Expresión de las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II
y moléculas co-estimuladoras en carcinomas orales in vitro
Expression of Major Histocompatibility Complex class II and costimulatory molecules in oral carcinomas in vitro
Mariana Villarroel Dorrego (1), Paul M Speight (2), A William Barrett (3)
(1)Departamento de Patología, Medicina y Cirugía Bucal, Universidad Santa María, e
Instituto de Investigaciones Odontológicas, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela
(2) Department of Oral Pathology, School of Clinical Dentistry, University of Sheffield,
Claremont Crescent, Sheffield S10 2TA, United Kingdom ]]>
Correspondencia:
Mariana Villarroel Dorrego
Facultad de Odontología, Módulo 10. Universidad Santa María
Vía Mariches. Caracas-Venezuela
Fax: 0058- 2129780403
E-mail: mvillarroeldorrego@cantv.net
Recibido: 4-06-2004 Aceptado: 11-02-2005
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Villarroel-Dorrego M, Speight PM, Barrett AW. Expression of Major Histocompatibility Complex class II and costimulatory molecules in oral carcinomas in vitro. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2005;10:188-95. © Medicina Oral S. L. C.I.F. B 96689336 - ISSN 1698-4447 |
| RESUMEN El descubrimiento de que el epitelio escamoso estratificado que cubre la mucosa oral podía expresar moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II en varias condiciones patológicas de tipo inflamatorio abrió la posibilidad de que los queratinocitos orales sean células inmunológicamente activas, las cuales pueden funcionar con "células presentadoras de antígenos". Para una efectiva activación de los linfocitos T, las células presentadoras de antígenos requieren, además de la expresión de moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II, señales co-estimuladoras. El propósito del presente estudio fue determinar la expresión de moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II y las moléculas co-estimuladoras CD40, CD80 y CD86 en queratinocitos bucales normales y derivados de carcinomas de células escamosas. Usando citometría de flujo en queratinocitos cultivados de mucosa oral sana y siete líneas celulares derivadas de carcinomas orales, fue confirmado que los queratinocitos expresan moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II después de estimulación con IFN γ in vitro. Todas las líneas celulares expresaron constitutivamente CD40, por el contrario, CD80 y CD86 universalmente fueron negativos. La ausencia de estas últimas moléculas pudiera ser la causa por la cual los carcinomas orales escapan de la vigilancia inmunológica y pueden crecer, invadir y hacer metástasis pese al sistema inmunológico. Palabras clave: CD40, CD80, CD86, Complejo Mayor de Histocompatibilidad, epitelio oral, carcinoma oral. | ABSTRACT Recognition in the 1980’s that keratinocytes can express class II molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC) first raised the possibility that these cells might have an immunological function, and may even act as antigen presenting cells (APC). For effective T lymphocyte activation, APC require, in addition to MHC II, appropriate costimulatory signals. The aim of this study was to determine the expression of MHC class II and the co-stimulatory molecules CD40, CD80 and CD86 in keratinocytes derived from healthy oral mucosa and oral carcinomas. Using flow cytometry, it was confirmed that oral keratinocytes "switch on" expression of MHC class II molecules after stimulation with IFN γ in vitro. All keratinocyte lines expressed CD40 constitutively; by contrast, CD80 and CD86 were universally absent. Loss of CD80 and CD86 may be one means whereby tumours escape immunological surveillance.. Key words: Costimulatory molecules, CD40, CD80, CD86, Major Histocompatibility Complex, oral epithelium, oral squamous cell carcinoma.
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INTRODUCCIÓN
Los queratinocitos son células que forman el epitelio plano estratificado que recubre la piel y las membranas mucosas del tracto aerodigestivo y genital femenino. Los queratinocitos son capaces de expresar moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) lo cual ha sugerido la posibilidad de que estas células tengan una función inmunológica, e inclusive puedan actuar como células presentadoras de antígenos (CPA). Así mismo, han cobrado mucha importancia en inmunología las moléculas co-estimuladoras, las cuales son determinantes de la respuesta celular. Entre las señales co-estimuladoras existen, al menos dos, que son indispensables para la activación de las células T: CD80/CD86 y el receptor CD28 y CD40 y su ligando CD40L (CD154) (1).
CD80, es una proteína de 60 kD, miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) y fue el primer ligando de CD28 identificado (2). CD86, es una proteína de 80 kD, miembro de la misma familia que CD80 (3,4). En general, la estructura de CD80 es muy similar a la de CD86 (5). Ambas poseen dos dominios extracelulares parecidos al de las Ig, un dominio de transmembrana y una terminación citoplasmática.
La expresión de CD80 y CD86 es casi exclusiva de los tejidos linfoides. Las células que las expresan son las células de Langerhans (6), los monocitos(3) y los linfocitos B activados(7). CD80 está ausente en CPA inactivas, en cambio CD86 está expresada constitutivamente en estas células pero en muy bajos niveles (8) y es rápidamente regulada después de la presentación antigénica (9). Esto sugiere que CD86 inicia la respuesta inmune y CD80 la amplifica y regula (10).
Las moléculas del CMH clase II inducen la expresión de CD86 y CD28, con la activación simultánea de CD40 y CD40L. CD40 es una glucoproteína de 48 kD que pertenece a la superfamilia de los receptores de factor de necrosis tumoral. En humanos, CD40 es compuesta por un dominio extracelular de 171 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 22 aminoácidos, y una terminación citoplasmática de 62 aminoácidos (11). CD40 se expresa generalmente en CPA y en algunas células no linfoides como los fibroblastos y los queratinocitos (12).
La expresión de CD80 y CD86 ha sido observada en líneas celulares derivadas de carcinomas gástricos, esofágicos, colorectales y hepáticos los cuales han sido previamente estimulados con interferón gamma (IFNγ) (13,14). Estas moléculas, por lo contrario, no han podido ser observadas ni in vitro ni in vivo en carcinomas de cabeza y cuello (15-18). La expresión de CD40, al contrario de CD80 y CD86, ha sido observada en numerosas líneas celulares derivadas de carcinomas de diferentes sitios anatómicos (19), sugiriendo la importancia de esta molécula en el proceso de carcinogénesis. La presencia de CD40 en líneas celulares derivadas de carcinomas de cabeza y cuello ha sido observada previamente (15,18,20,21), sin embargo, el rol de CD40 en estos queratinocitos permanece desconocido.
La importancia de CD80 y CD86 en la respuesta inmunológica contra las neoplasias malignas es ilustrada por estudios donde la expresión de CMH clase II en ausencia de CD80 y CD86 limita la activación de linfocitos T CD4+, a niveles tales que se promueve la progresión tumoral (22,23). Las razones por las que el tumor crece en presencia de linfocitos es desconocido. Se ha sugerido que la respuesta inmune destruye células menos "dañinas", lo cual favorece a un fenotipo maligno de células tumorales, que el sistema inmune es suprimido por un estimulo carcinogénico, que el tumor produce factores supresivos que inhiben la activación linfocitaria y/o que el tumor escapa del reconocimiento inmunológico a través de la pérdida de moléculas co-estimuladoras (24-26).
El objetivo del presente trabajo fue determinar si los queratinocitos derivados de carcinomas orales expresaban las moléculas involucradas en la activación linfocitaria: CMH clase II y las moléculas co-estimuladoras CD80, CD86 y CD40.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> Líneas de queratinocitos orales. En el presente trabajo se estudiaron una línea de queratinocitos derivada de mucosa oral sana y siete líneas celulares de queratinocitos derivadas de carcinomas orales.Los cultivos de queratinocitos orales normales (NOK) fueron realizados por el método directo (27). Fragmentos de mucosa bucal sana, obtenida de exodoncias o cirugías periodontales, fueron sumergidos rápidamente en alcohol, buffer fosfato salino (PBS) y finalmente en medio para cultivo de queratinocitos. El epitelio fue separado del conectivo y cortado en pequeños trozos, de aproximadamente 1mm3 de tamaño, y sembrados en frascos de cultivo celular de 25cm2. Los queratinocitos fueron cultivados en medio de cultivo para queratinocitos (medio Dulbecco’s modified Eagle’s con piruvato de sodio y 1000mg/l glucosa suplementado con nutrient mixture F-12 (HAM) con L-glutamina, 10% suero fetal bovino (Globepharm), factor de crecimiento epidérmico (Sigma), hidrocortisona, insulina, adenina, penicilina, estreptomicina y anfotericina B (Gibco) en una incubadora humificada, en una atmósfera de CO2 al 5% y de aire al 95% a 37° C. La contaminación por fibroblastos fue identificada morfológicamente y removida mecánicamente(27). El fenotipo celular fue verificado con inmunotinciones para citoqueratinas. Las líneas celulares humanas de queratinocitos derivados de carcinomas orales de células escamosas (COCE) H103, H157, H314, H357, H376, H400, H413 también fueron utilizadas(28). Las características de estas líneas celulares se resumen en la tabla 1. La línea celular FC-7 (linfocitos B transformados con el virus Epstein Barr) fue incluida y utilizada como control positivo.
Anticuerpos. Todos los anticuerpos primarios fueron monoclonales de ratón anti-humano. Para la fenotipificación de los NOK, anti- panel de citoqueratinas, el cual identifica las citoqueratinas 5, 6, 8, y 17, clon MNF116 (Dako) fue utilizado en una concentración 1:100. Para la identificación del CMH clase II, CD40, CD80 y CD86, los siguientes anticuerpos fueron utilizados: anti- HLA clase II (DP+DQ+DR) clon IQU9 (Novocastra) dilución 1:200; anti-CD40 clon LOB7/6 (Serotec) dilución 1:100; anti-CD80/B7-1 clon DAL-1 (Serotec) y L307.4 (BD Pharmingen) ambos a una dilución de 1:20 y finalmente anti- CD86/ B7-2 clon BU63 (Serotec) y clon IT2.2 (BD Pharmingen) diluidos 1:20.
Citometría de Flujo. Cuando los queratinocitos cultivados formaron una capa confluente, se añadió 500U/ml de IFNg a cada frasco de cultivo y se incubaron en una atmósfera de CO2 al 5% y de aire al 95% a una temperatura de 37o C por 36 horas. La toxina de cólera fue omitida del medio de cultivo para prevenir inhibición competitiva con el IFNγ (29).
Una vez transcurrido el período de estimulación con IFNγ, 1x106 células/ml aproximadamente fueron incubadas con los anticuerpos primarios por una hora a temperatura ambiente con agitación constante. Se usaron como controles negativos las mismas células pero omitiendo la incubación con el anticuerpo primario y a cambio se utilizó una inmunoglobulina de igual isotipo. Los controles positivos fueron células FC-7, las cuales expresan todos los marcadores a estudiar. Después de una hora, las células fueron incubadas con el anticuerpo secundario de chivo anti-ratón fragmento F(ab’)2 conjugado con R-ficoeritrina (RPE) (Dako) o con el anticuerpo secundario de conejo anti-ratón fragmento F(ab’)2 conjugado con fluoresceina isotiocianate (FITC) (Dako) por 30 minutos. Las células fueron finalmente lavadas tres veces y resuspendidas en medio de cultivo para ser trasferidas a tubos Falcon para su análisis. Fue utilizado un citómetro de flujo Becton Dickinson FACScan 420 y los resultados adquiridos y analizados con el software Cell QuestTM## . El background fue calibrado antes de cada experimento usando los controles negativos. 1x104 "eventos" fueron analizados y grabados para cada muestra. Los datos fueron recolectados en forma de histogramas y gráficos de punto (dot plot). La media y la mediana de la intensidad de fluorescencia así como los porcentajes de eventos positivos fueron obtenidos después del análisis de los gráficos, usando el mismo software.
Análisis estadístico. Los datos fueron analizados usando el paquete estadístico SPSS®, versión 11.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). La diferencias entre las medias de dos grupos fue evaluado usando t de Student para muestras independientes y las comparaciones de varias grupos fue realizada con el test de ANOVA (usando el test de Bonferroni). Valores p menores a 0.05 fueron considerados estadísticamente significativos.
RESULTADOS
Expresión de moléculas del CMH clase II en queratinocitos orales. Los cultivos primarios NOK y la línea celular H357 no expresaron CMH clase II constitutivamente. El resto de las líneas celulares mostraron un nivel de expresión extremadamente bajo. IFNγ indujo la expresión de CMH clase II en todas las líneas celulares. IFNγ aumentó significativamente la expresión de CMH clase II tanto en queratinocitos normales como en las líneas de carcinoma (p≤ 0.01) tanto en la intensidad de la fluorescencia como en el porcentaje de células positivas. Cuando las medias de intensidad de fluorescencia fueron comparadas (bajo tratamiento con IFNγ), no se observó diferencia estadísticamente significativa entre los queratinocitos normales y las líneas de carcinoma, con la excepción de la línea H376, la cual mostró la mayor intensidad de fluorescencia (p<0.05). Sin embargo, las líneas H376 y H103 mostraron los menores porcentajes de células CMH clase II-positivas (62.5% y 55.85% respectivamente) (Fig. 1).
Al igual que CD80, la expresión de CD86 (Fig. 3) no pudo ser detectada en NOK ni tampoco en las líneas derivadas de COCE constitutivamente. Un aumento de la expresión de CD86 estadísticamente significativo (p=0.05) fue observado en NOK después de la estimulación con IFNγ (de 0.68% a 6.24%). Muy similar a CD80, CD86 no fue expresado o lo fue en niveles muy bajos en todas las líneas de queratinocitos. Sin embargo, en general, la expresión de CD86 siempre fue ligeramente mayor que CD80.
Expresión de CD40 en queratinocitos orales. La expresión de CD40 en queratinocitos orales está ilustrada en la Fig. 4. Todas las líneas celulares expresaron CD40. Cuando la media geométrica de intensidad de fluorescencia fue comparada, NOK expresaron el mismo nivel de CD40 que la línea H357. Sin embargo, H357 mostró mayor porcentaje de células CD40-positivo (p=0.025). Las restantes líneas celulares expresaron niveles constitutivos de CD40 estadísticamente más elevados que NOK. El aumento de la expresión de CD40 fue inducido por IFNγ en todas las líneas celulares. IFNγ causó un incremento estadísticamente significativo en todas las líneas a excepción de H413.
DISCUSIÓN
Los resultados de este estudio coinciden con investigaciones previas, en las que no ha sido observada que la presencia de CMH clase II en queratinocitos normales (18,30) y neoplásicos con la excepción de la línea H314 constitutivamente (31,32). La presencia de moléculas del CMH clase II también fue observada universalmente tras la activación con IFNγ. El mismo nivel de CMH clase II fue observado en queratinocitos normales y neoplásicos, lo cual fue reportado previamente por Farmer et al. (18). La inducción de moléculas del CMH clase II en los queratinocitos de la mucosa oral y piel normal después de la exposición a IFNγ in vitro ha sido bien estudiada previamente (18,30,31,33-36) y fue completamente reproducible en este trabajo.
Trabajos de inmunohistoquímica de carcinomas de boca, piel, cuello uterino y laringe (31,18,37) han corroborado estos hallazgos in vivo. Usando un modelo experimental de carcinogénesis oral, Matthews et al. (38) demostraron que la expresión de las moléculas del CMH clase II en queratinocitos orales se observaba en las primeras etapas de la transformación maligna.
La expresión de CD40 observada en este trabajo es consistente con reportes previos de CD40 en líneas epiteliales orales (18). Un incremento en la expresión de CD40 en la superficie de los queratinocitos fue observado en todas las líneas gracias al tratamiento con IFNγ. Esta misma regulación ha sido estudiada por Farmer et al.(18) y Vonderheide et al.(17). IFNγ fue capaz de mejorar la expresión de CD40 en términos de intensidad de tinción sin embargo el porcentaje de células CD40-positivo se mantuvo similar. El aumento de esta molécula, dependiente de IFNγ, pareciera ser un hallazgo general ya que ha sido observado tanto en queratinocitos de piel y de boca (18,39) y en una diversa gama de carcinomas derivados de otros lugares anatómicos (40). La presencia de CD40 tanto en condiciones normales como en estados neoplásicos induce a pensar si esta molécula cumple distintas funciones en cada escenario o si la expresión constitutiva es meramente de reposo y requiere de un proceso de activación.
]]> Dado que los queratinocitos fueron capaces de expresar moléculas del CMH clase II y CD40, la siguiente pregunta sería si la ausencia de CD80 o CD86, dos moléculas esenciales de la función inmunitaria, son la causa del escape de los tumores orales a la vigilancia inmunológica.Las moléculas co-estimuladoras CD80 y CD86 no se expresaron constitutivamente en queratinocitos orales en condiciones normales in vitro. La expresión de CD80 no ha sido evaluada previamente en la mucosa oral ni in vivo ni in vitro. La ausencia de CD86 fue consistente con observaciones previas de Farmer et al. (18). Sin embargo, es interesante resaltar que los queratinocitos normales respondieron al IFNγ con una ligera expresión de CD80 y CD86 lo cual no ocurrió con las líneas derivadas de COCE. Las líneas celulares derivadas de COCE mostraron ausencia o niveles constitutivos muy bajos de CD80 y CD86, los cuales no fueron inducidos por la acción de IFNγ. La ausencia o expresión mínima de CD80 y CD86 es consistente con previos trabajos realizados en queratinocitos de carcinomas de cabeza y cuello (15,17,18,20).
La ausencia de CD80 y CD86 en queratinocitos derivados de carcinomas orales podría ser un hallazgo de gran importancia. Aunque los estudios de hace varios años sugirieron que los queratinocitos podrían inducir la activación linfocitaria en ausencia de señales co-estimuladoras(41-43), estudios más recientes, como los de Thomas et al. (25,44), asocian la pérdida de la expresión de CD80 por queratinocitos orales como la primera evidencia de desarrollo de carcinomas, considerándolo un marcador de progresión e invasión tumoral. Otros autores apoyan la idea de que el re-establecimiento de la expresión de CD80 y CD86 en tumores induce o incrementa la respuesta linfocitaria anti-tumoral (25,44-47) y finalmente varios trabajos han sugerido que la ausencia de CD80 y CD86 en queratinocitos, orales o epidérmicos, es la mayor limitación en la activación linfocitaria (15,17,48). De esta manera, la expresión de CD80 y CD86 por queratinocitos orales podría promover una efectiva destrucción tumoral, y la habilidad de algunos tumores de evadir las defensas del huésped es causada por la incapacidad de expresar estas moléculas co-estimuladoras.
Un escenario in vivo puede entonces ser propuesto: la célula tumoral es considerada por las CPA, en este caso las células de Langerhans, un antígeno y éstas presentan el mismo a los linfocitos provocando su activación y la producción de citocinas por parte de los queratinocitos. Los queratinocitos ya expresan niveles de CD40, pero esta molécula es incrementada como resultado de la acción de las citocinas y así empiezan a expresar moléculas del CMH clase II, CD86 y CD80 y de esta forma amplifican y propagan la respuesta inmunitaria. Si los queratinocitos no pueden expresar CD80 y CD86 no se puede dar el proceso de respuesta inmunitaria y los queratinocitos neoplásicos burlan a los linfocitos.
Si este es realmente el caso, el epitelio estratificado oral trabaja como un órgano inmunológico y no solamente como una barrera física, desarrollando un mecanismo inmunológico molecular y celular complejo que involucra queratinocitos y linfocitos.
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