ORIGINALES

Comparación de las acciones osteogénicas de la proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) en modelos de ratón diabético y con déficit del factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-I)

Comparison of the osteogenic actions of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) in diabetic and insulin-like growth factor-I (IGF-I) deficient mouse models

López-Herradón A.^1,2, Lozano D.^1,2,3, Portal-Núñez S.^1,2, Ardura J.A.^1,2, Gutíerrez-Rojas I.^1,4, Maycas M.^1,2, Rodríguez L.^3,5,6, Varela I.^3,5,6 y Esbrit P.^1,2

¹ Laboratorio de Metabolismo Mineral y Óseo - Instituto de Investigación Sanitaria (IIS)-Fundación Jiménez Díaz - Universidad Autónoma de Madrid
² Red Temática de Investigación Cooperativa en Envejecimiento y Fragilidad (RETICEF) - Instituto de Salud Carlos III - Madrid ]]> ³ Instituto de Investigación Hospital Universitario La Paz (IdiPAZ) de Madrid
⁴ Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM) - Instituto de Salud Carlos III - Madrid
⁵ Instituto de Investigaciones Biomédicas "Alberto Sols" - CSIC-Universidad Autónoma de Madrid
⁶ Unidad 761 - Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER) - Instituto de Salud Carlos III - Madrid

Trabajo becado con una Beca de Investigación en Biología Molecular FEIOMM 2011.

Dirección para correspondencia

RESUMEN

La diabetes mellitus (DM) es una patología metabólica caracterizada por hiperglucemia crónica debida al déficit de producción y/o acción de la insulina. La DM, sobre todo la tipo 1, se asocia comúnmente a osteopenia/osteoporosis y al aumento de riesgo de fracturas. El factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-I), un factor abundante en la matriz ósea que ejerce un papel importante en el desarrollo y mantenimiento de la masa ósea, disminuye en la DM. La proteína relacionada con la parathormona (PTHrP), un modulador del crecimiento y la función osteoblástica, actúa sobre los osteoprogenitores promoviendo la diferenciación osteoblástica y la regeneración ósea. Su expresión disminuye en situación diabética. En este trabajo, hemos evaluado y comparado las acciones osteogénicas de la PTHrP en modelos murinos de DM tipo 1 y deficiente en IGF-I. Los ratones diabéticos por inyección de estreptozotocina presentan una disminución de la masa ósea en los huesos largos, asociada al incremento de proteínas oxidadas y a la disminución de expresión de genes relacionados con la vía Wnt y de la proteína β-catenina, además de mostrar alteraciones en el hueso trabecular vertebral. En el modelo de ratón con déficit de IGF-I, nuestros resultados indican una situación de osteopenia tanto en el fémur (asociado a una inhibición de la vía Wnt) como en la columna (L1-L5). Nuestros hallazgos demuestran que la administración de PTHrP, predominantemente a través de su dominio N-terminal, modula la vía de Wnt canónica en relación a sus acciones osteogénicas en situación diabética y, también en parte, en ausencia de IGF-I.

SUMMARY

Diabetes mellitus (DM) is a metabolic pathology characterised by chronic hyperglycemia due to a deficit in the production and/or action of insulin. DM, above all type I, is commonly associated with osteopenia/osteoporosis and with an increased risk of fractures. Insulin-like growth factor-I (IGF-I), a factor abundant in the bone matrix which plays a significant role in the development and maintenance of bone mass, diminishes with DM. Parathyroid hormone-related protein (PTHrP), a modulator of growth and osteoblast function, acts on osteoprogenitors, promoting osteoblast differentiation and bone regeneration. Its expression is reduced in the presence of DM. In this work we have evaluated and compared the osteogenic actions of PTHrP in mouse models with type 1 DM and IGF-I deficiency. Diabetic mice by injection of streptozotocin had a reduction in bone mass in the long bones associated with an increase in oxidised proteins and a reduction in the expression of genes related to the Wnt pathway and of β-catenin protein, as well as alterations in vertebral trabecular bone. In the mouse model with IGF-I deficit our results indicate the presence of osteopenia both in the femur (associated with an inhibition of the Wnt pathway) and the spine (L1-L5). Our findings demonstrate that the administration of PTHrP, predominantly through its N-terminal domain, modulates the canonical Wnt pathway in relation to its osteogenic actions in a diabetic situation and also, in part, in the absence of IGF-I.

Key words: PTHrP, diabetes mellitus, IGF-I, osteopenia, Wnt pathway.

Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una patología metabólica caracterizada por una hiperglucemia crónica debida al déficit de producción y/o acción de la insulina, responsable de la disfunción de órganos tales como la retina, el riñón, el sistema nervioso y el sistema cardiovascular [1]. Además, la DM se asocia comúnmente a osteopenia/osteoporosis y al aumento de riesgo de fracturas, por mecanismos solo parcialmente caracterizados [2]. La DM tipo 1 (DM1), o insulino-dependiente, se caracteriza por niveles bajos de insulina y del factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-I) circulantes y se suele manifestar antes de alcanzar el pico de masa ósea, mientras que la tipo 2 (DM2) -asociada a resistencia insulínica- es común en adultos [3]. Las alteraciones esqueléticas en la DM1 incluyen: 1) una disminución del crecimiento óseo longitudinal durante la pubertad en adolescentes; 2) una disminución de masa ósea en cadera, cabeza del fémur y columna vertebral en adultos; 3) un incremento del riesgo de fractura; y 4) una disminución de la capacidad regenerativa ósea. Las características de la DM son compatibles con un bajo nivel de remodelado óseo [4-7]. La hiperglucemia induce una menor proliferación y función osteoblástica. Además, los productos de glicosilación avanzada (AGEs) contribuyen a la generación de estrés oxidativo, incrementando la fragilidad ósea y el riesgo de fracturas [8,9].

Entre los factores endocrinos y locales con acción ósea demostrada, la insulina, producida y secretada por las células βpancreáticas, y el IGF-I mayoritariamente producido en el hígado pero también en el hueso donde se acumula en la matriz ósea, merecen una especial consideración en la osteopatía asociada a la DM [10,11]. Estudios en ratas diabéticas tipo 1 indican el papel del déficit de insulina en la disminución de la integridad y resistencia ósea [12,13]. Además, los pacientes con DM1 poseen niveles séricos de IGF-I significativamente disminuidos en relación a los encontrados en individuos normales o en pacientes con DM2 [14]. Se sabe que el IGF-I sistémico juega un importante papel en el desarrollo y mantenimiento de la masa ósea. De hecho, ratones con una deficiencia global en IGF-I presentan al nacer un tamaño de aproximadamente el 60% del correspondiente a sus controles, que disminuye al 30% a las 8 semanas, y presentan una menor mineralización ósea y un bajo remodelado óseo [15-17].

Por otra parte, la proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) juega un papel fundamental en el desarrollo del hueso endocondral retrasando la diferenciación de los condrocitos en la placa de crecimiento, y actúa como un importante regulador local del remodelado óseo en adultos [18]. Ratones homozigotos Pthrp-/- presentan una condrodisplasia letal perinatal; mientras que los heterozigotos Pthrp+/- son viables pero exhiben una reducción significativa de la masa ósea [19]. La PTHrP posee similitud estructural con la PTH en su extremo N-terminal, pero difiere completamente de esta hormona en el resto de su estructura. La región media y C-terminal de la PTHrP contiene distintos epítopos singulares, asociados a efectos auto/paracrinos e intracrinos en distintos tipos celulares [20]. Como consecuencia de su procesamiento post-trasduccional [21], la PTHrP puede generar distintos fragmentos bioactivos: 1) un fragmento N-terminal 1-36; 2) uno o varios fragmentos en la región media, cuyos aminoácidos 88-91 y 102-106 son dominios de localización nuclear/nucleolar (NLS); y 3) un fragmento C-terminal que contiene la secuencia 107-111 conocida como osteostatina. Aunque aún no se ha logrado aislar un receptor para esta región C-terminal de la PTHrP, se ha demostrado que señaliza en parte a través de la transactivación del receptor 2 del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) asociada a sus acciones en los osteoblastos [22-24]. Estudios previos han demostrado que la PTHrP revierte los efectos deletéreos de la DM1 sobre el número de células osteoformadoras y la función osteoblástica en la tibia de ratón en regeneración [25]. Además, la PTHrP es capaz de compensar la disminución de diferenciación osteoblástica y la inhibición de la señalización a través de Wnt/β-catenina -una vía clave estimuladora de la formación ósea- inducidas por la alta glucosa en células osteoblásticas in vitro [24,26,27].

Teniendo en cuenta estas consideraciones, en el presente trabajo hemos evaluado y comparado las consecuencias del déficit de insulina (DM1) y de IGF-I en la eficacia de la PTHrP para inducir acciones osteogénicas en el ratón.

Materiales y métodos

Todos los estudios realizados en animales fueron desarrollados con la aprobación del Comité de Experimentación y Bienestar Animal del IIS-Fundación Jiménez Díaz. El dolor y el sufrimiento de los animales fueron paliados de acuerdo a la normativa europea vigente (Directiva 2010/63/UE). Igualmente, el diseño experimental se adaptó al criterio conocido como las 3R (del inglés, replace, reduce, refine) para minimizar el número de animales que permitan obtener resultados significativos [28].

Modelo de ratón con DM1

Se utilizaron ratones CD-1 macho de 4 meses de edad (Harlan Interfauna Ibérica, Barcelona), estabilizados durante dos semanas en el bioterio del IIS-Fundación Jiménez Díaz. Los animales tuvieron acceso libre a agua y a una dieta estándar (8,8 g/kg de calcio y 5,9 g/kg de fósforo; Panlab, Reus), a 22^oC con ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para inducir la DM, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con estreptozotocina (STZ) (Sigma-Aldrich, San Luis, Misuri, EE.UU.), una citotoxina pancreática, durante 5 días consecutivos a una dosis de 45 mg/kg de peso corporal en tampón citrato sódico 50 mM, pH 4,5, o con el vehículo salino (controles) [25]. Una semana después de la última inyección se midió la glucosa en sangre, extraída de la cola del ratón, mediante un glucómetro (Glucocard G+-meter, Menarini Diagnostics, Florencia, Italia), considerándose diabéticos aquéllos con glucemia ≥250 mg/dl (Figura 1A). Dos semanas tras la confirmación de la DM, los ratones se trataron con PTHrP (1-36) (Nt) o PTHrP (107-139) (Ct) (Bachem, Bubendorf, Suiza), 100 μg/kg en cada caso, o con tampón salino fosfatado, pH 7,4 (TSF) (vehículo de los péptidos) cada dos días por inyección subcutánea, durante un total de 14 días (Figura 1A). Se utilizaron 5 ratones/grupo en cada uno de estos 4 grupos experimentales.

Dos horas después de la última inyección de cada tratamiento, los animales se pesaron y posteriormente fueron sacrificados con una mezcla de ketamina (Pfizer, Madrid, España) 20 mg/kg y xilacina (Bayer, Kiel, Alemania) 5 mg/kg (2:1, v/v). Posteriormente, se extrajeron los fémures, las tibias (descartando el peroné) y las vértebras L1-L5, eliminando los restos de músculo adyacentes. Los huesos largos se destinaron a la obtención de cultivos de células mesenquimales de médula ósea (CMMOs) o fueron almacenados para la posterior extracción de ARN (en N2 líquido) o el análisis de proteínas carboniladas (a -80^oC). Las vértebras se almacenaron a -20^oC hasta su inclusión en metacrilato para análisis de histomorfometría ósea.

Modelo de ratón deficiente en IGF-I

Los ratones con deficiencia homozigótica de IGF-I (Igf1-nulos), de 3 meses de edad y un fondo genético mixto MF1/129sv, se generaron tras el cruce de ratones heterozigotos con una deleción en el exón 4 del gen Igf1 [15]. Los ratones fueron genotipados mediante Southern Blot tras la extracción de ADN genómico proveniente de la cola con REDExtract-N-AmpTMTissue PCR Kit (Sigma-Aldrich) y se caracterizaron por criterios funcionales [29,30].

Se establecieron 4 grupos experimentales con 6 ratones/grupo, control e Igf1-nulos, tratados con PTHrP (1-36), PTHrP (107-111) o con TSF. Se administraron los péptidos de la PTHrP (80 μg/kg en cada caso) o el vehículo salino por inyección subcutánea cada 48 horas durante dos semanas. Se eligió esta dosis debido a que dosis similares de estos péptidos inducen efectos anabólicos o anti-resortivos, respectivamente, en roedores [25,29-31]. A las 2 h. de la última inyección, los ratones se sacrificaron como se ha descrito anteriormente. Los huesos largos se destinaron a la obtención de CMMOs. Los fémures sobrantes se almacenaron en N2 líquido para posterior extracción de ARN total, y las vértebras L1-L5 para histomorfometría.

Cultivo de CMMOs ex vivo

Densitometría ósea

Mediante absorciometría dual de rayos X (DXA) se midieron la densidad mineral ósea (DMO; g/cm2), el contenido mineral óseo (CMO; g) y el % de grasa periósea en el cuerpo total, el fémur, la tibia y la columna lumbar (vértebras L1-L5) (regiones de interés) de los ratones anestesiados. La DXA se llevó a cabo utilizando un equipo PIXIMus I (GE Lunar Corp., Madison, Wisconsin, EE.UU.). El programa de este equipo calcula los parámetros citados en diferentes regiones del esqueleto (excluyendo la cabeza) con un coeficiente de variación de ±2%.

Histomorfometría ósea

Las muestras de vértebras L1-L5 se fijaron durante 24 horas en etanol al 70% y, posteriormente, se deshidrataron en etanol 96% durante dos días y etanol absoluto otros dos días. A continuación, las muestras se incluyeron en metil-metacrilato polimerizado (Merck, Whitehouse Station, Nueva Jersey, EE.UU.), siguiendo un protocolo estándar [34]. A continuación, se realizaron cortes seriados de 7 μm lo más cercanos al eje sagital de la columna con un microtomo Leica RM 2255, que fueron depositados en portas pre-tratados con gelatina de Haupt, se cubrieron con una lámina de polietileno y se prensaron durante 20-24 horas a 60^oC. Antes de teñir las muestras, éstas se desplastificaron en metil-acetato (Merck) durante 15-30 minutos, seguido de rehidratación con etanol a concentraciones decrecientes (absoluto, 70% y 50%) y lavado con agua destilada. La tinción de Von Kossa permite visualizar el hueso mineralizado de color negro. La tinción con tricrómico de Goldner tiñe en azul, los núcleos celulares; en rojo, los ribetes de osteoide; y en verde, el hueso mineralizado. Tras las tinciones, las muestras se deshidrataron y se montaron con resina DPX (VWR, Lovaina, Bélgica).

Para determinar los parámetros histomorfométricos, se utilizó un micrómetro acoplado a una retícula rectangular en el ocular del microscopio (Olympus BX41, Olympus, Melville, Nueva Yersey, EE.UU.) [32]. Se determinó: el volumen trabecular frente al volumen óseo total (BV/TV); el grosor medio trabecular (Tb.Th); el número de trabéculas (Tb.N); y la separación trabecular (Tb.S), según los criterios de la American Society for Bone and Mineral Research [33]. Estos parámetros fueron evaluados por 2 observadores de manera independiente.

Análisis de expresión proteica por transferencia western

Para extraer la proteína total del fémur se procedió a su homogenización mecánica en un mortero. Las proteínas se extrajeron con tampón RIPA [50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, Tritón X-100 al 1%, deoxicolato sódico al 1% y dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,1%], suplementado con inhibidores de proteasas (Protease inhibitor cocktail P8340, Sigma-Aldrich) y de fosfatasas (Phosphatase inhibitor cocktail Set II, Calbiochem, La Jolla, California, EE.UU.). Tras incubación durante 30 minutos a 4^oC, las muestras se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 minutos, recogiendo los sobrenadantes. La medida de la concentración de proteína se realizó por el método del ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific, Rockford, Illinois, EE.UU.), utilizando una curva patrón de seroalbúmina bovina. En los extractos proteicos se cuantificaron las proteínas carboniladas, mediante derivatización de los grupos carbonilo con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNP-hidrazina) utilizando el ensayo comercial OxyBlot protein oxidation detection kit (Millipore, Billerica, Massachusetts, EE.UU.). La proteína DNP-hidrazona estable obtenida se detecta por inmunotransferencia. Para ello, las proteínas derivatizadas (20 μg) se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS al 12,5%, y posteriormente se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinidileno (Schelider & Schuel, Keene, Nueva Hampshire, EE.UU.), seguido de incubación con un anticuerpo primario policlonal anti-DNP y con un secundario conjugado con peroxidasa de rábano. Las bandas resultantes se visualizaron por quimioluminiscencia (ECL Western Blotting Detection Reagents; GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).

Para el análisis de las proteínas procedentes de los CMMOs, los extractos proteicos (20 μg) fueron separados en gel de poliacrilamida-SDS al 8% con β-mercaptoetanol al 5%. A continuación, las muestras se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Trans-Blot® SD semi-dry transfer cell, Bio-Rad, California, EE.UU.). Seguidamente, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 2,5% en un tampón Tris-salino (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,1%). Posteriormente, estas membranas fueron incubadas en presencia del anticuerpo primario policlonal correspondiente a β-catenina ([dilución 1:10000]; Abcam, Cambridge, Reino Unido) y de IgG de cabra anti-conejo combinado con peroxidasa de rábano [(dilución 1:10000); Santa Cruz, California, EE.UU.]. Como control de carga se analizó la expresión de β-actina [(dilución 1:500); Santa Cruz].

Análisis de la expresión génica por PCR cuantitativa a tiempo real (RT-PCR)

Las curvas de disociación verificaron la obtención de un único producto de amplificación en el caso del uso de cebadores específicos. Los niveles de expresión en cada condición experimental relativos al control basal se calcularon como 2-ΔΔCt (ΔΔCt = ΔCt tratamiento-ΔCt basal) como se ha descrito anteriormente [27]. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado.

Estadística

Los resultados se expresaron como media ± error estándar de la media (EEM). La comparación entre varios grupos se realizó mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. La comparación paramétrica entre dos grupos se realizó mediante la prueba t de Student; mientras que en aquellas comparaciones no paramétricas se realizó la prueba de Mann Whitney. Las diferencias con una p<0,05 fueron consideradas significativas. Los análisis se llevaron a cabo con el programa informático Graphpad InStat (San Diego, California, EE.UU.).

Resultados

Acciones osteogénicas de la PTHrP en un modelo de osteopenia asociada a DM1 en ratón

Mediante histomorfometría realizada en las vértebras (L1-L5), observamos que los ratones diabéticos mostraban una disminución del volumen trabecular total (BV/TV), del grosor medio (Tb.Th) y del número de trabéculas (Tb.N.) y un incremento de separación trabecular (Tb.S); parámetros que se normalizaron tras el tratamiento con los péptidos de la PTHrP (Tabla 3). La tinción de Von Kossa permitió visualizar claramente estas alteraciones en el hueso trabecular de las vértebras en cada uno de los grupos experimentales estudiados (Figura 2).

Dado que la DM se asocia a un incremento de estrés oxidativo, analizamos la producción de proteínas oxidadas en el fémur de los ratones diabéticos [35]. Estos animales presentaban un aumento de proteínas oxidadas respecto a los controles, que mostró una tendencia a la normalización tras el tratamiento con PTHrP (1-36), pero no con PTHrP (107-139) (Figura 3C).

Alteraciones de la masa y la estructura óseas asociadas al déficit de IGF-I en ratón y su modulación por la PTHrP

Los ratones Igf1-nulos mostraron una disminución significativa de la DMO y CMO respecto a los ratones control en el cuerpo total, fémur y columna (L1-L5) (Figura 4A). Al final del período de estudio (día 14), los ratones Igf1-nulos mostraron menos ganancia de masa ósea en el cuerpo total, pero mayor en fémur y en columna, respecto a la de los controles (Figura 4B). El tratamiento con ambos péptidos de la PTHrP produjo un aumento significativo de masa ósea en el cuerpo total y en el fémur de los ratones Igf1-nulos (Figura 4B). Mediante análisis histomorfométrico, se observó una alteración general en los parámetros estructurales evaluados en las vértebras L1-L5 de los ratones Igf1-nulos respecto a los controles. El tratamiento con los péptidos de la PTHrP normalizó el BV/TV y el Tb.Th. en estos animales (Tabla 4).

En los ratones Igf1-nulos, encontramos en el fémur una disminución de un gen inicial y otro final, claves en la actividad de la vía canónica de Wnt, Wnt3a, y Cx43, que resultó parcialmente compensada por el tratamiento con los péptidos de la PTHrP (Figura 5A).

Además, quisimos comprobar si la PTHrP podría ejercer acciones osteogénicas autónomas a nivel celular en ausencia de IGF-I. Para ello, utilizamos cultivos de CMMOs provenientes de ratones controles e Igf1-nulos, tratados in vitro con ambos péptidos de la PTHrP. Estos cultivos a partir de ratones Igf1-nulos mostraron una menor capacidad de mineralización en comparación con la de los ratones control, que no se afectó por el tratamiento con ambos péptidos de la PTHrP (Figura 5B).

Discusión

Efectos osteogénicos de la PTHrP en un modelo murino de DM1 inducido por STZ

En el presente estudio observamos una pérdida de peso en los ratones diabéticos, debida posiblemente a la acción lipolítica y a la pérdida muscular inducida por la droga STZ [36,37]. Utilizando DXA, corroboramos este hallazgo con el descenso observado en el porcentaje de grasa periósea en el cuerpo total y los huesos largos de los ratones diabéticos. En dichas localizaciones observamos, además, una disminución de masa ósea a las 4 semanas de la instauración de la DM. El tratamiento con los péptidos de la PTHrP compensó esta osteopenia, de acuerdo a observaciones previas en este modelo de DM1 tras la administración de análogos de PTH y PTHrP [25,26,38,39].

Datos recientes de nuestro grupo han mostrado alteraciones de la vía Wnt/β-catenina en el hueso de ratones con DM1 inducida por STZ, asociadas a una disminución de esclerostina correspondiente a una mayor tasa de apoptosis osteocítica en la tibia de estos ratones [42]. Por otra parte, se ha encontrado una sobreexpresión de Sost y Dkk1 (inhibidores de la vía Wnt canónica) en la tibia de ratas diabéticas [43]. En humanos, se han encontrado altos niveles de esclerostina y una disminución de β-catenina en el suero de pacientes con DM2 [44]. Los resultados del presente trabajo demuestran una alteración en la expresión de genes canónicos de las etapas iniciales de la vía Wnt en el hueso murino diabético, en contraste con lo observado en la rata diabética [43]. Así pues, las alteraciones en los componentes de la vía Wnt en situación diabética parece compleja y dependiente de la especie.

El estado hiperglucémico asociado a la DM1 condiciona un aumento de las especies reactivas del oxígeno (ROS), que producen aumento de la carbonilación proteica [35,45]. El aumento observado de proteínas carboniladas en el fémur de los ratones diabéticos se redujo en los tratados con el fragmento N-terminal de la PTHrP. En este sentido, se ha descrito la capacidad de la PTH para disminuir la producción de ROS en CMMOs del fémur de ratones viejos [46]. El exceso de ROS en el hueso diabético afecta a la osteoblastogénesis -derivando la diferenciación de las CMMOs a adipogénesis- [47,48] y a la función osteoblástica -disminuyendo la expresión de Runx2, FA y Col1α- [49] y también activando la transcripción de FoxO, el cual antagoniza la señalización de Wnt canónica [50]. Así, encontramos una disminución de β-catenina en los cultivos de CMMOs provenientes de los huesos largos de los ratones diabéticos. A este respecto, en un modelo de ratón diabético no obeso (similar al modelo de DM1 por STZ) se ha observado una supresión de la vía PI3K/AKT en células osteoprogenitoras que podría contribuir a la desestabilización de la β-catenina en estas células [51]. En humanos, se ha caracterizado una mutación en el gen Sirt1 directamente relacionada con el desarrollo de DM1 [52], que resulta de interés, ya que la proteína SIRT1 promueve la translocación al núcleo de la β-catenina en células osteoprogenitoras [53].

Nuestros hallazgos demuestran que la PTHrP (predominantemente su fragmento N-terminal) es capaz de contrarrestar, al menos en parte, el estrés oxidativo y las alteraciones de distintos componentes activadores de la vía Wnt como parte de sus acciones osteogénicas en el hueso diabético.

Efectos osteogénicos de la PTHrP (1-36) y la osteostatina en un modelo murino deficiente en IGF-I

El sistema IGF juega un papel determinante en la regulación del crecimiento somático. Se ha sugerido que una disminución en la producción y/o en la actividad de IGF-I podría contribuir a la pérdida de masa ósea asociada a la edad [54]. Sin embargo, también se ha especulado que esta disminución determinaría un menor remodelado óseo y así preservar la solidez de los huesos largos en esta situación [55]. El IGF-I aumenta la formación ósea periostal, pero sus efectos en el hueso trabecular son variables [16,56,57]. Las diferencias observadas en el esqueleto de los ratones deficientes en IGF-I podrían ser consecuencia del efecto dual de este factor en la osteoblastogénesis y la osteoclastogénesis y su impacto relativo según la localización ósea [16].

En el presente trabajo, hemos utilizado un modelo de ratón con deficiencia en la expresión de Igf1 que muestra alteraciones significativas en la masa y la estructura ósea trabecular de las vértebras, compensadas en parte por ambos péptidos de la PTHrP. Resulta de interés mencionar los efectos anabólicos de la PTH observados en el hueso trabecular de ratones con deficiencia del IGF-I proveniente de la síntesis hepática [58]. La baja actividad resortiva asociada a la deficiencia del IGF-I podría facilitar la manifestación de una acción anabólica de la PTHrP a nivel trabecular [16,59]. De hecho, se han descrito efectos anabólicos de ambos fragmentos N- y C-terminal de la PTHrP en el hueso trabecular del fémur en el modelo de ratón diabético por STZ, con bajo remodelado óseo [25,26].

Observamos cambios significativos en varios componentes de la vía Wnt canónica compatibles con las alteraciones en el remodelado óseo en los ratones deficientes en IGF-I. Datos previos en ratones con déficit de IGF-I en osteocitos muestran una marcada deficiencia en el desarrollo óseo y en la respuesta a la estimulación mecánica, asociadas a una activación deficitaria de la vía Wnt [60,61]. En nuestro estudio, encontramos que la administración de PTHrP (1-36) u osteostatina corrige en parte las alteraciones observadas en la vía Wnt canónica en los ratones deficientes en IGF-I. En este sentido, como demuestran nuestros datos, tanto la PTHrP (1-36) como el fragmento C-terminal nativo PTHrP (107-139) actúan sobre esta vía metabólica en ratones diabéticos por STZ [25,26,42].

Por otra parte, encontramos que las CMMOs de los ratones con déficit de IGF-I mostraron una menor capacidad osteogénica que los ratones control. Un resultado similar se obtuvo en ratones con déficit de Igf1r en osteoblastos maduros [62,63]. Además, estas CMMOs mostraron una falta de respuesta a la PTHrP in vitro, indicando que el IGF-I es esencial para la acción de la PTHrP sobre estas células osteoprogenitoras.

Estos hallazgos, en conjunto, demuestran que la PTHrP, predominantemente a través de su dominio N-terminal, es capaz de modular la vía de Wnt canónica en relación a sus acciones osteogénicas en situación diabética. Además, un sistema funcional de IGF es necesario para al menos parte de las acciones osteogénicas de la PTHrP (1-36) y de la osteostatina en el esqueleto murino.

Declaración de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Dirección para correspondencia:
Pedro Esbrit
Laboratorio de Metabolismo Mineral y Óseo
IIS-Fundación Jiménez Díaz
Avda. Reyes Católicos, 2
28040 Madrid (España)
Correo electrónico: pesbrit@fjd.es

Fecha de recepción: 01/05/2014 ]]> Fecha de aceptación: 15/07/2014