Determination of cholesterol in human milk: an alternative to chromatographic methods

Determinación del colesterol en leche humana: una alternativa a los métodos cromatográficos

Andrea Álvarez-Sala, Guadalupe Garcia-Llatas, Reyes Barberá and María Jesús Lagarda

Nutrition and Food Science Area, Faculty of Pharmacy, University of Valencia (Valencia), Spain.

Introduction: human milk (HM) is considered the best option for feeding healthy infants. Cholesterol (CHOL) is important for proper development of the nervous system, and for hormone and vitamin synthesis in growing infants. Breastfeeding and dietary CHOL intake during infancy have been suggested to affect blood lipid levels and the risk of cardiovascular disease in adulthood. Gas chromatography is the technique most widely used to determine CHOL in HM. Chromatographic methods are specific for the determination of CHOL and other sterols present in HM, but are extremely time consuming, and the costs and equipment requirements mean that they are not accessible to all laboratories.
Aim: the present study describes the optimization and validation of an enzymatic-spectrophotometric method for CHOL determination in mature HM.
Method: determination of CHOL involves fat extraction with chloroform:methanol, hot saponification and extraction of the unsaponifiable fraction with diethyl ether. CHOL was determined by an enzymatic method in which the concentration of the lutidine dye formed is stoichiometric to the amount of CHOL, and is measured by the increase in light absorbance at 405 nm.
Results: human milk fat (mg/mL) (27.5 ± 1.3) and CHOL (0.113 ± 0.004) in analyzed HM were within the ranges reported by others authors. Analytical parameters of the proposed method were assessed: The precision values (%) (expressed as the relative standard deviation (RSD)) were: 3.5 and 6.7 for intra- and inter-day, respectively. Accuracy, estimated by recovery assays, was 110 ± 1.6%.
Conclusion: the validated enzymatic-spectrophotometric method for determining CHOL in HM constitutes an alternative for fast and simple analysis of CHOL with equipment requirements accessible to any laboratory.

Key words: Human milk. Cholesterol determination. Enzymatic-spectrophotometric method. Validation.

RESUMEN

Introducción: la leche humana (HM) se considera el modo óptimo de alimentación en lactantes sanos. El colesterol (CHOL) es importante para el correcto desarrollo del sistema nervioso y la síntesis de hormonas y vitaminas en el crecimiento del lactante. Se ha constatado que la lactancia materna y la ingesta dietética de CHOL durante la infancia influye en los niveles de lípidos en sangre, así como en el riesgo de enfermedad cardiovascular en la edad adulta. La técnica más utilizada para determinar el CHOL en HM es la cromatografía de gases. Los métodos cromatográficos son específicos para la determinación del CHOL y otros esteroles presentes en la HM, pero el elevado tiempo consumido, los costes y la necesidad de una instrumentación específica hacen que no sea accesible para cualquier laboratorio.
Objetivo: el presente estudio describe la optimización y validación de un método enzimático-espectrofotométrico para la determinación del CHOL en HM madura. ]]> Métodos: la determinación del CHOL requiere una extracción lipídica con cloroformo:metanol, saponificación en caliente y extracción del insaponificable con dietil éter. El CHOL fue determinado por un método enzimático en el que la concentración de lutidina formada es estequiométrica a la cantidad de CHOL, y se mide a 405 nm.
Resultados: la cantidad de grasa (mg/mL) (27,5 ± 1,3) y de CHOL (0,113 ± 0,004) en la HM analizada se halla en el intervalo indicado por otros autores. Se evalúan parámetros analíticos del método propuesto: la precisión (expresada como desviación estándar relativa en %) fue de 3,5 y 6,7 para intra- e interdía, respectivamente. La exactitud, estimada mediante ensayos de recuperación, fue de 110 ± 1,6%.
Conclusión: el método enzimático-espectrofotométrico validado para determinar el CHOL en HM constituye una alternativa para el análisis rápido y sencillo de CHOL empleando equipos accesibles para cualquier laboratorio.

Palabras clave: Leche humana. Determinación de colesterol. Método enzimático-espectrofotométrico. Validación.

http://scielo.isciii.es/pdf/nh/v32n4/16originalpediatria01.pdf