Christian Oscar Mosca ⁽¹⁾, María Dolores Moragues ⁽²⁾, Sonia Brena ⁽³⁾, Alcira Cristina Rosa ⁽⁴⁾, José Pontón ⁽⁵⁾

(1) Profesor Ayudante de Microbiología y Parasitología. Cátedra de Microbiología y Parasitología. Facultad de Odontología. 
Universidad de Buenos Aires
(2) Catedrática E.U. de Bioquímica y Fisiología. Departamento de Enfermería I. Universidad del País Vasco
(3) Doctoranda. Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina y Odontología. 
Universidad del País Vasco
(4) Profesora Titular de Microbiología y Parasitología. Cátedra de Microbiología y Parasitología. Facultad de Odontología. 
Universidad de Buenos Aires
(5) Catedrático de Microbiología. Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología.  ]]> Facultad de Medicina y Odontología. Universidad del País Vasco

Recibido: 05/11/2003 Aceptado: 01/02/2004

RESUMEN

Objetivos: Utilizar varios métodos que permiten la diferenciación entre Candida albicans y Candida dubliniensis en un intento de conocer si C. dubliniensis puede ser aislada de la cavidad oral de adolescentes con prótesis ortopédicas orales.
Materiales y métodos: Se aislaron 12 cepas de género Candida procedentes de mucosa palatina y de soporte de prótesis de 12 pacientes adolescentes portadores de prótesis ortopédicas orales. Para la diferenciación entre C. albicans y C. dubliniensis se utilizaron varias pruebas fenotípicas (la asimilación de fuentes de carbono con el método comercial ID 32C, el crecimiento en agar glucosado de Sabouraud a 45 ºC, la producción abundante de clamidosporas en agar caseína, y la reactividad mediante inmunofluorescencia indirecta con un antisuero específico para C. dubliniensis) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El serotipado de C. albicans se realizó con el anticuerpo monoclonal B9E.
Resultados: Los 12 pacientes estudiados presentaron una estomatitis protésica tipo 2 de Newton y en todos los casos se aislaron las mismas especies de la muestra de mucosa y de la de prótesis del mismo paciente. El CHROMagar Candida y la prueba de la filamentación en suero permitieron diferenciar los aislamientos que daban lugar a colonias de color verde y filamentaban de los que daban colonias violetas y no lo hacían. Unicamente el aislamiento del paciente 8 fue positivo con el antisuero específico para C. dubliniensis y produjo abundantes clamidosporas en agar caseína, mientras que ocho aislamientos no presentaron crecimiento a 45 ºC. La identificación de todos los aislamientos se consiguió con la prueba ID 32C, identificándose C. albicans en el 75% de los pacientes, C. glabrata en el 16,6% y C. dubliniensis en el 8,3%. La PCR con iniciadores específicos para el tipado de C. dubliniensis permitió la identificación del aislamiento del paciente 8 como C. dubliniensis genotipo 1.
Conclusión: C. dubliniensis puede ser aislada de la cavidad oral de adolescentes con estomatitis asociada a prótesis ortopédicas y es posible, y técnicamente asequible, la diferenciación entre C. albicans y C. dubliniensis mediante la realización de pruebas como el ID 32C, la observación de abundantes clamidosporas en agar caseína, la reactividad con un antisuero específico para C. dubliniensis y la PCR.

Palabras clave: Candida dubliniensis, estomatitis protésica, Candidiasis.

INTRODUCCIÓN

El agente etiológico más importante de la candidiasis oral es Candida albicans, pero la incidencia de las infecciones causadas por otras especies como Candida krusei, Candida tropicalis y Candida glabrata ha ido aumentando progresivamente (2, 3). La razón del cambio epidemiológico que está provocando esta emergencia no está clara, aunque se ha sugerido que la reducida sensibilidad de estas especies a los antifúngicos utilizados comúnmente, como el fluconazol, puede haber llevado a su selección (4).

Candida dubliniensis es una de las especies emergentes que parecía estar asociada principalmente con la infección oral en pacientes infectados por el VIH (2, 5, 6) pero que ha sido aislada también en otras localizaciones anatómicas, de individuos sanos y en casos de infección sistémica (2, 7-9). La estrecha relación fenotípica y genotípica que existe entre C. dubliniensis y C. albicans ha llevado a identificar incorrectamente la mayoría de los aislamientos de C. dubliniensis como C. albicans (2, 5), dificultando un análisis exhaustivo de esta especie (10). En los últimos años se han desarrollado una serie de pruebas fenotípicas y genotípicas que han permitido la identificación rápida y fiable de C. dubliniensis en muestras clínicas (11-16). En este estudio hemos utilizado varios métodos que permiten la diferenciación entre C. albicans y C. dubliniensis en un intento de conocer si C. dubliniensis puede ser aislada de la cavidad oral de adolescentes con prótesis ortopédicas orales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes. Se estudiaron 24 muestras procedentes de la cavidad bucal de 12 pacientes no relacionados que fueron atendidos en el Hospital Nacional de Odontología (Buenos Aires, Argentina). La observación e historia clínica fue realizada por el mismo odontólogo a todos los pacientes. Los pacientes estudiados tenían entre 12-18 años, portaban prótesis ortopédicas orales y presentaban una historia médica-odontológica clínica no relevante. Los criterios de exclusión fueron la existencia de inmunosupresión o de lesiones asociadas con leucoplasias, liquen erosivo y epiteliomas. Las muestras orales se obtuvieron con torunda de la prótesis y de la mucosa palatina en contacto con la prótesis.
Cultivo e identificación. Las muestras clínicas se sembraron en agar glucosado de Sabouraud (Difco, Detroit, Mich. USA) durante 48 h a 30ºC. Como controles para las pruebas de identificación se utilizaron las cepas C. albicans serotipo A (NCPF 3153) y C. dubliniensis CD36 (NCPF 3949, genotipo 1) de la National Collection of Pathogenic Fungi (NCPF, Bristol, United Kingdom), así como la C. albicans serotipo B (ATCC 90028) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Para el tipado de C. dubliniensis también se utilizaron las cepas CBS 2747 (genotipo 2) del Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrecht, The Netherlands), p6265 (genotipo 3) y p7718 (genotipo 4) (17). Los aislamientos obtenidos se identificaron mediante métodos morfológicos y fisiológicos convencionales que incluían tinción de Gram, filamentación en suero, crecimiento en CHROMagar Candida (CHROMagar Microbiology, Paris, Francia) y la asimilación de fuentes de carbono con el método comercial ID 32C (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia) (18). El serotipado de C. albicans se realizó mediante la técnica descrita por Barturen et al. (19).

Para la diferenciación entre C. albicans y C. dubliniensis se utilizaron varias pruebas fenotípicas y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dentro de las primeras, se estudió el crecimiento en agar glucosado de Sabouraud a 45 ºC durante 48 h (12), la producción abundante de clamidosporas en agar caseína (14), y la reactividad mediante inmunofluorescencia indirecta con un antisuero específico para C. dubliniensis (15). La identificación y caracterización de los genotipos de C. dubliniensis se realizó mediante PCR con las parejas de iniciadores G1F/G1R, G2F7/G2R, G3F/G3R y G4F/G4R, esencialmente como ha sido descrito por Brena et al. (17).

RESULTADOS

Los 12 pacientes estudiados presentaron una estomatitis protésica tipo 2 de Newton (hiperémica, lisa y atrófica), aislándose en todos los casos colonias levaduriformes en agar glucosado de Sabouraud. Tras la identificación, se comprobó que en todos los casos se habían aislado las mismas especies de la muestra de mucosa y de la prótesis del mismo paciente.

La observación del color de las colonias en CHROMagar Candida permitió diferenciar los aislamientos que daban lugar a colonias verdes de los que daban colonias violetas (Tabla 1). La misma diferenciación se obtuvo con la prueba de la filamentación en suero, ya que los aislamientos que producían colonias verdes filamentaban en suero, mientras que los que producían colonias violetas no lo hacían. Dado que no es fácil diferenciar C. albicans de C. dubliniensis por el color de las colonias y que no se puede diferenciar estas dos especies por la filamentación en suero, los aislamientos que dieron colonias de color verde y filamentaban en suero se identificaron como C. albicans/C. dubliniensis, mientras que los que dieron colonias de color violeta como C. glabrata/C. parapsilosis/C. guilliermondii.

La PCR con iniciadores específicos para el tipado de C. dubliniensis permitió la identificación del aislamiento del paciente 8 como C. dubliniensis genotipo 1 (Figura 1c).

DISCUSIÓN

La estomatitis protésica asociada a Candida es un proceso inflamatorio que afecta la mucosa oral del 25-65% de los pacientes portadores de prótesis dentales (20). Aunque la estomatitis protésica se diagnostica generalmente en adultos, también puede ser observada en niños y adolescentes que tienen prótesis ortopédicas orales (21). C. albicans es la causa más importante de origen fúngico en la estomatitis protésica, pero otras especies del género Candida también pueden estar implicadas (22). En este trabajo, C. albicans se aisló en la mayoría de los pacientes con estomatitis protésica, pero también se aislaron C. glabrata y C. dubliniensis.

A medida que se van realizando más estudios, C. dubliniensis se está asociando con un mayor número de presentaciones clínicas de la candidiasis oral. Aunque la presentación clínica más frecuente de la candidiasis oral causada por C. dubliniensis es la candidiasis eritematosa (23), también se han descrito casos de eritema lineal gingival en niños y de estomatits protésica causados por C. dubliniensis en adultos, aunque en el caso de la estomatitis protésica, C. dubliniensis se coaisló con otras especies del género Candida (2, 24), por lo que su participación en la patogenia de la infección no quedó aclarada. A nuestro entender, el paciente descrito en este trabajo es el primer caso de estomatitis protésica causada directamente por C. dubliniensis en un adolescente portador de una prótesis oral ortopédica. La presentación clínica de la candidiasis oral de este paciente, que portaba un aparato de disyunción para aumentar el diámetro transversal del maxilar superior, no presentaba características diferenciales con respecto a las observadas en el resto de los pacientes.La diferenciación entre C. albicans y C. dubliniensis requiere pruebas especiales, ya que las pruebas que se utilizan convencionalmente en los laboratorios de Micología no suelen ser eficaces. En este sentido, ni la coloración de las colonias en CHROMagar Candida ni la ausencia de crecimiento a 45 ºC resultaron eficaces para identificar nuestro aislamiento de C. dubliniensis. Las pruebas que permitieron la diferenciación entre ambas especies fueron el ID 32C, la observación de abundantes clamidosporas en agar caseína, la reactividad con un antisuero específico para C. dubliniensis y la PCR. De estas cuatro pruebas, las dos primeras son las que más fácilmente pueden realizarse en los laboratorios de Micología ya que el ID 32C puede obtenerse comercialmente y el agar caseína no requiere materiales sofisticados (14). Aunque en este estudio las dos pruebas sirvieron para la identificación de C. dubliniensis, el ID 32C no es capaz de identificar todos los aislamientos de C. dubliniensis (11) y la identificación presuntiva realizada con el agar caseína es aconsejable confirmarla con otra técnica. Además de la identificación de C. dubliniensis, el ID 32C permitió la identificación definitiva de los aislamientos de C. albicans y C. glabrata.

El análisis por PCR permitió la realización de un doble objetivo. En primer lugar sirvió para confirmar que el aislamiento del paciente 8 era C. dubliniensis, ya que estos iniciadores no amplifican los aislamientos de C. albicans (17). En segundo lugar permitió conocer el genotipo, lo que proporciona una información de interés epidemiológico. El aislamiento de C. dubliniensis del paciente 8 pertenecía al genotipo 1, que es el genotipo más frecuente (25) y que ha sido detectado mayoritariamente en aislamientos orales en España (17).

En conclusión, los resultados de este estudio demuestran que C. dubliniensis puede ser aislada de la cavidad oral de adolescentes con estomatitis asociada a prótesis ortopédicas y que es posible, y técnicamente asequible, la diferenciación entre C. albicans y C. dubliniensis mediante la realización de pruebas como el ID 32C, la observación de abundantes clamidosporas en agar caseína, la reactividad con un antisuero específico para C. dubliniensis y la PCR.

AGRADECIMIENTOS ]]> Este trabajo ha sido financiado con los proyectos 9/UPV 0093.327-13550/2001 de la Universidad del País Vasco e IE019, subproyecto Diamolfun del programa Etortek, del Departamento de Industria, Comercio y Turismo del Gobierno Vasco.

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