células responsables de la defensa antibacteriana, las supervivencia, al igual que en todos los casos, también disminuye dramáticamente. La respuesta linfoproliferativa de esplenocitos de ratones alimentados con AO y estimulados con el mitógeno ConA, fue similar a la que presentan estas células procedentes del grupo de ratones control, pero se observaron incrementos en los tratamientos con CPA y RB6-8C5 (Fig. 2).

Los esplenocitos de ratones alimentados con AG reflejaron reducciones significativas en el porcentaje respecto a controles en los tratamientos con CPA y RB6-8C5, a las 48 h de la infección con L. monocytogenes. En la respuesta linfoporliferativa de timocitos se debe destacar una reducción significativa a las 48 h en ratones alimentados con AG y tratados con CPA; los timocitos de ratones alimentados con la dieta de AO mostraron niveles similares a controles y demás dietas en la mayoría de tratamientos. Las variaciones en cuanto a la estimulación linfocitaria del presente estudio con anteriores, podría deberse a diferencias en la posición de grupos triacilglicerol en el AP empleado³¹.

Los ensayos realizados en el presente estudio ratifican las propiedades que atribuyen al consumo de dietas ricas en AO en anteriores investigaciones¹². Aunque a los ácidos grasos monoinsaturados de la serie n-9 también se le atribuye un carácter inmunosupresor este es significativamente menor que el observado en el AP²², sobre todo frente a enfermedades de naturaleza infecciosa⁴. Por tanto podemos concluir, de acuerdo con los resultados que hemos mostrado, que la dieta AO, no sólo no contribuye a la disminución de los mecanismos de defensa frente a la infecciones bacterianas típica de las dietas ricas en grasas, sino que en algunos casos puede llegar a ser incluso más beneficiosa que una dieta baja en grasas.

Los ácidos grasos son muy empleados actualmente a nivel mundial en la nutrición hospitalaria como componentes de emulsiones lipídicas empleadas en nutrición enteral y parenteral^32,33; en este aspecto el aceite de oliva contenido en algunas emulsiones lipídicas ha mostrado ventajas frente a las emulsiones tradicionales basadas en el aceite de soja, como puede observarse en un estudio llevado a cabo en neonatos³⁴. No obstante, las discrepancias existentes en la bibliografía plantean la necesidad de llevar a cabo más estudios para determinar con una mayor precisión los diferentes mecanismos moleculares de la inmunomodulación ejercida por los diferentes tipos de ácidos grasos, tanto a nivel experimental como a nivel clínico, como podría ser la determinación de citoquinas de la respuesta Th1, inflamatoria, y la proporción de las distintas subpoblaciones linfocitarias que podían alterarse como consecuencias de las dietas ricas en los distintos tipos de grasas utilizadas.

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Dirección para correspondencia:
Dr Gerardo Álvarez de Cienfuegos López. ]]> Departamento de Ciencias de la Salud. Área de Microbiología.
Facultad de Ciencias Experimentales.
Universidad de Jaén.
Campus "Las Lagunillas" 23071, Jaén (España).
Email: gcienfue@ujaen.es

Recibido: 9-VI-2014.
Aceptado: 23-VII-2014.