Fig. 1. Colocación del TMA. La MA se despliega con el epitelio hacia arriba
y el mesénquima en contacto con la superficie ocular. Posteriormente se recorta ]]> el exceso de MA y se sutura a conjuntiva con nylon de 10/0.
TRASPLANTE DE MEMBRANA AMNIÓTICA EN EL TRATAMIENTO DE MODERATE LIMBAL DEFICIENCY IN PATIENTS WITH CONGENITAL ANIRIDIA TREATED LÓPEZ-GARCÍA JS1, RIVAS L2, GARCÍA-LOZANO I3 RESUMEN Palabras claves: Aniridia, biopsia, deficiencia limbal, trasplante de membrana amniótica. ABSTRACT Purpose: To study the ocular surface evolution by impression cytology and limbal biopsy in patients with congenital aniridia treated with amniotic membrane transplantation (AMT). Key words: Aniridia, biopsy, limbal deficiency, amniotic membrane transplantation. Recibido: 10/2/05. Aceptado: 20/9/05. Correspondencia: INTRODUCCIÓN La aniridia es una anomalía congénita en el desarrollo del ojo que presenta una escasa incidencia en la población (1:65.000-95.000). Generalmente se trasmite mediante una herencia autonómica dominante, aunque puede también presentarse de forma esporádica. Está provocada por una alteración en el gen PAX 6 localizado en el brazo corto del cromosoma 11 (1,2). Se caracteriza por una pérdida parcial o completa del iris y otras anomalías como nistagmus, cataratas, glaucoma, queratopatía, hipoplasia foveal, hipoplasia macular, etc. (3). En algunos casos, sobre todo en los que se presentan de forma esporádica, asocia anomalías extraoculares como el tumor de Wilms ya sea sólo o formando parte del llamado síndrome WAGR (Tumor de Wilms, aniridia, anomalías genito-urinarias y retraso mental) (4).
LA INSUFICIENCIA LIMBAL MODERADA DE PACIENTES CON ANIRIDIA CONGÉNITA
WITH AMNIOTIC MEMBRANE TRANSPLANTATION
Métodos: Se estudiaron 14 ojos de pacientes con aniridia congénita con insuficiencia limbal moderada a los que se les realizó un TMA. Mediante citología corneal y biopsia limbal hemos estudiado la morfología del epitelio limbocorneal y de su estroma. La citología se realizó antes del transplante y a los 3, 6, 9, 12 y 24 meses después del trasplante. La biopsia limbal se realizó antes del trasplante y 9 meses después de éste.
Resultados: La agudeza visual mejoró una media de 0,3 durante el estudio. La neovascularización corneal periférica mejoró antes de los dos meses así como la transparencia corneal. La epitelización de la córnea se completó antes de los dos meses en casi todos los pacientes, sin embargo, a partir del 8.º-9.º mes, algunos pacientes comenzaron a presentar defectos epiteliales y úlceras recurrentes. La citología de impresión mostró una importante mejoría en el grado de metaplasia escamosa en la citología de los 3 y 6 meses, mostrando a partir de la citología de los nueve meses un empeoramiento progresivo hasta los 24 meses en donde encontramos unas características celulares muy próximas a los valores previos a la cirugía. En la biopsia realizada a los nueve meses, el epitelio y estroma limbocorneal mostraron unas características muy próximas a la normalidad.
Conclusiones: El TMA es un método efectivo, aunque transitorio, para restaurar la integridad de la superficie ocular en pacientes con aniridia que presentan una insuficiencia limbal moderada.
Methods: We studied 14 eyes of patients with congenital aniridia and moderate limbal deficiency that were treated with AMT. The morphology of the limbocorneal epithelium and stroma was examined by impression cytology and limbal biopsy. Impression cytology was performed prior to surgery and 3, 6, 9, 12 and 24 months after treatment. Limbal biopsy was performed before surgery and 9 months after AMT.
Results: Visual acuity showed a mean improvement of 0.3 at 24 months of follow-up. Corneal re-epithelialization was completed by 2 months in all patients, however, after 9 months some patients showed persistent epithelial defects and chronic ulceration. Corneal clarity and peripheral neovascularization was markedly improved after 2 months. Impression cytology showed an improvement in squamous metaplasia at 3 and 6 months, however after nine months, until as late as 24 months, a progressive worsening was seen in epithelial cell metaplasia then being similar in extent to that before surgery. Limbal biopsy nine months after surgery showed a nearly normal epithelium and limbocorneal stroma. ]]>
Conclusions: AMT is a very effective procedure, although its effect is transitory, for restoring the ocular surface integrity in patients with congenital aniridia and moderate limbal deficiency (Arch Soc Esp Oftalmol 2005; 80: 517-524).
Hospital Cruz Roja y Hospital Ramón y Cajal. Madrid. España.
1 Doctor en Medicina.
2 Doctor en Biología.
3 Licenciado en Medicina.
J.S. López García ]]>
Servicio de Oftalmología
Hospital Central de Cruz Roja
Avda. Reina Victoria, 26
28003 Madrid
España
E-mail: docsantilopez@hotmail.com
El tratamiento de la queratopatía asociada a la aniridia dependerá del grado de insuficiencia limbal. La insuficiencia límbica puede ser total o parcial dependiendo del número de células madre afectadas. Clínicamente se caracteriza por una vascularización del epitelio corneal, inflamación crónica, defectos epiteliales persistentes y recurrentes, fotofobia, opacidad estromal y pérdida de visión. En la actualidad el trasplante de limbo sigue siendo la técnica quirúrgica más extendida para el tratamiento de pacientes con deficiencia limbal total (7), si bien las nuevas técnicas de trasplante de células madre limbales cultivadas sobre membrana amniótica (MA) se están desarrollando con gran rapidez (8-10). En algunos casos el trasplante de limbo se asocia a queratoplastia lamelar o penetrante (11,12).
El trasplante de membrana amniótica (TMA) es también utilizado para el tratamiento de la insuficiencia limbal, sobre todo en casos de defectos limbares parciales (13,14). La MA se empleó por primera vez en oftalmología en 1940 para la reparación de defectos conjuntivales (15), aunque es a partir de la década de los 90 cuando el TMA se desarrolla considerablemente (16,17). En el presente trabajo se pretende estudiar, mediante citología de impresión y biopsia limbal, el patrón morfológico de recuperación tanto de las células del epitelio corneal como del estroma en ojos de pacientes con aniridia después del tratamiento con TMA.
SUJETOS, MATERIAL Y MÉTODOS
En la selección de pacientes, técnicas aplicadas y manejo de las muestras se cumplieron las normas internacionales y nacionales para estudios clínicos. A todos los pacientes que, de forma voluntaria, quisieron intervenir en este estudio se les solicitó por escrito la aceptación de su participación.
Se ha realizado un estudio prospectivo sobre 14 ojos con aniridia congénita y clínica de insuficiencia limbal parcial que fueron tratados con TMA. El seguimiento post-quirúrgico fue de 24 meses. La edad media en el momento de la operación fue de 37 años (comprendidos entre los 21 y 57 años). Todos los pacientes presentaron clínica de insuficiencia limbal moderada caracterizada por fotofobia, disminución de visión, inflamación crónica de la superficie ocular, lagrimeo, 3 o más episodios de erosiones recidivantes o úlceras recurrentes en los últimos 6 meses y en la exploración con lámpara de hendidura se observaba una inestabilidad permanente de la película lagrimal y un pannus vascular periférico.
El TMA se realizó previa descongelación y lavado en tampón PBS de las piezas de MA. Éstas fueron separadas del papel de nitrocelulosa y colocadas sobre la superficie ocular con el epitelio hacia arriba y el mesénquima en contacto con el ojo cubriendo córnea, limbo y conjuntiva proximal. Se tensó la MA, eliminando el exceso de ésta, y se suturó con nylon 10/0 (fig. 1). La cirugía se realizó bajo anestesia retrobulbar o peribulbar. Una vez finalizada la intervención quirúrgica se colocó una lente terapéutica, manteniéndola durante tres o cuatro semanas. El tratamiento post-quirúrgico consistió en un tratamiento tópico con ofloxacino 0,3% y con dexametasona 0,1% cuatro veces diarias.
Fig. 1. Colocación del TMA. La MA se despliega con el epitelio hacia arriba
y el mesénquima en contacto con la superficie ocular. Posteriormente se recorta ]]>
el exceso de MA y se sutura a conjuntiva con nylon de 10/0.
El seguimiento clínico se hizo al día siguiente del transplante, a la semana, al mes, a los 3, a los 6, a los 12, a los 18, y a los 24. La evaluación de la superficie corneal después de la cirugía se efectuó mediante citología de impresión del epitelio corneal y mediante biopsia limbal. La citología se realizó previa a la intervención y a los 3, 6, 9, 12 y 24 meses después de la intervención. La biopsia se realizó en el momento de colocar el TMA y a los 9 meses de éste. Las muestras se procesaron tanto para estudio mediante microscopía óptica como electrónica.
Para la citología de impresión, las muestras obtenidas de los cuatro cuadrantes fueron recogidas sobre tiras de papel millipore HAWP304 de 5x5 mm de tamaño, fijadas en etanol al 96% y teñidas con PAS-hematoxilina de acuerdo con el protocolo de Locquin y Langeron modificado por Rivas et al. (18), observándose posteriormente al microscopio óptico. El criterio utilizado para el diagnóstico en la citología corneal se basó en la forma y tamaño de las células, la separación entre ellas, su tamaño nuclear, la tinción del citoplasma, las alteraciones nucleares, la relación núcleo-citoplasma y la presencia de conjuntivalización corneal. Para valorar el grado de afectación, las células corneales fueron graduadas en una escala que iba de 0 a 5 grados, según la clasificación de la metaplasia escamosa propuesta por Murube y Rivas (2003) (19). Estos autores distinguen cinco grados de alteración celular y un grado 0 que recoge las características normales de las células.
La biopsia se realizó previa anestesia tópica de la superficie ocular con anestésico doble (Colircusí anestésico doble®, Alcon Cusí, S.A. Barcelona) instilada en el fondo de saco conjuntival. El tamaño de la muestra limbal fue aproximadamente de 2 mm2, y el procesamiento de ésta siguió el protocolo habitual del laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Ramón y Cajal, excepto en la fijación, en la que para poder estabilizar la capa de mucina de la película lagrimal ésta se realizó en glutaraldehido al 1,5% con bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB) en tampón fosfato; posteriormente se realizó una segunda fijación en glutaraldehido al 1% con ácido tánico al 1% en el mismo tampón y, por último, una tercera fijación en tetraóxido de osmio al 1% en tampón Palade. Las muestras se deshidrataron en concentraciones crecientes de acetona (30, 50, 70, 90 y 100%) y óxido de propileno. El medio de contraste consistió en una solución de acetato de uranilo al 2% añadido a la acetona al 70%, proporcionando un mayor contraste a las membranas del tejido. La inclusión se realizó en Araldita (Durcupan-Ciba). El seccionamiento de las muestras se realizó en un ultramicrotomo modelo Reichert-Jung, Ultracut E. Los cortes histológicos para el estudio en microscopio óptico se obtuvieron de un grosor aproximado de 2 micras y se tiñeron con azul de Richardson. Para el estudio mediante microscopio electrónico, los cortes se obtuvieron de un grosor de 70 nanómetros y se tiñeron con citrato de plomo.
RESULTADOS
La citología corneal realizada previa al tratamiento mostró únicamente en algún caso signos de conjuntivalización, caracterizada por la presencia de un escaso número de células caliciformes de pequeño tamaño y vacías de contenido mucínico. Las células epiteliales presentaron una metaplasia escamosa grado 3 ó 4. Su tamaño celular fue superior a las 900 µm2 y el tamaño nuclear de unas 90 µm2. Las alteraciones nucleares más comunes fueron la aparición de núcleos picnóticos y binucleados. La relación núcleo-citoplasma estuvo bastante alterada siendo muy común una tinción metacromática, y en menos casos basófila, del citoplasma. La presencia de células inflamatorias fue escasa (fig. 2). La biopsia limbal mostró células de gran tamaño en todas las capas con gran citoplasma, estando bastante separadas entre ellas. Las microvellosidades fueron muy pequeñas y la capa de mucina estuvo algo adelgazada y en algunas localizaciones discontinua. La membrana basal presentó un aspecto algo adelgazado con respecto a personas normales. El estroma fue moderadamente denso con presencia de algunas células inflamatorias. Los vasos sanguíneos presentaron generalmente un calibre algo reducido (fig. 3).
Fig. 2. Citología de impresión en la córnea de un paciente con aniridia antes del TMA.
Las células epiteliales con muy grandes, con citoplasmas metacromático y numerosas alteraciones nucleares.
Se observa una célula caliciforme muy alterada. Tinción PAS-hematoxilina. Aumento original x40.
Fig. 3. Biopsia realizada previa a la cirugía de TMA. Se aprecia una delgada capa de mucina,
así como algunas células caliciformes en el epitelio limbocorneal.
El tejido conectivo del estroma es moderadamente denso.
Tinción azul de Richardson. Aumento original x40.
Desde el punto de vista clínico, la epitelización de la córnea se completó antes de los dos meses en casi todos los pacientes; sin embargo, a partir del 8.º-9.º mes, algunos pacientes comenzaron a presentar defectos epiteliales y úlceras recurrentes. La neovascularización corneal periférica mejoró antes de los dos meses, así como la transparencia corneal lo que contribuyó a la mejora de 0,3 en la agudeza visual.
En la citología de impresión realizada a los tres meses del TMA no se encontraron en ningún caso signos de conjuntivalización del epitelio corneal. Se apreció una notable mejoría de las células epiteliales en cuanto al grado de metaplasia. No observamos células epiteliales de la MA en ningún caso. Las células corneales presentaron un tamaño significativamente menor (alrededor de unas 600 µm2) con pequeños espacios intercelulares. La tinción del citoplasma fue casi siempre eosinofila, mejorando también significativamente la relación núcleo-citoplasma. El tamaño nuclear fue similar al normal (alrededor de 95 µm2), siendo poco frecuente la presencia de alteraciones nucleares.
En la citología realizada a los 6 meses tampoco encontramos en ningún caso presencia de células caliciformes en el epitelio corneal. Las células epiteliales presentaron un tamaño de unas 400 µm2 estando relativamente unidas entre sí. La tinción del citoplasma fue eosinófila y la relación núcleo-citoplasma menor de 1:6. Apenas se encontraron alteraciones nucleares y el tamaño nuclear fue similar al normal (fig. 4).
]]>
Fig. 4. Citología de impresión en la córnea de un paciente con aniridia
seis meses después del TMA. Las células epiteliales presentan un aspecto
casi normal, con citoplasmas eosinófilos y núcleos pequeños.
Tinción PAS-hematoxilina. Aumento original x40.
En la citología realizada a los 9 meses se encontró presencia de células caliciformes en dos ojos. Éstas fueron de tamaño pequeño y con pobre contenido mucínico. Las células epiteliales presentaron un tamaño superior al encontrado en la citología de los 6 meses (unas 600 µm2), aumentando ligeramente el espacio intercelular. La tinción del citoplasma siguió siendo eosinófila, aunque aumentó la relación núcleo-citoplasma a 1:8. Se encontraron algunas alteraciones nucleares como células binucleadas, si bien el tamaño nuclear no varió significativamente con respecto a personas normales. El estudio mediante biopsia mostró que tanto el epitelio como el estroma estuvieron próximos a la normalidad, si bien las células epiteliales presentaron una tamaño superior al encontrado en personas controles. Las microvellosidades y el glicocáliz también mejoraron con respecto a la situación inicial. La capa de mucina mejoró significativamente y la membrana basal presentó un mayor grosor y continuidad. El estroma presentó una notable organización en cuanto a la disposición de las fibras de colágeno, no siendo significativa la presencia de células inflamatorias. Los vasos sanguíneos y los linfáticos fueron prácticamente normales (fig. 5).
Fig. 5. Microscopía electrónica. Detalle del limbo nueve meses después del TMA.
Las células epiteliales más externas presentan pocas y cortas microvellosidades.
La capa de mucina es fina y discontinua. Tinción citrato de plomo. Aumento original x7.500.
]]> En la citología realizada a los 12 y 24 meses, la córnea mostró presencia de células caliciformes en 4 y 5 casos respectivamente. Se encontraron que las características celulares estudiadas fueron sensiblemente peores que las encontradas en la citología realizada a los 9 meses, regresando a valores similares a los presentados previamente al tratamiento mediante TMA en la citología de los 24 meses. Así por ejemplo, el tamaño celular en pacientes con aniridia en la citología de los 12 meses fue de unas 800 µm2 presentando ciertas alteraciones en la tinción del citoplasma y alteraciones nucleares como células binucleadas y núcleos picnóticos.
DISCUSIÓN
En pacientes con aniridia congénita la disfunción limbal provoca una vascularización y conjuntivalización de la córnea que, en los casos más graves, disminuye considerablemente la visión siendo precisa la realización de una queratoplastia penetrante incluso en la segunda década de la vida. En nuestra experiencia, y coincidiendo con otros autores, la mayoría de los pacientes con aniridia presentan una insuficiencia limbal moderada con signos de metaplasia escamosa grado 4 ó 5 de la clasificación de Murube y Rivas (2003), presentando, sólo en algunos casos, graves signos de conjuntivalización del epitelio corneal (6).
En la actualidad el trasplante de limbo sigue siendo la técnica quirúrgica más extendida para el tratamiento de pacientes con deficiencia limbal total (7), si bien las nuevas técnicas de trasplante de células madre epiteliales cultivadas sobre MA se están desarrollando con gran rapidez (9). Sin embargo, en personas con una deficiencia parcial de células limbales, el TMA puede ser una solución a los trastornos de la superficie ocular presentes en estos pacientes tales como la inestabilidad de la película lagrimal y los defectos epiteliales persistentes (20).
En nuestro estudio, el TMA mejoró en más de dos grados la metaplasia escamosa previa a los 6 meses de la cirugía, sin embargo esta mejoría fue transitoria ya que a partir de los 9 meses el grado de metaplasia fue empeorando progresivamente hasta llegar a niveles similares a los encontrados previos al TMA en la citología de los 24 meses. En cuanto al grado de recuperación estromal, encontramos como el TMA favorece la organización y disposición de las fibras de colágeno en el estroma en la biopsia realizada 9 meses después de la cirugía. Este efecto sobre el estroma es más duradero que el producido sobre el epitelio corneal, ya que en pacientes tratados con TMA a los que posteriormente se realizó un trasplante de limbo encontramos una mayor organización del tejido conectivo que en otros pacientes a los que previamente no se les realizó TMA.
La utilidad terapéutica del TMA deriva de sus propiedades mecánicas y, sobre todo, biológicas (21,22). Actúa como sustrato favoreciendo la migración y adhesión de las células epiteliales, facilitando la proliferación y diferenciación de las células progenitoras del epitelio corneal (23,24). Posee además un efecto anticicatrizante y antiinflamatorio, disminuyendo el grado de neovascularización (25,26). Sin embargo, todos estos efectos biológicos son transitorios y progresivamente su acción va desapareciendo con el tiempo, conforme se disuelve la MA.
En trabajos nuestros no publicados, el TMA ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de la deficiencia limbar parcial secundaria a quemaduras oculares, tanto en lo que se refiere a la regeneración epitelial como estromal. En el caso de estos pacientes, en los que se produce un daño agudo y no progresivo de las células del epitelio limbal, las propiedades tanto mecánicas como biológicas del TMA ayudan a estabilizar la situación en fases agudas y a promover la regeneración tisular. Si el daño no ha sido excesivo, las células madre supervivientes serán capaces de mantener la estabilidad de la superficie corneal cuando cesen los efectos del TMA. Sin embargo, en pacientes con aniridia congénita, el defecto de células madre es intrínseco a la enfermedad y progresivo, con lo que el TMA sólo aportará beneficios temporales. Ramaesh et al. (2005) en un trabajo reciente publican que el potencial proliferativo de las células madre del limbo puede no estar primariamente afectado en pacientes con aniridia (27). Estos autores piensan que la queratopatía corneal en pacientes con aniridia se debe a un mecanismo patogénico multifactorial que afecta al área limbal e incluye una respuesta cicatricial anormal de la córnea, secundaria a anomalías metabólicas en la matriz extracelular, una deficiente diferenciación epitelial, secundaria a fragilidad de las células del epitelio corneal, y una reducción de la adhesión de las células epiteliales. Basándonos en estas consideraciones y en las propiedades del TMA, podemos considerar que el empleo precoz de TMA en pacientes con aniridia podría retrasar la aparición de disfunción limbal grave. Será necesario complementar con otros estudios posteriores para poder demostrar esta hipótesis.
Como conclusión, podemos decir que aunque el mejor tratamiento para pacientes con deficiencia limbal asociada a aniridia parece ser el trasplante de limbo o el trasplante de células madre limbales cultivado sobre MA, pensamos que el TMA puede ser de gran utilidad en pacientes con deficiencia limbal moderada; incluso, la realización periódica de TMA permite estabilizar la superficie ocular durante largos períodos de tiempo en pacientes en los que no se pueda realizar un trasplante de limbo, por no encontrar un donante HLA compatible o por no poder utilizar la medicación inmunosupresora. En estos pacientes el TMA aunque no aporta células madre mejora considerablemente el microambiente limbal.
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