Concentraciones de colesterol, a -tocoferol y retinoides en aceite de silicona tras su utilización como sustitutivo vítreo
1 Doctor en Medicina. Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada (IOBA), grupo de Retina.
Universidad de Valladolid. Servicio de Oftalmología. Hospital Clínico Universitario de Valladolid.
2 Doctor en Química. Departamento de Química Analítica. Universidad de Valladolid.
3 Licenciada en Química. Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada (IOBA), grupo de Retina.
Universidad de Valladolid. Departamento de Química Analítica. Universidad de Valladolid.
4 Licenciada en Estadística. Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada (IOBA), grupo de Retina.
Universidad de Valladolid.
RESUMEN
Objetivo: Determinar si existen concentraciones de compuestos lipofílicos de origen orgánico en muestras de aceite de silicona extraídas de ojos humanos y comprobar si existe alguna relación con el tiempo de permanencia intraocular del aceite.
Métodos: Por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se han determinado las concentraciones de ácido retinoico, retinol, retinal, colesterol y a -tocoferol en 23 muestras de aceite de silicona de 1.000 cs, extraídas de pacientes con desprendimientos complejos de retina con tiempos de permanencia intraocular variables (3 a 50 meses).
Resultados: Se han encontrado concentraciones de todos los compuestos, sobre todo de colesterol, y en menor medida de a -tocoferol. Se ha observado una correlación inversa de la edad y las concentraciones de ácido retinoico (p=0,023). Y una correlación directa entre el tiempo de permanencia intraocular del aceite y los niveles de colesterol (p=0,0008) que se mantiene hasta los 20 meses. ]]>
Conclusiones: Se confirma que el aceite de silicona no es una sustancia tan inerte ya que es capaz de disolver compuestos lipídicos procedentes de tejidos intraoculares. Existe una elevación linear de los niveles de colesterol que podría utilizarse como orientación para decidir cuándo extraer el aceite de silicona, aunque hacen falta estudios con series más grandes.
Palabras clave: Retinal, retinol, ácido retinoico, colesterol, a -tocoferol, aceite de silicona, sustitutivo vítreo.
SUMMARY
Objective: To verify the existence of organic lipophylic compounds in silicone oil extracted from human eyes following its use for previous retinal detachment, and to determine the intraocular permanence time of these substances in the oil.
Methods: Concentrations of retinoic acid, retinol, retinal, cholesterol and a -tocopherol were detected by HPLC in 23 samples of silicone oil extracted from patients with complicated retinal detachments. The time interval between the time of injection of the silicone oil and the subsequent assessment varied from 3 to 50 months (the permanence time).
Results: All tested compounds were found in the samples, but these were most commonly cholesterol and less frequently a -tocopherol. There was an inverse relationship between retinoic acid concentration and age (p=0.023), and a direct relationship between cholesterol concentration and permanence time (p=0.0008) at least up to 20 months.
Conclusions: These findings confirm that silicone oil is not an inert substance but is capable of extracting lipophylic compounds from the intraocular tissues. There is a clear linear elevation of cholesterol levels with increased intraocular permanence time. This finding could be used to further establish a safe permanence time for intraocular silicone oil used in ophthalmologic surgery. More studies with larger samples are warranted to evaluate this further (Arch Soc Esp Oftalmol 2006; 81: 13-20).
Key words: Retinal, retinol, retinoic acid, cholesterol, a -tocopherol, silicone oil, vitreous substitute.
]]> Introducción
El aceite de silicona (SiO), es un término utilizado para designar a cualquiera de los compuestos poliméricos hidrofóbicos basados en la química del siloxano que se emplean como sustitutivos vítreos desde la década de los años 60 (1).
Aunque se han considerado sustancias relativamente inertes se han publicado, a lo largo de estos años, numerosos efectos adversos, con sus correspondientes correlatos histopatológicos (2). Existen sin embargo trabajos que niegan esta toxicidad, o que la atribuyen a circunstancias no directamente relacionadas con el uso del SiO. En cualquier caso, no está siendo fácil encontrar alternativas para este sustitutivo vítreo de larga duración y en estos momentos se sigue considerando al SiO como la mejor opción para la reparación de desprendimientos de retina muy complejos.
Para mejorar su biocompatibilidad se utilizan aceites muy purificados, intentando reducir al máximo la presencia de los denominados compuestos de bajo peso molecular (Low Molecular Weight Components: LMWCs) (3-6).
Pero a pesar de que hoy se utilizan SiO con el más alto grado de pureza posible siguen existiendo complicaciones cuya patogenia sigue sin ser bien comprendida tales como la queratopatía en banda, la hipotonía crónica o el desarrollo de inflamación intraocular (2).
Algunos autores las han atribuido a efectos puramente mecánicos del aceite (7) lo que en ocasiones no es fácil de admitir a partir de los hallazgos anatomopatológicos encontrados en ojos humanos (6).
Un aspecto que no ha merecido excesiva atención por parte de los investigadores, es la naturaleza lipofílica de estos compuestos, de tal manera que pueden causar daño, porque son capaces de disolver los lípidos intraoculares. Teóricamente, y en función de sus parámetros de solubilización no se disolverían en el SiO los fosfolípidos ni las proteínas, pero sí lo harían el colesterol y sus esteres, así como las vitaminas liposolubles como la vitamina A. Esta posible capacidad patogénica, fue explorada por Miguel F. Refojo en 1988 (8) en estudios experimentales con conejos y analizando las concentraciones de lípidos en muestras de SiO que habían permanecido en dos ojos humanos durante 51 y 96 semanas respectivamente. Sus resultados mostraron la presencia de cantidades mensurables de colesterol y retinol, en los aceites (silicona y fluorsilicona), lo que se interpretó como una prueba de que estas sustancias no son tan inertes como se creía. El mismo autor realizó experimentos similares, con un copolímero de silicona-fluorsilicona, denominado SiFo (9,10) encontrando también la presencia de retinol y colesterol.
El propósito de este trabajo ha sido el analizar las concentraciones de colesterol, a-tocoferol y retinoides (ácido retinoico, retinol, retinal) en muestras obtenidas de pacientes en los que fue necesario utilizar SiO intraocular que fue extraído tras un cierto tiempo de permanencia intraocular, tras suponer el cirujano que el tiempo había sido el adecuado. Y así mismo intentar establecer las posibles correlaciones de dichas concentraciones con el tiempo que se mantuvieron dentro del ojo.
Sujetos, material y métodos
]]> Tras obtener la aprobación del Comité de Investigación de nuestro centro (Hospital Clínico Universitario de Valladolid), se extrajeron 23 muestras de SiO altamente purificado de 1.000 cs de pacientes en los que fue necesario utilizar esta sustancia para reparar desprendimientos de retina complejos, fundamentalmente complicados con vitreorretinopatía proliferante (VRP). Los procedimientos se realizaron conforme a la Declaración de Helsinki en su versión de 1983.Las características de la muestra aparecen en la tabla I.
Métodos analíticos
El SiO se extrajo del ojo del paciente con una jeringa de aspiración de vidrio, se depositó en un frasco del mismo material que fue sellado con un tapón de teflón y envuelto con papel de aluminio y se remitió al Departamento de Química Analítica, sin ninguna otra manipulación. Las muestras permanecieron en nevera y aislados de la luz hasta las determinaciones.
Para la determinación simultánea de ácido retinoico, retinol, retinal, colesterol y a -tocoferol se empleó la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Hewlett-Packard HP-1050,Waldbronn, Germany).
Para la separación se utilizo una columna C8 Zorbax (Jones Chromatography, Lakewood, Colorado, USA) (15 x 0,46 cm) de 5 mm de diámetro de partícula. Para llevar a cabo el análisis simultáneo de los cinco compuestos con sus respectivos patrones internos, se realizó un cambio de fase móvil. Se utilizó acetonitrilo: acetato amónico 0,2 M (75:25, v/v) a un flujo de 2 ml min-1 durante 10 minutos para a continuación, mediante un gradiente lineal de 1 minuto, pasar una mezcla de metanol: agua (95:5, v/v) a un flujo de 1,5 ml min-1 hasta el final de la separación. Para aumentar la sensibilidad de la determinación se realizó también un cambio en la longitud de onda de detección, realizándose a 350 nm durante los 14 primeros minutos y luego hasta el final del análisis a 210 nm.
En la figura 1 se muestra el cromatograma correspondiente a la inyección de 20 ml de una mezcla de patrones en las condiciones anteriormente citadas y en la figura 2 el correspondiente a una muestra de un paciente (el número 13 de la serie). Los tiempos de retención resultaron ser muy reproducibles, estando los coeficientes de variación comprendidos entre el 0,25% para el a-tocoferol y 2,16% para el ácido retinoico.
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Preparación de las muestras
Como paso previo a la extracción se realizó la eliminación total del agua con cloruro de metileno (2 ml por gramo de silicona). A continuación, se añadió sulfato sódico anhidro para completar la eliminación. Posteriormente se pasó por filtros de 0,45 mm para eliminar el sulfato sódico, y sobre el líquido, llevado a 50ºC, se burbujeó helio hasta la eliminación completa del disolvente.
Para aislar los compuestos de interés de la matriz de aceite de silicona se empleo la extracción en fase sólida con cartuchos de sílice (Si-Bond Elut, Varian) con 1 g de relleno. A 1 g de muestra seca se le añadieron 25 µl de acetato de retinol y de acetato de tocoferol, utilizados como patrones internos para la cuantificación, de concentración 0,1 mg ml-1, 25 µl de BHT de 1 mg ml-1, como antioxidante, y 1 ml de n-hexano. A continuación, la solución resultante, se hizo pasar por el cartucho previamente activado con el paso de 5 ml de n-hexano y se realizó la elución de los compuestos con 0,5 ml de metanol, se filtró y se procedió a su inyección en el cromatógrafo.
El tratamiento descrito proporcionaba elevadas recuperaciones, superiores al 93% para todos los compuestos y buena reproducibilidad.
Reactivos
]]> Todos los disolventes utilizados fueron de calidad HPLC. El acetonitrilo, metanol, n-hexano y n-propanol fueron adquiridos en Scharlau (Barcelona, España). El cloruro de metileno fue suministrado por Merck (Darmstadt, Alemania). El acetato amónico, acetato sódico, fosfato amónico monobásico, sulfato sódico anhidro fueron de grado analítico y proporcionados por Merck (Darmstadt, Alemania).El ácido retinoico, retinol, retinal, a -tocoferol, colesterol, acetato de retinol, acetato de a -tocoferol, utilizados como patrón interno y el butilhidroxitolueno (BHT) se adquirieron en Sigma-Aldrich (Madrid, España). El BHT se empleó como antioxidante estableciéndose con experimentos específicos que el empleo de 50 ppm de este compuesto permitía conservar los patrones con un error inferior al 3%, durante un período de 60 días.
Calibración
Se prepararon disoluciones individuales de cada uno de los compuestos en n-hexano y a partir de ellas se preparó una mezcla patrón de concentración conocida en cada uno de los compuestos de interés.
Para la cuantificación de los compuestos se utilizó el método del patrón interno. La calibración de los compuestos se realizó añadiendo diferentes volúmenes de la mezcla de patrones a 1 g de silicona purificada sometiéndolas al mismo tratamiento que las muestras a analizar. Las curvas de calibrado se obtuvieron por repetidas inyecciones de un volumen fijo de 20 µl en un rango de concentraciones de hasta 50 mg l-1, resultando ser lineales para todos los compuestos, obteniéndose límites de detección y cuantificación bajos.
Se estudió la influencia del sexo de los paciente, su edad y del tiempo de permanencia sobre las concentraciones de los diferentes compuestos mediante un análisis de regresión.
El programa estadístico utilizado es el Statgraphics versión Plus 5.1 (Manugistics, Inc, Dallas, EEUU).
Resultados
Las concentraciones de los diferentes compuestos lipídicos aparecen en la tabla II. En algunos casos no hay valores por encontrarse concentraciones inferiores al limite de detección. Esta situación fue especialmente llamativa en el caso del a-tocoferol, donde solo pudieron cuantificarse concentraciones en 7 de las 23 muestras.
]]> No se observaron diferencias significativas en cuanto al sexo en relación con los diferentes compuestos. Respecto a la edad se encontraron únicamente diferencias significativas en las concentraciones de ácido retinoico, que disminuyen al aumentar la edad de los pacientes (p = 0,023) (fig. 3). En cuanto a las concentraciones en función del tiempo de permanencia, únicamente se registraron diferencias significativas en las de colesterol (p = 0,0008) (fig. 4), que se elevó de forma gradual hasta los 20 meses.
Fig. 3. Concentraciones de ácido retinoico en función de la edad de los pacientes.
Existe una relación inversa significativa p=0,023.
Fig. 4. Concentraciones de colesterol en función del tiempo de permanencia
intraocular del aceite de silicona. Hay una relación significativa p=0,0008.
La elección de los compuestos lipídicos que se han estudiado en este trabajo se realizó en base a las indicaciones del trabajo inicial de Refojo (8) y a los parámetros de solubilidad de sustancias lipofílicas presentes en la retina y por lo tanto presuntas dianas para ser disueltas por el SiO durante su permanencia intraocular. Los retinoides (retinol, retinal y ácido retinoico), se encuentran en los vertebrados fundamentalmente en el epitelio pigmentario de la retina y en los fotorreceptores (11). El papel del retinol en el ciclo visual es de sobra conocido, pero hay que tener en cuenta que el retinol, en forma de 11-cis retinal se encuentra en el cromoforo y que tras su transformación a «all-trans retinol», es transportado al epitelio pigmentario de la retina donde se realiza el proceso de regeneración (11). Por su parte el ácido retinoico desempeña un papel importante en el funcionamiento de muchas células (12) donde parece actuar regulando la expresión de determinados genes. La vitamina A, en forma de retinol es captada por la célula que la oxida a ácido retinoico que es capaz de difundir al núcleo y unirse a receptores nucleares (12). Esta sustancia, disuelta en SiO, se ha utilizado en un modelo experimental de vitreorretinopatía proliferante para inhibir la proliferación celular, aprovechando precisamente su liposolubilidad relativamente alta (13). Respecto al a-tocoferol, que también forma parte de las vitaminas liposolubles resulta esencial para la integridad de las membranas celulares, y actúa como agente antioxidante (14).
Por su parte el colesterol y sus esteres con ácidos grasos de cadena larga son componentes importantes de las lipoproteínas de todas las membranas celulares y no solo de la retina (11).
Los resultados de este trabajo confirman que el SiO es capaz de extraer estos lípidos de los tejidos intraoculares. Esta extracción lipídica puede afectar no solo a las propiedades físicas del aceite si no a la propia funcionalidad de la retina y confirma que la silicona no es una sustancia tan inerte como aparece en la literatura (8).
Como ya se ha mencionado, la toxicidad de la silicona sobre la retina ha sido motivo de controversia desde el inicio de la utilización de esta sustancia como sustitutivo vítreo y aunque no hay un consenso en la literatura, en estos momentos se acepta que el aceite de silicona produce una respuesta inflamatoria intraocular mantenida (6,15,16) y nuestro grupo ha publicado otros trabajos que implican de forma indirecta a esta sustancia en otras manifestaciones de carácter inflamatorio, más generalizadas (17,18).
Además y como ya se ha comentado, hay trabajos experimentales que han demostrado la pérdida de las capas externas de la retina, lesiones en la capa de células ganglionares, e incluso presencia del SiO a nivel del nervio óptico (9,19). Y algunos trabajos han demostrado reducciones en las ondas a y b del electrorretinograma (20) todo lo cual apoya la idea de la toxicidad retiniana de esta sustancia.
A pesar de lo anterior, y de la reciente aparición de las denominadas siliconas «pesadas», el SiO sigue siendo en estos momentos la única alternativa válida para tratar determinados cuadros complejos de la patología vítreo-retiniana y aunque es importante conocer sus efectos adversos, sería más interesante, a nuestro juicio, disponer de una clara orientación del tiempo que puede permanecer en el interior del ojo, sin causar daños irreversibles. En este sentido al menos en lo que respecta al colesterol, hay una elevación de sus concentraciones en función del tiempo de permanencia, aunque este trabajo no permite establecer su significado patológico.
No se ha encontrado una explicación para la relación inversa que se ha detectado entre la edad de los pacientes y los niveles de ácido retinoico, hallazgo que debería ser corroborado con estudios posteriores.
En síntesis, se ha confirmado que el SiO es capaz de extraer compuestos lipídicos del interior del ojo, fundamentalmente de la retina, lo que permite afirmar que no es una sustancia inerte aunque no implica que sea igualmente tóxica.
Se necesitan más estudios en este sentido, al menos mientras siga siendo el sustitutivo vítreo de larga evolución mas empleado.
]]>Bibliografía
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Dirección para correspondencia:
J. Carlos Pastor Jimeno
Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada (IOBA). Edificio de Ciencias de la Salud
Avda. Ramón y Cajal, 7
47005 Valladolid
España ]]>
E-mail: pastor@ioba.med.uva.es
Recibido: 22.6.05.
Aceptado: 16.1.06.