Figura 1. (A y B): Laminectomias con extirpación
del arco posterior de D6 y D7 y exposición de la dura madre.
Radioprotección de la médula espinal mediante la hormona de crecimiento (GH). Estudio experimental en ratas
Protective effects of the growth hormone (GH) on the irradiated spinal cord in rats
A. Isla; M. Budke; A. García-Grande; A. Gómez de la Riva; C. Morales y J. Rey
Servicios de Neurocirugía y Radioterapia. Hospital Universitario La Paz. Madrid.
Este trabajo ha sido financiado por el FIS (PIO21225) y AESLEME
Dirección para correspondencia
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RESUMEN
La radioterapia empleada en el tratamiento de los tumores o malformaciones vasculares del SNC presenta riesgo de causar lesiones en los tejidos adyacentes.
El objetivo de nuestro estudio es demostrar las alteraciones provocadas por la radioterapia en la medula espinal de ratas a altas dosis y el valorar el efecto protector de la hormona de crecimiento (GH). El estudio experimental fue realizado con dos grupos de ratas Wistar. Grupo A (grupo control): Constó de 10 ratas que se irradiaron con 30 Gy en la medula espinal. Grupo B: Fue un grupo de 10 ratas irradiadas con 30 Gy a las que se administró 2mg/kg/día de GH tres días previos a la radioterapia, el día de la radioterapia, y dos días después. A los 14 días de la radioterapia fueron perfundidas mostrando el estudio histológico de la médula espinal de las ratas tratadas sólo con radioterapia de forma intensa, hemorragias y trombosis de capilares. Al grupo a las que se administró GH mostró una importante disminución de las lesiones.
En resumen la radioterapia administrada en dosis de 30 Gy causa cambios morfológicos como edema lesión del endotelio vascular, necrosis, hemorragias, exudado inflamatorio. La dosis de 2mg/kg/día ejerce un efecto protector en la medula espinal de ratas tras la administración de radioterapia disminuyendo el daño macro y microscópico en las ratas estudiadas.
Palabras clave: Hormona de crecimiento. Medula espinal. Radionecrosis.
SUMMARY
Radiotherapy or irradiation of SNC AVM's or tumors also presents a high risk for provoking lesionsin adjacent surrounding tissue. ]]>
The objective of our study is to demonstrate radiotherapy induced alterations in a rat spinal cord model and evaluate the protective effect of Growth Hormone (GH) on rats exposed to high radiotherapy doses.
The experimental study employed two groups of Wistar rats: Group A (control group):10 rats, which received 30 Gy at the spinal cord. Group B: 10 rats, these animals received 30 Gy and dose of 2mg/kg/day GH. Growth hormone administration was begun three days before radiotherapy and continued until two days after radiotherapy for a total of six days. At 14 days postradiotherapy, all the rats were sacrificed and the spinal cord extracted immediately. Hematoxyline-eosine histologic studies showed that control animals only exposed to radiotherapy had severe alterations with hemorrhage and vacuolisation of the entire irradiated segment while these alterations were much less severe in the GH-treated group.
In conclusion, 30 Gy irradiation produced morphological changes including vascular endothelial oedema, necrosis, hemorrhage, and inflamantory exudates. A 2 mg/kg/day dose of GH protected the rat spinal cord against the noxious effects of the radiotherapy, decreasing the clinical, macro and microscopic damage in the treated animals.
Key words: Growth hormone. Spinal cord. Radionecrosis.
Introducción
La irradiación empleada en la terapéutica radical o en el tratamiento paliativo de los tumores o malformaciones vasculares del sistema nervioso central (SNC) presenta un alto riesgo de causar lesiones en los tejidos neurales perilesionales sanos y también al radiar patologías cercanas al sistema nervioso8.
Los daños producidos por la irradiación del SNC se consideran el principal factor que limita el empleo de este tipo de tratamiento en radioterapia, ya que existe una íntima asociación entre el grado de las alteraciones producidas y factores como la dosis empleada y la duración del tratamiento radioterapéutico.
El SNC está constituido básicamente por neuronas, células de la glía (oligodendrogliocitos, astrocitos y microglia), células ependimarias y células del endotelio vascular. Cada tipo celular desempeña una tarea específica en el funcionamiento del SNC y la respuesta a la irradiación se establece también por las características histológicas de cada tipo celular. Las lesiones originadas por la irradiación del SNC afectan principalmente a las células que componen la glía y a las células del endotelio vascular16.
Entre las células de la glía, los oligodendrogliocitos (cuya función es la formación y el mantenimiento de la vaina de mielina axonal) son las células con mayor grado de afectación, en contraste con las neuronas, que por su alto grado de diferenciación y su escasa proliferación celular se consideran radiorresistentes11. Los principales cambios morfopatológicos producidos por la irradiación en el SNC consisten en una desmielinización producida por la muerte de los oligodendrocitos, asociada a áreas de necrosis en la sustancia blanca, que posteriormente ocasionan la formación de cavidades (malacias) y atrofia cerebral16.
]]> La muerte celular observada a consecuencia de la irradiación ocurre básicamente por dos mecanismos: apoptosis y necrosis celular. La apoptosis es un proceso de muerte celular programada por el cual el ADN sufre una rotura de su cadena y una degeneración de su estructura molecular a consecuencia de un daño cromosómico irreparable. La necrosis es un proceso distinto: la irradiación causa la muerte celular por el hinchamiento de la célula y de sus organelas, con la consiguiente ruptura de la membrana celular antes de la degradación del ADN4,15. Estudios recientes han demostrado que la GH (hormona del crecimiento) desempeña una función protectora en ratas tratadas con irradiación; se ha observado que protege las células de la mucosa intestinal de los efectos de la radioterapia, disminuyendo el número de células apoptóticas en la cripta intestinal14,18. La GH es una hormona secretada por el lóbulo anterior de la hipófisis y desempeña una importante función en el desarrollo del SNC. Actúa por medio de sus receptores en el SNC, produciendo una proliferación de las células gliales y la maduración de la glía y de las neuronas; también contribuye a la formación de la vaina de mielina10,12. En los cultivos de células de cortezas de embriones de ratas, la GH causa una acentuada proliferación celular y, posiblemente, desempeña una función protectora actuando en sus receptores específicos o indirectamente por medio de IGFI (del inglés insulin-like growth factor)10. El objetivo del presente estudio es valorar el posible efecto protector de la GH en la medula espinal de la rata a dosis alta, con respecto a otro grupo donde no se administró la hormona.
Materiales y métodos
Utilizamos ratas Wistar de 350 -550 gr de peso. En todas ellas se realizó el siguiente procedimiento quirúrgico: anestesia intraperitoneal con la combinación de KetolarR (0.5cc ), ValiumR (0.4 cc) y Atropina (0.2 cc) ; previa asepsia con solución yodada y fijación del animal en un aparato de estereotaxia, se realizó una incisión longitudinal medial en la piel de la región espinal torácica con la consiguiente exposición del cordón espinal. Se expusieron dos segmentos entre T5 y T10 y se practicó una incisión longitudinal de 2 cm en la línea media en la región dorsal con disección subperióstica con microscopio. A continuación se realizaron laminectomías con extirpación del arco posterior de D6 y D7 y exposición de la dura madre (Fig. 1 A y B).
Figura 1. (A y B): Laminectomias con extirpación
del arco posterior de D6 y D7 y exposición de la dura madre.
Como fuente de irradiación se utilizó un aparato de irradiación por contacto tipo Roetgen, con un aplicador C2 de 10 mm que por visión directa se dirigió a la diana (Fig. 2). La dosis a utilizar fue la necesaria para producir edema medular (y/o radionecrosis) en el menor tiempo posible. La dosis encontrada para producir este tipo de lesión, según un protocolo previo diseñado en nuestro servicio por el método de dosis creciente, fue de 30.000 cGy, con un tiempo de exposición por contacto de 9 minutos con 74 segundos, y con una tasa de dosis de 5133 cGy / min. La lesión causada por dicha radiación se desarrolló en menos de una semana de seguimiento.
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Figura 2: Administración de radioterapia por contacto tipo Roetgen,
con un aplicador C2 de 10 mm que por visión directa se dirigió a la diana.
El trabajo constó de 2 grupos principales:
Grupo A (control): Fue de 10 ratas en las que sólo fueron tratadas con radioterapia medular a una dosis de 30 Gy
Grupo B: También formado por 10 ratas en las que se realizó un tratamiento con radioterapia medular y con la GH a una dosis de 2 mg/kg/día de forma subcutánea. La dosis de administración de la hormona GH (Genotonorm®de Pfeizer) fue de tres días previo a la radioterapia, en el día de la radioterapia y dos días posteriores a la radioterapia.
A los 14 días después de la radiación, todas las ratas fueron sacrificadas y prefundidas intracardicamente con paraformaldehído al 4%, teniendo especial cuidado en extraer la medula espinal para su inclusión en parafina. Seguidamente se realizaron cortes sagitales para estudio de los cambios morfológicos con tinción de hematoxilinaeosina con el objetivo de comparar en los dos grupos el área de edema y/o radionecrosis, reacción glial, y características vasculares del tejido cerebral irradiado. El grado de lesión histológica se realizó según la extensión de la lesión histológica y lo dividimos en 5 grados lesionales: muy leve corresponde de 0-2 mm, leve de 2-4 mm, moderado de 4-6 mm, grave de 6-8 mm y muy grave mayor de 8 mm. Una vez realizada las mediciones se realizaron estudio estadístico para observar la diferencia entre ambos grupos.
Resultados
La extensión de la lesión se midió con ayuda del microscopio utilizando un ocular milimetrado con objetivo 2 x valorándose la extensión de la lesión en milímetros en los cortes longitudinales de las médulas (Tabla 1).
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Los resultados de los estudios realizados con hematoxlina-eosina según la valoración realizada (5 grados lesionales) en muy leve, leve, moderado, grave y muy grave mostraron que en el grupo donde sólo se administró radioterapia la mayoría de las ratas presentaban graves alteraciones histológicas con hemorragias y vacuolización de todo el segmento donde se administró radioterapia, observándose afectación leve en 3 casos, moderada en 1 caso, grave en 1 caso y muy grave en 5 casos (Fig. 3 A y B). En el grupo en el que se administró radioterapia y se trató con GH se evidenció una disminución de las lesiones, apreciándose 6 casos muy leves de afectación, 2 casos leves, 1 caso moderado y 1 caso grave Tabla 2).
Figura 3. (A y B): Ejemplos de los estudios realizados en la medula espinal (cotes coronales)
con Hematoxlina-eosina (3x) 14 días de la administración de la Radioterapia (30 Gy). A.
Imagen de médula espinal de rata a la que se administró radioterapia y no se le protegió con GH.
Se observa un grado lesional grave con graves alteraciones histológicas con hemorragias
y vacuolización de todo el segmento donde se administró radioterapia (Grado 5 de lesión). ]]>
B Corte histológico de médula espinal de rata, a la que además de la radioterapia
(misma dosis) se administró GH, no apreciándose lesiones de importancia (Gado 1 de lesión).
El análisis estadístico se realizó comparando la media de la extensión de la lesión de los dos grupos con la T-Students. En dicho análisis se observó que en el grupo GH negativo (GH-) presentó la extensión de la lesión con una media de 7,90 mm con desviación estándar de 4,067, y en el grupo tratado con la GH (GH+) una media de 2,4 mm con desviación estándar de 1,35. Comparando los dos grupos la diferencia estadística fue significativa p < 0,005 (Tabla 3).
Discusión
La irradiación empleada en el tratamiento de los tumores y malformaciones vasculares del SNC puede causar importantes alteraciones en los tejidos adyacentes8. En el tratamiento con radiocirugía se administra una dosis máxima de radioterapia en un área reducida de tejido nervioso que puede implicar lesiones en áreas que rodean a estos procesos.
]]> En el ámbito celular, las principales alteraciones producidas son la muerte de las células del endotelio vascular, de las células de la glía y, en dosis más elevadas, también de las neuronas1,3,9,12,13,16.Tradicionalmente, la muerte celular de las células expuestas a la irradiación se ha atribuido a los fenómenos de apoptosis y necrosis16. La muerte por apoptosis es un mecanismo complejo en el cual la célula, sin posibilidades de reparar adecuadamente el daño en la cadena de ADN causado por la irradiación, entra en un proceso de muerte autoprogramada; este tipo de muerte sería una forma activa de "suicidio", en el cual el citoplasma y el núcleo celular, tras sufrir un proceso de degeneración, quedarían condensados en la periferia de la célula7. Por otra parte, el daño vascular producido por la afectación del endotelio contribuiría a la disminución de la vascularización e indirectamente a daño isquémico con muerte celular1,3.
Estudios microscópicos realizados en células de cortezas de ratas jóvenes tratadas con radioterapia demuestran la existencia de apoptosis celular en dosis de irradiación entre 0,4 y 4 Gy7,11. Las interacciones entre las neuronas y la neuroglia ocurren por medio de varias moléculas señalizadoras como las citoquinas, iones y metabolitos6,11.
Respecto a la interacción de las células del SNC irradiadas se supone que una de las funciones de los astrocitos sería la protección de las neuronas, evitando su muerte. Una posible hipótesis -según algunos estudios experimentales realizados- sería que los astrocitos, por su capacidad de captar el glutamato extracelular, protegerían las neuronasde la toxicidad producida por la radioterapia.
En los cultivos tratados con irradiación y con GH observamos un número inferior de células apoptóticas 24 horas después del tratamiento con radioterapia7. La rotura de la cadena de ADN, causada por la radioterapia, promueve la apoptosis celular siempre que la doble hélice no se repara adecuadamente2. Actualmente es conocido que el tejido nervioso dispone de receptores de GH5,17 y que la GH puede actuar a nivel del SNC. Se conoce que GH ejerce una acción mitogénica induciendo a un aumento en la expresión del péptido cmyc, un marcador del ciclo celular que sincroniza la transición de la fase GO-G1 del ciclo celular a la fase S, en la síntesis del ADN. Esta sincronización de las células en la misma fase (fase S) del ciclo celular podría hacerlas más radiorresistentes y posiblemente sería uno de los mecanismos protectores ejercidos por la GH18.
Otro probable mecanismo de protección sería la proliferación de las células gliales causada por la GH, debido al papel fundamental ejercido por la glía en el intercambio de iones entre las células de la corteza y el espacio intercelular6. En los cultivos sometidos a radioterapia, la glía ejerce una función radioprotectora captando el glutamato extracelular y disminuyendo su toxicidad para las células presentes en los cultivos7,11. Esta acción probablemente se limita a las células que presentan receptores para la GH en sus membranas, con el fin de que esta hormona pueda ejercer su efecto protector. En este sentido, la GH, provocando proliferación de las células gliales, protegería a todas las células de la toxicidad del glutamato extracelular. También se ha observado que la GH tiene un efecto vasodilatador y de protección del endotelio vascular1 por lo que influiría en la protección del daño que podría producirse por la irradiación.
En nuestro estudio hemos comprobado que la GH administrada a ratas cuando éstas reciben dosis altas de irradiación a nivel de la médula espinal, las preserva de presentar lesiones preferentemente de tipo vascular como histológicamente se ha demostrado con hematoxilina-eosina con respecto a un grupo control en donde no se administró radioterapia. En el análisis estadístico se observó que en el grupo sin GH presentó la extensión de la lesión con una media de 7,90 mm con desviación estándar de 4,067 y en el grupo tratado con la GH una media de 2,4 mm con desviación estándar de 1,35. Comparando los dos grupos la diferencia estadística fue significativa p < 0,005.
En resumen, creemos que la GH es útil como radio-protector y puede tener diversas aplicaciones, como en la radiocirugía o la radioterapia, donde se administra una dosis elevada de radiación que puede implicar lesiones del sistema nervioso en las áreas adyacentes al proceso a tratar como malformaciones vasculares o tumores.
La radioterapia administrada a la médula espinal de la rata a dosis de 30 Gy produce cambios morfológicos como edema lesión del endotelio vascular, necrosis, hemorragias, exudado inflamatorio.
La hormona de crecimiento en una dosis de 2mg/kg/día subcutánea ejerce un efecto protector en la médula espinal de ratas tras la administración de radioterapia disminuyendo el daño macro y microscópico en las ratas estudiadas.
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Dirección para correspondencia:
Dr. Alberto Isla Guerrero.
Servicio de Neurocirugía.
Hospital Universitario La Paz.
Paseo de la Castellana 261. 28046 Madrid
Recibido; 4-03-06.
Aceptado: 12-07-06